Pectinas

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Pectinas

  1. 1. Annals of Microbiology September 2012, Volume 62,Issue 3, pp 1199-1205Production and characterization of polygalacturonase from thermophilicThermoascus aurantiacus on submerged fermentation Eduardo da Silva Martins, Rodrigo Simões Ribeiro Leite,  Roberto da Silva, Eleni Gomes Produção e caracterização de poligalacturonase a partir do fungo termófilo Thermoascus aurantiacus em fermentação submersa Apresentação: Mauren Silveira
  2. 2. OBJETIVOAVALIAR ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA ENZIMA TERMOESTÁVEL POLIGALACTURONASE PRODUZIDA PELO FUNGO THERMOASCUS AURANTIACUS A PARTIR DE MEIOS DE RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS
  3. 3. Polímeros lineares compostos de resíduos de ácido 1,4 β-d-galacturônico esterificado, unidos mediante ligações glicosídicas do tipo α 1-4
  4. 4. PECTINA• Protopectina: insolúvel em água e tem cátions divalentes. Frutas imaturas.•As exo-poligalacturonases Pectina: solúvel em água, formamida e glicerol. 75% dos grupos carboxílicos são catalisam a hidrólise das metilados. Ác. Pectínico: terminais α1-4 da• ligações ác. Poligalacturônico com alta % de metoxila. Forma gel com açúcar, ácidos e cadeia de ác. íons metálicos.• Ác.poliGalacturônico por sem Péctico: ác. Poligalacturônico coloidal, metoxila. hidrólise
  5. 5. À MEDIDA EM QUE OS SUBSTRATOS SÃO INTERESSE INDUSTRIALHIDROLISADOS PELAS EXO-PG OBSERVA- SE UM CONSIDERÁVEL AUMENTO DA CONCENTRAÇÃO DE AÇÚCARES CLARIFICAÇÃOREDUTORES CAUSADA PELA LIBERAÇÃODE MONÔMEROS DE ÁC. GALACTURÔNICO DIMINUIÇÃO DA VISCOSIDADE E CONSEQUENTE DECRÉSCIMO DA VISCOSIDADE DASFRIO E A QUENTE EXTRAÇÃO DE ÓLEOS A SOLUÇÕES. AROMATIZAÇÃO MODIFICAÇÃO DA INTENSIDADE DA COR
  6. 6. Thermoascus aurantiacus CBMI756Ascomycota; Eurotiomycetes; Eurotiales; Trichocomaceae; ThermoascusCrescimento de hifas: 45-52,5°CFormação de ascósporos: 47.5-60°C CELOLÍTICA: CELOBIOHIDROLASE, ENDOGLUCANASE E β- GLUCOSIDASE DEGRADAÇÃO DA HEMICELULOSE: ALPHA-D-GLUCURONIDASE, XILANASE, β-XILOSIDASE, β-MANNOSIDASE E ARABINOFURANOSIDASE. DEGRADAÇÃO DA PECTINA: HIDRÓLISE:PECTINA LIASE, POLIGALACTURONASE, AMILASE E α-GLUCOSIDASE.
  7. 7. TERMOESTABILIDADE• QUANTO À MEMBRANA• Bacteria e Eukarya : Bicamada Lipídica de ác. Graxos saturados gerando hidrofobia• Archaea: Monocamada Lipídica: Glicerol-Éter-Hidrocarboneto(5 C Isopreno) > 100°C• QUANTO AO DNA• Bacteria e Eukarya : Purina (Adenina)-Protege RNA Citosina Timina-Estabilidade no pareamento Codon-Anticodon• Archaea: 2,3difosfoglicerato cíclico de potássio-Impede despurinação DNA Girase Reversa (DNA topoisomerase)-Superenovelamento Positivo Proteína Sac7d –sulco menor do DNA- aumenta temperatura de desnaturaturação em 40°C Histonas de Archaea-Compacta o DNA em dupla-fita,mesmo em temperatura elevada
  8. 8. METODOLOGIACOMPARAR ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA ENZIMA PRODUZIDA EM MEIOS SINTÉTICOS COM PECTINA SINTÉTICA » KHANNA » VOGEL » CZAPEC » SREM RELAÇÃO A ENZIMA PRODUZIDA EM MEIOS DE RESÍDUOS AGROINDUSTRIAS CONTENDO PECTINA NATURAL » CASCA DE LARANJA » CASCA DE MARACUJÁ » FARELO DE SOJA » ÁGUA AMARELA
  9. 9. 25 ml de meio + 2.0 ml de micélio (0,6mg de micélio/ml de meio) MÉTODO ATIVIDADE ENZIMÁTICA MEIOS SINTÉTICOS X PRODUÇÃO 5.0 com NaOH Solução tampão acetato 0,4 ml (0.2 M) pH DA ENZIMA 1% de pectina comercial esterificada (26 DE Sigma) + • CZAPECK (Sais +enzima retirada da amostra 0,1 ml da Amido + Sucrose) 8 INCUBAR agitação 110min dias com 60°C por 10 RPM • KHANNAAmostras coletadas Amido) horas (Muitos sais + a cada 24 TESTES • SR (Poucos Sais + Peptonaa+10000 g por 10 min a 10°C Filtração a vácuo centrifugado Amido) DNS para determinar quantidade de açúcares redutores do ácido • VOGEL (Poucos sais +Cada amostra + Glicina) Triptona D-galacturônico Atividade enzimáticaUMA UNIDADE DE ATIVIDADE DEde biomassa Produção PG CORRESPONDE A QUANTIDADE • PECTINA LIBEROU MICRO-MOL DE AÇÚCAR REDUTOR DE DE ENZIMA QUECÍTRICA1(BRASPECTINA) ConcentraçãoDE SOLUÇÃO POR MINUTO ÁCIDO POR ml de açúcares redutores pH
  10. 10. CZAPEC KHANNA0.5 U/ml 1.3 U/ml SR VOGEL 2.0 U/ml 1.9 U/ml
  11. 11. MEIO SR
  12. 12. MEIOS DE RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS A 2%• Casca de Laranja• Casca de Maracujá• Farelo de Soja• Água Amarela
  13. 13. 25 ml de meio + 2.0 ml de micélio (0,6mg de micélio/ml de meio) 8 dias com agitação 110 RPM Amostras coletadas a cada 24 horas Filtração a vácuo centrifugado a 10000 g por 10 min a 10°C Cada amostra Atividade enzimática Produção de biomassa Concentração de açúcares redutores pH
  14. 14. Casca da Laranja Casca de MaracujáFarelo de Soja Água Amarela
  15. 15. MÉTODO 4X2 NO MEIO ÁGUA AMARELA 4 pH • 4.5 • 5.0 • 5.5 • 6.02 TEMPERATURAS DETERMINADAS • 45°C • 50°C
  16. 16. TEMPERATURA E pH INICIAIS PARA PRODUÇÃO DE PG EM ÁGUA AMARELA 45°C 50°C
  17. 17. DISCUSSÃO DOS RESULTADOS
  18. 18. TERMOESTABILIDADE DINÂMICA/CINÉTICA• Tm 50% das enzimas desdobradas Temperatura ótima• T1/2 meia vida das enzimas a uma Termoestabilidade determinada temperaturaProteínas desnaturadas: desaminação da Asparagina (ASN) e da Glutamina (GLN) ou quebra da ligação peptídica
  19. 19. ATIVIDADE ENZIMÁTICA/DINÂMICA • pH ótimo a 55°C: 5.5 • Temperatura ótima: 60-65°C Para determinar a temperatura ótima da enzima, foram feitosexperimentos incubando o extrato enzimático junto ao substrato, emdiferentes temperaturas, durante 10 minutos, tempo após o qual foideterminada a atividade enzimática.
  20. 20. ATIVIDADE ENZIMÁTICA MESOFÍLICOS/TERMOFÍLICOSTemperatura ótima de atividade PG de fungos mesofílicos 50°C Lentinus edodes 55°C Moniliella sp SB9 40°C Penicillium sp EGC5Temperatura ótima de atividade PG de fungos termofílicos 70°C Thermomyces lanuginosus 60°C Thermomucor indicae-seudaticae N31
  21. 21. CARACTERIZAÇÃO ENZIMÁTICA/CINÉTICAPara determinar a estabilidade do pH, incubou-se a enzima sem substrato a 55°C em diferentes tampões: Enzima brutaAcetato de sódio (pH 3.0-5.5)Fosfato Citrato (pH 6.0-7.0)Tris-HCl (pH 7.5-8.5)Glicina-NaOH (pH 9.0-11.0) 13% 6%depois inseriu-se em substrato a 25°C - 24 horas, tempo após o qual foi feito o teste DNS.Para determinar a termoestabilidade, foram feitosexperimentos incubando o extrato enzimático SEM substrato,em diferentes temperaturas, DURANTE 1 HORA. Após 1hora, dosou-se a atividade enzimática, incubando no 91% Enzima brutasubstrato, por 10 minutos, o extrato enzimático que ficou 60%exposto por 1 hora nas diferentes temperaturas.
  22. 22. CONCLUSÃO A atividade enzimática de PG produzida porT. aurantiacus na Água Amarela (3.2 U/ml) foi melhor que a produzida no meio sintético SR (2.0 U/ml) suportando uma temperatura de até 55°C por 1 hora e temperatura ótima no substrato de até 60°C por 10 minutos.
  23. 23. CONSIDERAÇÕES• Aspergillus niger em cascaA CLARIFICAÇÃO de limão por FS é capaz de produzir 26.17 U/ml de ENZIMÁTICA DE POLIGALACTURONASE, porém, a DE SUCO uma temperatura de 30°C. LARANJA PODE• Sugere-se a pesquisa de isolamento do gene A SER REALIZADA responsável pela expressão 15°C DURANTE 12 da poligalacturonase, sua amplificação e HORAS clonagem no vetor de expressão de OU A Aspergillus niger, esperando obter 1 HORA 54°C POR enzima termoestável em maior quantidade.

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