1. Annals of Microbiology
September 2012, Volume 62,Issue 3, pp 1199-1205
Production and characterization of polygalacturonase from
thermophilicThermoascus aurantiacus on submerged
fermentation
Eduardo da Silva Martins, Rodrigo Simões Ribeiro Leite,
Roberto da Silva, Eleni Gomes
Produção e caracterização de poligalacturonase a
partir do fungo termófilo Thermoascus aurantiacus
em fermentação submersa
Apresentação: Mauren Silveira
2. OBJETIVO
AVALIAR ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA
ENZIMA TERMOESTÁVEL
POLIGALACTURONASE PRODUZIDA
PELO FUNGO
THERMOASCUS AURANTIACUS
A PARTIR DE MEIOS DE RESÍDUOS
AGROINDUSTRIAIS
3. Polímeros lineares compostos de resíduos de ácido 1,4 β-d-galacturônico
esterificado, unidos mediante ligações glicosídicas do tipo α 1-4
4. PECTINA
• Protopectina: insolúvel em água e tem cátions
divalentes. Frutas imaturas.
•As exo-poligalacturonases
Pectina: solúvel em água, formamida e
glicerol. 75% dos grupos carboxílicos são
catalisam a hidrólise das
metilados.
Ác. Pectínico: terminais α1-4 da
• ligações ác. Poligalacturônico com alta %
de metoxila. Forma gel com açúcar, ácidos e
cadeia de ác.
íons metálicos.
• Ác.poliGalacturônico por sem
Péctico: ác. Poligalacturônico coloidal,
metoxila. hidrólise
5. À MEDIDA EM QUE OS SUBSTRATOS SÃO
INTERESSE INDUSTRIAL
HIDROLISADOS PELAS EXO-PG OBSERVA-
SE UM CONSIDERÁVEL AUMENTO DA
CONCENTRAÇÃO DE AÇÚCARES
CLARIFICAÇÃO
REDUTORES CAUSADA PELA LIBERAÇÃO
DE MONÔMEROS DE ÁC. GALACTURÔNICO
DIMINUIÇÃO DA VISCOSIDADE
E CONSEQUENTE DECRÉSCIMO DA
VISCOSIDADE DASFRIO E A QUENTE
EXTRAÇÃO DE ÓLEOS A SOLUÇÕES.
AROMATIZAÇÃO
MODIFICAÇÃO DA INTENSIDADE DA COR
6.
7. Thermoascus aurantiacus
CBMI756
Ascomycota; Eurotiomycetes; Eurotiales; Trichocomaceae; Thermoascus
Crescimento de hifas:
45-52,5°C
Formação de ascósporos:
47.5-60°C
CELOLÍTICA: CELOBIOHIDROLASE, ENDOGLUCANASE E β-
GLUCOSIDASE DEGRADAÇÃO DA HEMICELULOSE: ALPHA-D-
GLUCURONIDASE, XILANASE, β-XILOSIDASE, β-MANNOSIDASE E
ARABINOFURANOSIDASE.
DEGRADAÇÃO DA PECTINA: HIDRÓLISE:PECTINA LIASE,
POLIGALACTURONASE,
AMILASE E α-GLUCOSIDASE.
8. TERMOESTABILIDADE
• QUANTO À MEMBRANA
• Bacteria e Eukarya : Bicamada Lipídica de ác. Graxos saturados gerando
hidrofobia
• Archaea: Monocamada Lipídica: Glicerol-Éter-Hidrocarboneto(5 C Isopreno)
> 100°C
• QUANTO AO DNA
• Bacteria e Eukarya : Purina (Adenina)-Protege RNA
Citosina Timina-Estabilidade no pareamento
Codon-Anticodon
• Archaea: 2,3difosfoglicerato cíclico de potássio-Impede despurinação
DNA Girase Reversa (DNA topoisomerase)-Superenovelamento
Positivo
Proteína Sac7d –sulco menor do DNA- aumenta temperatura de
desnaturaturação em 40°C
Histonas de Archaea-Compacta o DNA em dupla-fita,mesmo em
temperatura elevada
9. METODOLOGIA
COMPARAR ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA ENZIMA
PRODUZIDA EM MEIOS SINTÉTICOS COM
PECTINA SINTÉTICA
» KHANNA
» VOGEL
» CZAPEC
» SR
EM RELAÇÃO A ENZIMA PRODUZIDA EM MEIOS
DE RESÍDUOS AGROINDUSTRIAS CONTENDO
PECTINA NATURAL
» CASCA DE LARANJA
» CASCA DE MARACUJÁ
» FARELO DE SOJA
» ÁGUA AMARELA
10. 25 ml de meio + 2.0 ml de micélio (0,6mg de micélio/ml de meio)
MÉTODO
ATIVIDADE ENZIMÁTICA
MEIOS SINTÉTICOS X PRODUÇÃO 5.0 com NaOH
Solução tampão acetato 0,4 ml (0.2 M) pH DA ENZIMA
1% de pectina comercial esterificada (26 DE Sigma)
+
• CZAPECK (Sais +enzima retirada da amostra
0,1 ml da Amido + Sucrose)
8 INCUBAR agitação 110min
dias com 60°C por 10 RPM
• KHANNAAmostras coletadas Amido) horas
(Muitos sais + a cada 24
TESTES
• SR (Poucos Sais + Peptonaa+10000 g por 10 min a 10°C
Filtração a vácuo centrifugado Amido)
DNS para determinar quantidade de açúcares redutores do ácido
• VOGEL (Poucos sais +Cada amostra + Glicina)
Triptona
D-galacturônico
Atividade enzimática
UMA UNIDADE DE ATIVIDADE DEde biomassa
Produção PG CORRESPONDE A QUANTIDADE
• PECTINA LIBEROU MICRO-MOL DE AÇÚCAR REDUTOR DE
DE ENZIMA QUECÍTRICA1(BRASPECTINA)
ConcentraçãoDE SOLUÇÃO POR MINUTO
ÁCIDO POR ml
de açúcares redutores
pH
13. MEIOS DE RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS
A 2%
• Casca de Laranja
• Casca de Maracujá
• Farelo de Soja
• Água Amarela
14. 25 ml de meio + 2.0 ml de micélio (0,6mg de micélio/ml de meio)
8 dias com agitação 110 RPM
Amostras coletadas a cada 24 horas
Filtração a vácuo centrifugado a 10000 g por 10 min a 10°C
Cada amostra
Atividade enzimática
Produção de biomassa
Concentração de açúcares redutores
pH
19. TERMOESTABILIDADE
DINÂMICA/CINÉTICA
• Tm 50% das enzimas desdobradas Temperatura ótima
• T1/2 meia vida das enzimas a uma Termoestabilidade
determinada temperatura
Proteínas desnaturadas: desaminação da
Asparagina (ASN) e da Glutamina (GLN) ou
quebra da ligação peptídica
20. ATIVIDADE ENZIMÁTICA/DINÂMICA
• pH ótimo a 55°C: 5.5
• Temperatura ótima: 60-65°C
Para determinar a temperatura ótima da enzima, foram feitos
experimentos incubando o extrato enzimático junto ao substrato, em
diferentes temperaturas, durante 10 minutos, tempo após o qual foi
determinada a atividade enzimática.
21. ATIVIDADE ENZIMÁTICA
MESOFÍLICOS/TERMOFÍLICOS
Temperatura ótima de atividade PG de fungos mesofílicos
50°C
Lentinus edodes
55°C
Moniliella sp SB9
40°C
Penicillium sp EGC5
Temperatura ótima de atividade PG de fungos termofílicos
70°C
Thermomyces lanuginosus
60°C
Thermomucor indicae-seudaticae N31
22. CARACTERIZAÇÃO ENZIMÁTICA/CINÉTICA
Para determinar a estabilidade do pH, incubou-se a enzima
sem substrato a 55°C em diferentes tampões:
Enzima bruta
Acetato de sódio (pH 3.0-5.5)
Fosfato Citrato (pH 6.0-7.0)
Tris-HCl (pH 7.5-8.5)
Glicina-NaOH (pH 9.0-11.0) 13%
6%
depois inseriu-se em substrato a 25°C - 24 horas, tempo após
o qual foi feito o teste DNS.
Para determinar a termoestabilidade, foram feitos
experimentos incubando o extrato enzimático SEM substrato,
em diferentes temperaturas, DURANTE 1 HORA. Após 1
hora, dosou-se a atividade enzimática, incubando no
91% Enzima bruta
substrato, por 10 minutos, o extrato enzimático que ficou
60%
exposto por 1 hora nas diferentes temperaturas.
23. CONCLUSÃO
A atividade enzimática de PG produzida por
T. aurantiacus na Água Amarela (3.2 U/ml) foi
melhor que a produzida no meio sintético
SR (2.0 U/ml) suportando uma
temperatura de até 55°C por 1 hora e
temperatura ótima no substrato de até
60°C por 10 minutos.
24. CONSIDERAÇÕES
• Aspergillus niger em cascaA CLARIFICAÇÃO
de limão por FS é
capaz de produzir 26.17 U/ml de
ENZIMÁTICA DE
POLIGALACTURONASE, porém, a DE SUCO uma
temperatura de 30°C. LARANJA PODE
• Sugere-se a pesquisa de isolamento do gene A
SER REALIZADA
responsável pela expressão
15°C DURANTE 12 da
poligalacturonase, sua amplificação e
HORAS
clonagem no vetor de expressão de OU A
Aspergillus niger, esperando obter 1 HORA
54°C POR enzima
termoestável em maior quantidade.