1. O relatório descreve o cultivo da espécie Eisenia andrei e sua utilização em ensaios ecotoxicológicos para avaliar a sensibilidade dessa espécie a solos contaminados com petróleo. 2. Foram preparados cultivos de E. andrei e realizados ensaios de fuga com espécimes expostos a diferentes amostras de solo, incluindo uma amostra contaminada. 3. Os resultados iniciais indicaram alta toxicidade das amostras de solo contaminadas com petróleo nas altas concentrações testadas.

1. UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA - UFBA
INSTITUTO DE BIOLOGIA
DEPARTAMENTO DE BOTÂNICA
ALINE SOARES
SILVANA WENCESLAU
RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA III DE ECOTOXICOLOGIA E
BIOMONITORAMENTO
CULTIVO DE Fulsomia candida E OBTENÇÃO DE ORGANISMOS-TESTE
PARA ENSAIOS DE ECOTOXICIDADE
Salvador
2013

2. 2
ALINE SOARES
SILVANA WENCESLAU
RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA- II DE ECOTOXICOLOGIA E
BIOMONITORAMENTO
CULTIVO DE Elsenia Andrei E OBTENÇÃO DE ORGANISMOS-TESTE
PARA ENSAIOS DE ECOTOXICIDADE
.
Salvador
2013
Relatório apresentado
como exigência parcial de
Avaliação do Componente
Curricular Ecotoxicologia e
Biomonitoramento do Curso
de Ciências Biológicas da
Universidade Federal da
Bahia – UFBA –
Departamento de Botânica,
com orientação da
Professora Drª Júlia C.
Niemeyer.

3. 3
SUMÁRIO
1 . INTRODUÇÃO GERAL.................................................................................4
2. OBJETIVO.....................................................................................................4
3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA.....................................................................5
4. MATERIAIS E PROCEDIMENTOS.................................................................6
4.1 PREPARAÇÃO DO MEIO PARA CULTIVO EISENIA .....................6
4.2 SEPARAÇÃO E CONTAGEM DAS eusenia andrei ........................7
4.3 REALIZAÇÃO DOS ENSAIOS TESTE DE FUGA.............................8
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................11
6. REFERÊNCIAS.............................................................................................13

4. 4
1. INTRODUÇÃO GERAL
A toxicologia é o estudo dos efeitos nocivos dos agentes químicos ou
físicos sobre os organismos vivos. As substâncias químicas de interesse
incluem tanto os produtos químicos sintéticos quanto aqueles que existem
naturalmente no ambiente. Na toxicologia, os efeitos são determinados, em
geral, pela injeção ou administração oral de substâncias de interesse em
animais, observando-se como a saúde desses é afetada, através da relação
dose resposta (Baird, 2002).
A avaliação ambiental da integridade ou grau de degradação de
ecossistemas terrestres e aquáticos, cujas variações físicas são acentuadas,
exige que fatores mais estáveis sejam considerados como indicadores de
avaliação, como por exemplo, fatores biológicos. Estes fatores podem indicar
melhor o equilíbrio do ambiente através de índices bióticos, derivados da
observação de espécies bioindicadoras (CETESB, 2005).
Um dos métodos mais empregados para a avaliação dos efeitos
adversos de agentes químicos sobre a biota terrestre e aquática são os testes
de toxicidade. Neles são utilizados organismos-teste terrestres, de águas
continentais, estuarinas e marinhas que ficam expostos aos contaminantes sob
condições controladas (CETESB, 2005).
2. OBJETIVO
- Preparar o meio para montagem dos cultivos de Eisenia Andrei;
- Montar uma caixa de cultivo de E. Andrei a partir de jovens;
- Manter de forma continuada em cultivo E. Andrei;
- Identificar os organismos que podem ser utilizados na realização dos ensaios.
- Avaliar a sensibilidade das espécies Eisenia andrei de testes
ecotoxicológicos, como bioindicadoras de solos contaminados com Petróleo.

5. 5
3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
A ecotoxicologia pressupõe o uso de testes de toxicidade com
organismos, também chamados bioensaios que são testes feitos em laboratório
que determinam o grau ou o efeito biológico de uma substância desconhecida
ou de uma substância-teste. Os bioensaios diferem principalmente quanto ao
tempo de exposição do organismo-teste ao agente ou substância a ser testado.
Portanto, os bioensaios podem ser agudo ou crônicos.
Teste de toxicidade aguda são estudos experimentais feitos com
organismos-teste que determinam se um efeito adverso observado ocorre em
um curto período de tempo (em geral até 14 dias) após administração de uma
única dose da substância testada ou após múltiplas dosagem administradas
em até 24 horas. Já nos testes de toxicidade crônica, os organismos-teste são
observados durante uma grande parte do seu tempo de vida, quando acontece
a exposição ao agente-teste; os efeitos crônicos persistem por um longo
período de tempo, e podem ser evidentes imediatamente após a exposição ou
não (DUFFUS, 1993).
Em regiões de clima temperado como Europa e América do Norte são
bem avançados o desenvolvimento, a padronização e a utilização de ensaios
ecotoxicológicos para análise de risco de locais contaminados, com utilização
de organismos de solo, como as minhocas, como bioindicadores. No entanto,
poucos são os estudos já conduzidos para avaliar impactos de agrotóxicos em
ecossistemas tropicais e, quando existentes, a maioria dos dados é gerada a
partir de espécies exóticas em regiões tropicais, ocasionando uma
extrapolação possivelmente tendenciosa dos resultados, pelo fato de usarem
metodologias baseadas em protocolos para regiões de clima temperado,
mascarando a situação real para regiões tropicais, e podendo levar a
conclusões equivocadas.
Os testes padronizados, como os da ISO, geralmente preconizam a
utilização de espécies nativas de clima temperado, como Eisenia fetida e E.

6. 6
andrei, as quais podem ser pouco relevantes para estudos ecotoxicológicos em
regiões tropicais, já que não são espécies nativas da região, e pelo fato de
viverem na serapilheira, ou seja, alimentam-se próximo à camada superficial do
solo.
Pontoscolex corethrurus é uma espécie nativa de regiões tropicais e de
ampla distribuição, comumente encontrada em solos antropogênicos (Römbke
& Verhaagh, 1992), apresenta maior relevância ecológica que as espécies
padrão por viver abaixo das camadas superficiais do solo, e por ingerir solo,
enquanto que E. andrei se alimenta mais de resíduo vegetal, sendo, portanto,
uma alternativa para testes ecotoxicológicos em solos tropicais. Ao escavar e
ingerir solo ou serapilheira contaminados, as minhocas entram em contato com
poluentes que podem estar na solução do solo ou adsorvidos nas partículas
minerais e na matéria orgânica. Elas podem ainda absorver os contaminantes
da solução do solo por meio de contato direto e passagem pela cutícula. Assim
as minhocas podem se intoxicar, morrer ou sobreviver, incorporar ou até
bioacumular esses poluentes em seus tecidos (Visanathan, 1994; Cortet et al.,
1999; Burger, 2006). Isso pode ser um perigo para seus predadores,
influenciando a cadeia trófica.
4. MATERIAIS E PROCEDIMENTOS
4.1 PREPARAÇÃO DO MEIO PARA CULTIVO Eisenia andrei
- Pó de coco;
- ½ kg de estrume de cavalo desfomado (origem Escola de Veterinária da UFBA);
-700 ml de água Destilada.
Foi colocada em uma caixa plástica uma camada de cada material
citado – uma camada de pó de coco outra camada de estrume de cavalo.
Misturou-se bem e foi acrescida água destilada. Após preparação do solo
artificial foi colocado as minhocas (Eusenia Andrei) que anteriormente foram
contadas e separadas das juvenis e colocadas nesta caixa nova com o solo
artificial preparado em laboratório.

7. 7
Imagens da Preparação do Solo artificial
Figura 1a Figura 1b
Figura 1c Figura 1d
4.2 SEPARAÇÃO E CONTAGEM DAS MINHOCAS (Eusenia andrei)
ADULTAS E JUVENIS
Foram selecionadas as minhocas (Eusenia Andrei) adultas das juvenis.
Após a contagem e separação colocou-se as minhocas adultas nas caixas
novas e manteve-as a 25Cº durante 14 dias.
Caixa com as minhocas a serem selecionadas
Figura 2a Figura 2b
Imagens da seleção das minhocas juvenis e adultas

8. 8
Figura 3a Figura 3b
Figura 3c Figura 3d
Figura 3e Figura 3f
4.3 REALIZAÇÃO DOS ENSAIOS TESTE DE FUGA
Foi recebida amostra de solos contaminado por petróleo, mas não se
sabe detalhadamente da quantidade deste contaminante em cada amostras
recebida.
Foi preparada para a realização do teste de fuga as seguintes amostras:

9. 9
 Amostra BIO – 01 - Controle
Pesou-se 1815 g de Solo Controle e acrescentou-se água destilada. No solo
controle não contém nenhum contaminante.
 Amostra BIO – 02
Pesou-se 1845 g de solo da amostra e foi acrescido 180 ml de água destilada.
Não foi utilizado a mesma caixa do controle para não contaminar.
 Amostra BIO – 05
Pesou-se 1830 g de solo da amostra e foi acrescido 225 ml de água destilada
Foi realizado a seguinte combinação de amostras (Réplicas):
 Controle X Controle
 Controle X BIO -02
 Controle X BIO 05
 BIO 02 X BIO 05
- Foram selecionadas da caixa acondicionada anteriormente por 14 dias as
minhocas cliteladas. Separou-se 10 minhocas E. Andrei para cada pote
separadas e lavadas contou-se 10 minhocas e colocou-se em cada pote das
repicas citadas anteriormente.
Separação das minhocas
Figura 4a Figura b
Separação e limpeza das 10 minhocas em cada pote

10. 10
Figura 5a Figura 5b
Teste de Fuga - Comportamental - O teste foi realizado em caixa plástica
transparente preenchidas com solo preparado até a altura de 4 a 5 cm
(aproximadamente 500 g de peso seco). Foram feitas 24 caixas.
Adição das minhocas nas caixas com as réplicas
Figura 6a Figura 6b
Foram adicionados 10 animais adultos para o teste com E. Andrei. As
caixas foram fechadas e armazenadas no escuro, sob temperatura ambiente
de 20 ± 4 ºC. Os animais não foram alimentados durante os testes.

11. 11
Armazenamento das caixas
Figura 7a Figura 7b
Após o período de 48 horas foram verificados o número de animais em
cada um dos tratamentos, determinando, desta forma, o seu comportamento de
fuga.
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os testes de toxicidade com as amostras de surfactantes (petróleo)
indicaram que apresentaram alta toxicidade em altas concentrações.
As minhocas estão associadas a um solo saudável e a sua ausência
indica a má qualidade do solo (DOUBE & SCHMIDT, 1997; EDWARDS &
SHIPITALO, 1998; PARMELEE et al. 1998). Algumas espécies de minhocas
são utilizadas na avaliação do risco ambiental como bom bioindicadores de
toxicidade (CALLAHAN et al., 1998;DORN & SALANITRO, 2000). Segundo
DORN et al. (1998) um parâmetro importante para o teste de mortalidade de
minhocas é a determinação da concentração letal para 50% da população
(CL50) após a exposição em diferentes concentrações de contaminantes.
Foi possível observar que houve 100% de mortalidade nas
concentrações.
Através dos testes de toxicidade pôde-se verificar que as minhocas são
os organismos mais sensíveis à adição dos surfactantes.

12. 12
Como resultado observou-se que todos os organismos vivos
encontrados nas réplicas de BIO2 X BIO5 estavam com comportamento
letárgico o solo estava contaminado com petróleo, houve perda de habitat as
minhocas.
Como encontramos efeito agudo sobre a sobrevivência, os resultados do
ensaio de fuga são limitados neste caso, não permitindo maiores
interpretações, já que são desenvolvidos para concentrações subletais.
O programa Graph Pad foi utilizado para realizar a avaliação do ensaio.
O que demonstrou que o resultado foi extremamente significativo.

13. 13
6. REFERÊNCIAS
Ciência Rural, Santa Maria, v.43, n.6, p.992-998, jun, 2013 - Metais pesados,
agrotóxicos e combustíveis: efeito na população de colêmbolos no solo
EMBRAPA – Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária ISSN – 1517-8498
Dez, 2010 – Importância de estudo ecotoxicológico com invertebrados do
solo
http://www.ecocell.com.br/Manual_de_Toxicidade.pdf
acesso em 12/07/2013
www.eq.ufrj.br/prh13/download/?prh13-surfactantes-na...de-solo...pdf
acesso em 12/07/2013
CARVALHO, Paula Geandra, de; Biorremediação: avaliação da adição de
surfactantes em diferentes tempos de contaminação de um solo contaminado
com hidrocarbonetos de petróleo. 2006.
DOUBLE, B. M. and SCHMIDTH, O. Can the abundance or activity of soil
macrofauna be used to indicate the biological health of soils? In Biological
Indicators of Soil Health. Eds. CAB International, New York. pp 265–295. 1997
CALLAHAN, C. A. Earthworms as ecotoxicological assessment tools. In:
EDWARDS, C.A.; NEUHAUSER, E.F. Earthworms in waste and environmental
management, spb academic, The Hague, pp. 295-301. 1998.
DORN, P.H & SALANITRO, J. Temporal ecology assessment of oil
contaminated soil before and after bioremediation. Chemosphere, 40, pp. 419-
426. 2000.