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Ecotoxicologia

Bióloga M.Sc. Lucineide Maranho
Sociedade moderna

Poluição ambiental

Saúde dos ecossistemas
 Ecotoxicologia → Pesquisador francês René Truhaut em 1969
 Eco do grego oîkos = casa, domicílio, habitat: ecologia
 Toxicologia (ciência dos agentes tóxicos, venenos e da intoxicação)
 Primeiros testes de toxicidade com despejos industriais → 1863 –
1917
 Testes de toxicidade aguda com organismos aquáticos → 1930
 Rachel Carson – 1962 o livro Silent Spring – primeira advertência
sobre os organoclorados
 No Brasil – 1975 → Programa Internacional de Padronização de
testes de toxicidade aguda com peixes
Toxicologia
Ciência que estuda os efeitos nocivos decorrentes da interação de
substâncias químicas e de fenômenos físicos com o organismo.

Ecotoxicologia
Estuda os efeitos adversos dos agentes tóxicos causados por
contaminantes naturais ou sintéticos para o ambiente, através de ensaios
com matéria viva.
Monitoramento com testes de toxicidade
Finalidade da ecotoxicologia
Saber

em

qual

grandeza,

as

substâncias

químicas, isoladas ou em forma de misturas, são
nocivas, como e onde manifestam seus efeitos.

Knie, J. L. W. ; Lopes, E. W. B., 2004
Perigo
A ecotoxicologia alerta para os danos
nos

diversos

químicas
sugere

que
a

ecossistemas
representam

aplicação

por
risco

de medidas

ocorridos
substâncias
e,

assim,

preventivas

para impactos futuros antes que ocorram graves
danos ao ambiente natural.
Abordagem ecotoxicológica

Atividades humanas

Processos naturais

Fonte de contaminação

Ecossistemas

Conseqüências ecotoxicológicas
Destino dos poluentes nos ecossistemas
Destino dos poluentes
Ar

Poluição

Água

Água receptor final dos poluentes

Solo /
sedimento
Destino dos poluentes nos ecossistemas
As propriedades físico-químicas dos xenobióticos determinam o
transporte entre as diferentes fases do meio.
Transporte: processos físicos abióticos
fatores bióticos
Vias de transferência entre os meios
Ar

Água

Solo

Biota
AZEVEDO, F.A.; CHASIN, A.A.M. 2003

Sedimento
Destino dos poluentes nos ecossistemas
Agente Tóxico (xenobiótico, substância ou toxicante)
Qualquer substância química que, interagindo com um organismo vivo, é
capaz de produzir um efeito tóxico seja este uma alteração funcional
ou a morte.
A movimentação dos contaminantes nos meios
é determinada
por processos
físicos
relacionados às propriedades
químicas
dos compartimentos ambientais e dos
contaminantes.
Destino dos poluentes nos ecossistemas
Mecanismos de destino e transporte
Ar
Fotólises
Reações com OH-

Solo
Fotólises
Hidrólises
Biodegradação
Oxidação/redução

Biota
Bioacumulação
Metabolismo
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Água
Hidrólises
Fotólises
Oxidação/redução
Biodegradação

Sedimento
Hidrólises
Degradação microbiana
Oxidação/redução
Testes de toxicidade
Método utilizado para detectar e avaliar a capacidade de um agente
tóxico provocar efeito nocivo utilizando representantes bioindicadores
dos grandes grupos de uma cadeia ecológica.
Produtores

Consumidores primários

Consumidores secundários
http://www.sacsplash.org/critters/daphnia.htm
Testes de toxicidade
Toxicidade – sinais, sintomas e efeitos que causam desequilíbrio orgânico.
 Toxicidade aguda
 Toxicidade crônica
 CE50 e CL50
 CENO (Concentração de Efeito Não Observado)
 CEO (Concentração de Efeito Observado)
Testes de toxicidade - Sistema teste
Cultivo de algas

Pimephales promelas

Danio rerio

Pseodukirchneriella subcapitata
Testes de toxicidade - Sistema teste
Microcrustáceo - Daphnia magna

Abelhas – Apis mellifera

Minhocas – Eisenia foetida
Substância teste
Substância de Referência - substância utilizada para avaliação
da sensibilidade do sistema teste
Carta-Sensibilidade da cultura de Daphnia magna ao dicromato de potássio (produto Merck, Artigo
nº 1.04864.0500, pureza 99,9%) em água reconstituída M4 (06/Julho/2000 a 28/Novembro/2001)

2
1,9

+ 2s = 1,70

1,8
1,7

CE50;24h (mg/

1,6
1,5
1,4
1,3

MÉDIA = 1,22

1,2
1,1
1
0,9
0,8

2s = 0,73

0,7
0,6
0

1

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3

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5

6

7

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9

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Faixa sensibilidade: 0,9 a 1,5 mg/L (Norma NF-T 90-301, Jan/98), 0,9
a 2,0 mg/L (Norma ISO6341-1982)

12

13

14

15

Testes nº

16

17

18

19

20

21
Carta de sensibilidade
Carta- Sensibilidade da cultura de Daphnia similis ao dicromato de potássio (produto Merck, artigo
nº1.04864.0500, pureza 99%) em água reconstituída MS (01/Junho/2001 a 18/Outubro/2001)

0,9
0,8

CE50;24h (mg/

0,7

+2S = 0,61

0,6
0,5

Média = 0,45
0,4
0,3

-2S = 0,28

0,2
0,1
0
0

1

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3

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6

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11

12

13

14

15

16

17

18

19

Teste nº

20

21
Sistemas de exposição
 Sistema estático
 Sistema semi estático
Sistema de fluxo contínuo
Acumulação
Bioconcentração
Biomagnificação
Depuração
Acumulação = 0,62 x 10-8µg heptacloro/µg organismo
Depuração = 0,25 x 10-8µg heptacloro/µg organismo

Acumulação = 0,12 x 10-5µg heptacloro/µg organismo

Acumulação = 0,10 x 10-5µg heptacloro/µg organismo
Fatores que influem na Toxicidade ligados ao agente
químico
 propriedade físico-química (solubilidade, tamanho molecular, estado
físico, etc.);
 impurezas e contaminantes;
 fatores envolvidos na formulação (veículo, adjuvantes).
Fatores que influem na Toxicidade relacionados
com o organismo
 espécie,
 linhagem,
 fatores genéticos;
 fatores imunológicos,
 estado nutricional,
 dieta;
 sexo,
 estado hormonal,
 idade,
 peso corpóreo;
 estado emocional,
 estado patológico.
Fatores que influem na Toxicidade relacionados
com a exposição
 via de introdução;
 dose ou concentração;
 ambiente;
 temperatura,
 pressão;
 radiações;
 outros (luz, umidade, etc.).
Relevância para o
meio receptor
Representativa do nível
trófico a proteger

Métodos fiáveis
de cultura e teste

Sensível a possíveis
contaminantes

Critérios agudos e
crônicos de avaliação

Espécie “IDEAL”

Distribuição numa vasta
área geográfica

Abundante e
facilmente acessível
Fácil manuseio
e cultura
Qual a espécie mais sensível?
Um ensaio detecta todos os efeitos?
Não existe
Bateria de ensaios
Diferentes níveis tróficos
Diferentes diferentes critérios de toxicidade

Metodologias para situações específicas
Teste crônico com ovos e larvas de peixes

Vista geral do teste

Ovos

Larvas
Teste agudo com minhocas

Solo artificial

Solo artificial + solução teste

Ovos
Organismos em exposição

Incubação
Teste agudo, por contato, com abelhas

Aplicação da substância-teste

Teste agudo, via oral,
com abelhas

Substância-teste
Vista geral do teste
fornecida como alimento
Teste agudo com microcrustáceos

Cultivo

Incubação

Teste crônico com microcrustáceos

Concentrações-teste

Avaliação
Toxicidade aguda para

Danio rerio avaliação
amônia

Resolução CONAMA nº 357
Algas

↑ ou ↓ do
crescimento
pH
IET
OD
Microcrustáceos

↑ ou ↓ do crescimento
pH
IET
OD

Fábricas de Curtumes, fábricas de reciclagem de papel, vacarias, etc
Monitoramento da qualidade do ar utilizando
liquens como bioindicadores

Monóxido de Carbono
(CO)
Dióxido de Enxofre
(SO2)
Etano, Etileno, Propano,
Butano, Acetileno,
Pentano
Dióxido de Carbono
(CO2)
www.copesul.com.br/.../cap06/pagina04.html
Éter
 menor densidade que a água
 alterações da eficácia de tratamento
das águas nas Estações de tratamento
de águas residuais

Com

base

nestes

dados

ecotoxicidade,

deve-se

entrada

éter nas águas e

de

também nos solos.

evitar

de
a
O ensaio vai detectar o grau de contaminação de uma amostra
de solo com resíduos de petróleo.
Monóxido de Carbono
(CO)
Dióxido de Enxofre
(SO2)
Etano, Etileno, Propano,
Butano, Acetileno,
Pentano
Dióxido de Carbono
(CO2)

Tradescantia pallida
contagem de micronúcleos em células mães de grãos de pólen
determinar a capacidade de substâncias causarem danos ao material genético
 freqüência elevada de micronúcleos nas análises é o indicador de que as
substâncias afetam a planta.
Exemplo de preparo de diluições-teste a partir de uma amostra ambiental

Diluição da
amostra

Fator de
diluição
(FD)

Amostra
(mL)

Água de
diluição
(mL)

Volume
final
(mL)

Conc. da
solução
teste (%)

Controle

-

-

50

50

-

1:1

1

50

-

50

100

1:2

2

25

25

50

50

1:3

3

16,67

33,33

50

33,34

1:4

4

12,50

37,50

50

25

Fator de diluição (FD)
KNIE, J. L. W., LOPES, E. W. B., 2004

Fator de toxicidade (FT)
Toxicidade aguda de efluentes industriais para Daphnias e peixes

KNIE, J. L. W., LOPES, E. W. B., 2004
Autores defendem:
Experimento ex-situ: trabalhar com um experimento de laboratório é
mais confiável, pois a temperatura, luminosidade e outros parâmetros
físico-químicos de exposição são fáceis de serem controlados e de se
estimar o efeito do xenobiótico em estudo.

Experimento in-situ: as variáveis não podem ser controladas, como
temperatura, pH, disponibilidade de alimento, e a perda de organismos.
Nestes as variantes são bem mais difíceis de serem interpretadas e o
custo é muito elevado
Monitoramento CETESB - Rio Tietê

Níveis atuais de qualidade
Ótima
Boa
Regular
Ruim
Péssima

ZAGATTO, P.A , 1999
As fases da
intoxicação
1. Fase de exposição: depende
da
via
de
introdução,
freqüência e da duração da
exposição, concentração do
xenobiótico, das propriedades
físico-químicas do agente e de
fatores
relacionados
à
suscetibilidade individual.
As fases da intoxicação
2. Fase de toxicocinética: processos desde a disponibilidade química até a
concentração do toxicante nos órgãos alvo (absorção, distribuição,
armazenamento, biotransformação e eliminação de substâncias inalteradas
e/ou metabólitos.
As fases da intoxicação
3. Fase de toxicodinâmica: mecanismos de interação entre o toxicante e
os sítios de ação do organismo. Efeitos nocivos decorrentes da ação tóxica.

Intoxicação arsênico
As fases da intoxicação
4. Fase clínica: sinais, sintomas e alterações detectáveis por provas
diagnósticas que caracterizam os efeitos deletérios ao organismo.
Fases da intoxicação
Exposição

Toxicocinética

Toxicodinâmica

Clínica

Processo de transporte:
• Absorção

Natureza da
ação

Vias de introdução • Distribuição
• Eliminação
• Biotransformação
Toxicante

Toxicidade

Disponibilidade
química

Fonte: AZEVEDO, F.A.; CHASIN, A.A.M., 2003

Biodisponibilidade

Intoxicação
Sinais e
sintomas
Principais efeitos deletérios
Interações entre os agentes tóxicos sobre
os organismos
- Efeito aditivo: soma dos efeitos de cada tóxico.
- Efeito sinérgico: efeito combinado maior que o
efeito das partes.
- Potenciação: uma substância aumenta a toxicidade
da outra.
- Antagonismo: interferência mútua ou simples
MATERIAL DE APOIO:
JONSSON, C. M. CASTRO, V. L. Bioindicadores e biomarcadores de
agroquímicos no contexto da relação saúde-ambiente – JMA - 10/10/05.
Disponível em: www.cnpma.embrapa.br. Acesso em 18 de abril de 2007.
MARANHO, L.A. Biomagnificação do Heptacloro num modelo de simulação
em condições ex-situ. 2006. 63 p. Dissertação (mestrado em Ecologia de
Agroecossistemas) – Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz,
Universidade de São Paulo, Piracicaba, 2006.
Obrigada!

lmaranho@cena.usp.br

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Ecotoxicolgia 05.10.2009 (neide)

  • 3.
  • 4.
  • 5.
  • 6.
  • 7.
  • 8.  Ecotoxicologia → Pesquisador francês René Truhaut em 1969  Eco do grego oîkos = casa, domicílio, habitat: ecologia  Toxicologia (ciência dos agentes tóxicos, venenos e da intoxicação)  Primeiros testes de toxicidade com despejos industriais → 1863 – 1917  Testes de toxicidade aguda com organismos aquáticos → 1930  Rachel Carson – 1962 o livro Silent Spring – primeira advertência sobre os organoclorados  No Brasil – 1975 → Programa Internacional de Padronização de testes de toxicidade aguda com peixes
  • 9. Toxicologia Ciência que estuda os efeitos nocivos decorrentes da interação de substâncias químicas e de fenômenos físicos com o organismo. Ecotoxicologia Estuda os efeitos adversos dos agentes tóxicos causados por contaminantes naturais ou sintéticos para o ambiente, através de ensaios com matéria viva.
  • 10. Monitoramento com testes de toxicidade
  • 11. Finalidade da ecotoxicologia Saber em qual grandeza, as substâncias químicas, isoladas ou em forma de misturas, são nocivas, como e onde manifestam seus efeitos. Knie, J. L. W. ; Lopes, E. W. B., 2004
  • 12. Perigo A ecotoxicologia alerta para os danos nos diversos químicas sugere que a ecossistemas representam aplicação por risco de medidas ocorridos substâncias e, assim, preventivas para impactos futuros antes que ocorram graves danos ao ambiente natural.
  • 13. Abordagem ecotoxicológica Atividades humanas Processos naturais Fonte de contaminação Ecossistemas Conseqüências ecotoxicológicas
  • 14. Destino dos poluentes nos ecossistemas
  • 15. Destino dos poluentes Ar Poluição Água Água receptor final dos poluentes Solo / sedimento
  • 16. Destino dos poluentes nos ecossistemas As propriedades físico-químicas dos xenobióticos determinam o transporte entre as diferentes fases do meio. Transporte: processos físicos abióticos fatores bióticos Vias de transferência entre os meios Ar Água Solo Biota AZEVEDO, F.A.; CHASIN, A.A.M. 2003 Sedimento
  • 17. Destino dos poluentes nos ecossistemas Agente Tóxico (xenobiótico, substância ou toxicante) Qualquer substância química que, interagindo com um organismo vivo, é capaz de produzir um efeito tóxico seja este uma alteração funcional ou a morte. A movimentação dos contaminantes nos meios é determinada por processos físicos relacionados às propriedades químicas dos compartimentos ambientais e dos contaminantes.
  • 18. Destino dos poluentes nos ecossistemas Mecanismos de destino e transporte Ar Fotólises Reações com OH- Solo Fotólises Hidrólises Biodegradação Oxidação/redução Biota Bioacumulação Metabolismo OPAS/USEPA, 1996 Água Hidrólises Fotólises Oxidação/redução Biodegradação Sedimento Hidrólises Degradação microbiana Oxidação/redução
  • 19. Testes de toxicidade Método utilizado para detectar e avaliar a capacidade de um agente tóxico provocar efeito nocivo utilizando representantes bioindicadores dos grandes grupos de uma cadeia ecológica. Produtores Consumidores primários Consumidores secundários http://www.sacsplash.org/critters/daphnia.htm
  • 20. Testes de toxicidade Toxicidade – sinais, sintomas e efeitos que causam desequilíbrio orgânico.  Toxicidade aguda  Toxicidade crônica  CE50 e CL50  CENO (Concentração de Efeito Não Observado)  CEO (Concentração de Efeito Observado)
  • 21. Testes de toxicidade - Sistema teste Cultivo de algas Pimephales promelas Danio rerio Pseodukirchneriella subcapitata
  • 22. Testes de toxicidade - Sistema teste Microcrustáceo - Daphnia magna Abelhas – Apis mellifera Minhocas – Eisenia foetida
  • 24. Substância de Referência - substância utilizada para avaliação da sensibilidade do sistema teste Carta-Sensibilidade da cultura de Daphnia magna ao dicromato de potássio (produto Merck, Artigo nº 1.04864.0500, pureza 99,9%) em água reconstituída M4 (06/Julho/2000 a 28/Novembro/2001) 2 1,9 + 2s = 1,70 1,8 1,7 CE50;24h (mg/ 1,6 1,5 1,4 1,3 MÉDIA = 1,22 1,2 1,1 1 0,9 0,8 2s = 0,73 0,7 0,6 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Faixa sensibilidade: 0,9 a 1,5 mg/L (Norma NF-T 90-301, Jan/98), 0,9 a 2,0 mg/L (Norma ISO6341-1982) 12 13 14 15 Testes nº 16 17 18 19 20 21
  • 25. Carta de sensibilidade Carta- Sensibilidade da cultura de Daphnia similis ao dicromato de potássio (produto Merck, artigo nº1.04864.0500, pureza 99%) em água reconstituída MS (01/Junho/2001 a 18/Outubro/2001) 0,9 0,8 CE50;24h (mg/ 0,7 +2S = 0,61 0,6 0,5 Média = 0,45 0,4 0,3 -2S = 0,28 0,2 0,1 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Teste nº 20 21
  • 26. Sistemas de exposição  Sistema estático  Sistema semi estático Sistema de fluxo contínuo
  • 28. Acumulação = 0,62 x 10-8µg heptacloro/µg organismo Depuração = 0,25 x 10-8µg heptacloro/µg organismo Acumulação = 0,12 x 10-5µg heptacloro/µg organismo Acumulação = 0,10 x 10-5µg heptacloro/µg organismo
  • 29. Fatores que influem na Toxicidade ligados ao agente químico  propriedade físico-química (solubilidade, tamanho molecular, estado físico, etc.);  impurezas e contaminantes;  fatores envolvidos na formulação (veículo, adjuvantes).
  • 30. Fatores que influem na Toxicidade relacionados com o organismo  espécie,  linhagem,  fatores genéticos;  fatores imunológicos,  estado nutricional,  dieta;  sexo,  estado hormonal,  idade,  peso corpóreo;  estado emocional,  estado patológico.
  • 31. Fatores que influem na Toxicidade relacionados com a exposição  via de introdução;  dose ou concentração;  ambiente;  temperatura,  pressão;  radiações;  outros (luz, umidade, etc.).
  • 32. Relevância para o meio receptor Representativa do nível trófico a proteger Métodos fiáveis de cultura e teste Sensível a possíveis contaminantes Critérios agudos e crônicos de avaliação Espécie “IDEAL” Distribuição numa vasta área geográfica Abundante e facilmente acessível Fácil manuseio e cultura
  • 33. Qual a espécie mais sensível? Um ensaio detecta todos os efeitos? Não existe Bateria de ensaios Diferentes níveis tróficos Diferentes diferentes critérios de toxicidade Metodologias para situações específicas
  • 34. Teste crônico com ovos e larvas de peixes Vista geral do teste Ovos Larvas
  • 35. Teste agudo com minhocas Solo artificial Solo artificial + solução teste Ovos Organismos em exposição Incubação
  • 36. Teste agudo, por contato, com abelhas Aplicação da substância-teste Teste agudo, via oral, com abelhas Substância-teste Vista geral do teste fornecida como alimento
  • 37. Teste agudo com microcrustáceos Cultivo Incubação Teste crônico com microcrustáceos Concentrações-teste Avaliação
  • 38. Toxicidade aguda para Danio rerio avaliação amônia Resolução CONAMA nº 357
  • 39. Algas ↑ ou ↓ do crescimento pH IET OD
  • 40. Microcrustáceos ↑ ou ↓ do crescimento pH IET OD Fábricas de Curtumes, fábricas de reciclagem de papel, vacarias, etc
  • 41. Monitoramento da qualidade do ar utilizando liquens como bioindicadores Monóxido de Carbono (CO) Dióxido de Enxofre (SO2) Etano, Etileno, Propano, Butano, Acetileno, Pentano Dióxido de Carbono (CO2) www.copesul.com.br/.../cap06/pagina04.html
  • 42. Éter  menor densidade que a água  alterações da eficácia de tratamento das águas nas Estações de tratamento de águas residuais Com base nestes dados ecotoxicidade, deve-se entrada éter nas águas e de também nos solos. evitar de a
  • 43. O ensaio vai detectar o grau de contaminação de uma amostra de solo com resíduos de petróleo.
  • 44. Monóxido de Carbono (CO) Dióxido de Enxofre (SO2) Etano, Etileno, Propano, Butano, Acetileno, Pentano Dióxido de Carbono (CO2) Tradescantia pallida contagem de micronúcleos em células mães de grãos de pólen determinar a capacidade de substâncias causarem danos ao material genético  freqüência elevada de micronúcleos nas análises é o indicador de que as substâncias afetam a planta.
  • 45. Exemplo de preparo de diluições-teste a partir de uma amostra ambiental Diluição da amostra Fator de diluição (FD) Amostra (mL) Água de diluição (mL) Volume final (mL) Conc. da solução teste (%) Controle - - 50 50 - 1:1 1 50 - 50 100 1:2 2 25 25 50 50 1:3 3 16,67 33,33 50 33,34 1:4 4 12,50 37,50 50 25 Fator de diluição (FD) KNIE, J. L. W., LOPES, E. W. B., 2004 Fator de toxicidade (FT)
  • 46. Toxicidade aguda de efluentes industriais para Daphnias e peixes KNIE, J. L. W., LOPES, E. W. B., 2004
  • 47. Autores defendem: Experimento ex-situ: trabalhar com um experimento de laboratório é mais confiável, pois a temperatura, luminosidade e outros parâmetros físico-químicos de exposição são fáceis de serem controlados e de se estimar o efeito do xenobiótico em estudo. Experimento in-situ: as variáveis não podem ser controladas, como temperatura, pH, disponibilidade de alimento, e a perda de organismos. Nestes as variantes são bem mais difíceis de serem interpretadas e o custo é muito elevado
  • 48. Monitoramento CETESB - Rio Tietê Níveis atuais de qualidade Ótima Boa Regular Ruim Péssima ZAGATTO, P.A , 1999
  • 49. As fases da intoxicação 1. Fase de exposição: depende da via de introdução, freqüência e da duração da exposição, concentração do xenobiótico, das propriedades físico-químicas do agente e de fatores relacionados à suscetibilidade individual.
  • 50. As fases da intoxicação 2. Fase de toxicocinética: processos desde a disponibilidade química até a concentração do toxicante nos órgãos alvo (absorção, distribuição, armazenamento, biotransformação e eliminação de substâncias inalteradas e/ou metabólitos.
  • 51. As fases da intoxicação 3. Fase de toxicodinâmica: mecanismos de interação entre o toxicante e os sítios de ação do organismo. Efeitos nocivos decorrentes da ação tóxica. Intoxicação arsênico
  • 52. As fases da intoxicação 4. Fase clínica: sinais, sintomas e alterações detectáveis por provas diagnósticas que caracterizam os efeitos deletérios ao organismo.
  • 53. Fases da intoxicação Exposição Toxicocinética Toxicodinâmica Clínica Processo de transporte: • Absorção Natureza da ação Vias de introdução • Distribuição • Eliminação • Biotransformação Toxicante Toxicidade Disponibilidade química Fonte: AZEVEDO, F.A.; CHASIN, A.A.M., 2003 Biodisponibilidade Intoxicação Sinais e sintomas
  • 55.
  • 56. Interações entre os agentes tóxicos sobre os organismos - Efeito aditivo: soma dos efeitos de cada tóxico. - Efeito sinérgico: efeito combinado maior que o efeito das partes. - Potenciação: uma substância aumenta a toxicidade da outra. - Antagonismo: interferência mútua ou simples
  • 57. MATERIAL DE APOIO: JONSSON, C. M. CASTRO, V. L. Bioindicadores e biomarcadores de agroquímicos no contexto da relação saúde-ambiente – JMA - 10/10/05. Disponível em: www.cnpma.embrapa.br. Acesso em 18 de abril de 2007. MARANHO, L.A. Biomagnificação do Heptacloro num modelo de simulação em condições ex-situ. 2006. 63 p. Dissertação (mestrado em Ecologia de Agroecossistemas) – Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Universidade de São Paulo, Piracicaba, 2006.