Purificação de proteínas

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Diversos processo de purificação de proteínas, assim como sua caracterização.
Leitor de absorbância (espectrofotômetro).

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Purificação de proteínas

  1. 1. 1 Espectofotometria, purificação e caracterização de proteínas 2014
  2. 2. • Ampla variedade de biomoléculas absorve luz em comprimentos de onda característicos; • A medição da luz absorvida por uma biomolécula através do espectrofotômetro é usada para detectar, identificar e quantificar moléculas num determinado material biológico; 2 • A medida de espectrofotômetro é utilizada para detectar e identificar moléculas e para medir suas concentrações em solução; • Ex.: o triptofano absorve luz em 280 nm; • Para tanto deve-se levar em consideração a Lei de Lambert-Beer. Absorção de luz por moléculas: a Lei de Lambert-Beer
  3. 3. Espectrometria de absorção atômica Definição: Consiste na medida da absorção da energia luminosa por átomos no estado fundamental nas regiões do visível a ultravioleta. 3
  4. 4. A= a.b.c = Log Io/I A: absorbância ; a: absortividade; b: percurso ótico; c: concentração molar 4 Relação entre radiação e concentração Lei de Beer Espectrometria de absorção atômica
  5. 5. • Quanto maior a concentração (c) ou maior o caminho óptico (b) maior será a absorbância da amostra, por isso geralmente o b é padronizado em 1 cm. • Exemplo: – com base na lei de Lambert-Beer, calcule a absorbância de uma solução com concentração 0,002 mol L-1 de uma substância com absortividade molar de 313 L mol-1 cm-1, determinada em uma célula com 2,00 cm de caminho óptico. A = a.b.c A= 313 L mol-1 . 2,00 cm . 0,002 mol L-1 A= 1,252 Lei de Lambert-Beer 5
  6. 6. • Toda biomolécula apresenta um comprimento de onda específico onde a absorção de luz é máxima. 6 Pico máximo de absorção de luz
  7. 7.  Proteínas devem ser purificadas para ser caracterizada quanto as suas propriedades e atividades. 7  Para se estudar uma proteína detalhadamente deve-se separá-la de outras proteínas em sua forma pura; Hemoglobina Trabalhando com proteínas
  8. 8.  Necessário fonte de proteínas (tecido ou células);  Romper estas células, liberando suas proteínas em uma solução (extrato bruto);  Centrifugar se necessário para preparar frações subcelulares;  Uma vez com o extrato pronto, diversos métodos estão disponíveis para a purificação. Exemplos: Diálise, Fracionamento (cromatografia em coluna, cromatografia de troca iônica, cromatografia de troca catiônica, cromatografia de afinidade e cromatografia líquida de alta eficiência -HPLC). Purificação de proteínas 8
  9. 9.  É um processo que separa proteínas de pequenos solutos se aproveitando do maior tamanho das proteínas;  O extrato parcialmente purificado é colocado em um saco ou tubo feito de uma membrana semi-permeável;  Ele é suspenso em um volume muito maior de solução tampão de força iônica apropriada, a membrana permite a troca de sal e tampão, mas não de proteínas. 9 Método de Diálise: Purificação de proteínas
  10. 10.  É utilizado diferenças na solubilidade proteica, onde a mesma é reduzida em elevadas concentrações salinas, um efeito denominado salting out de proteínas;  As proteínas que então precipitam são removidas daquelas que permanecem em solução por centrifugação em baixa velocidade. 10 Método de Fracionamento: Purificação de proteínas
  11. 11.  Tem como base diferenças no tamanho,carga, afinidade de ligação e outras propriedades;  Um material sólido poroso com propriedades químicas apropriadas é mantido em uma coluna, pela qual é percolada uma solução tampão;  A solução contendo a proteína depositada no topo da coluna percola o material sólido poroso dentro da solução tampão. 11 Cromatografia em coluna: Purificação de proteínas
  12. 12. 12
  13. 13. Cromatografia de troca iônica:  Explora as diferenças no sinal e na magnitude da carga elétrica líquida de proteínas em um dado pH.  A matriz da coluna é polímero sintético (resina) contendo grupos carregados ligados (trocadores de cátions ou trocadoras de ânions);  A afinidade de cada proteína pelos grupos carregados na coluna é afetada pelo pH e pela concentração de íons de sais livres.  Enquanto a solução contendo proteínas permanece na coluna, frações deste efluente são coletadas em tubos teste (cada fração pode ser testada para a presença de proteína de interesse) Purificação de proteínas 13
  14. 14. 14
  15. 15. Cromatografia de afinidade:  Tem como base a afinidade de ligação;  Os grânulos da coluna possuem um grupo químico covalentemente ligado (ligante);  Quando uma mistura de proteinas é adicionada a coluna, qualquer proteína com afinidade por este ligante se liga aos grânulos e sua migração através da matriz é retardada;  As proteínas que não se ligam são lavadas na coluna, e a proteína ligada é eluida com a solução contendo uma concentração elevada de sal quanto do ligante livre. Purificação de proteínas 15
  16. 16. 16
  17. 17. Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC, high perfomance liquid chromatography):  Utiliza bombas de alta pressão que aceleram o movimento das moléculas de proteína através da coluna;  Ao reduzir o tempo de trânsito na coluna, a HPLC pode limitar o espalhamento difusional das bandas de proteína e assim aumentar significativamente a resolução (Ver cromatografia em coluna). 17 Purificação de proteínas
  18. 18.  Baseado em migração de proteínas carregadas em um campo elétrico;  A eletrofoese permite a determinação de propriedades críticas (ponto isoelétrico e massa molecular estimada);  Para eletroforese de proteínas é utilizado géis de poliacrilamida (peneira molecular), retardando a migração de proteínas na proporção de sua relação carga-massa; 18 Caracterização por eletroforese: Caracterização de proteínas
  19. 19.  Um método eletroforético utilizado faz uso do detergente dodecil sulfato de sódio (SDS, sodium dodecyl sulfate);  O SDS se liga a grande maioria das proteínas onde contribui com uma grande carga negativa e conferindo para cada proteína uma carga-massa semelhante;  As proteínas são visualizadas pela adição de corantes (azul de Coomassie) que liga-se as proteínas e não ao gel. 19  Na eletroforese o SDS separa as proteínas quase exclusivamente com base na massa molecular; Caracterização de proteínas - eletroforese
  20. 20. 20
  21. 21.  Na maioria dos casos vários métodos precisam ser utilizados sequencialmente para purificar uma proteína por completo pois cada método separa as proteínas com base em diferentes propriedades; 21  Diversas estratégias podem ser tentadas até que seja encontrada a mais eficiente;  Protocolos de purificação publicados estão disponíveis para muitos milhares de proteínas;  Métodos de baixo custo devem ser utilizados primeiro ( volume e número de contaminantes e maior);  Métodos cromatográficos são impraticáveis nos estágios iniciais já que a quantidade de meio cromatográfico cresce com o tamanho da amostra;
  22. 22.  Conforme casa passo de purificação é completado, o tamanho da amostra se torna menor, tornando acessível o uso de procedimentos cromatográficos. 22
  23. 23. 23 Referência  NELSON, D. L.; COX, M.M. Princípios de Bioquímica de Lehninger. - 5. ed. -Porto Alegre: Artmed, 2011.

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