O documento discute conceitos básicos sobre biotecnologia molecular e genética, incluindo: 1) A informação genética está contida nos cromossomos, que são compostos por DNA e proteínas. 2) Marcadores moleculares como RFLP, microssatélites e SNPs podem ser usados para mapear loci e QTLs associados a características quantitativas. 3) A variabilidade genética entre indivíduos ocorre devido a polimorfismos na sequência do DNA, e marcadores moleculares pode

1. USO DE TECNOLOGIAS
MOLECULARESMOLECULARES

2. Conceitos básicosConceitos básicos

3. Aonde esta localizada a informação genética?
•Cromossomos: acido desoxirribonucléico
(DNA) + proteínas
•O DNA é uma grande molécula de duas fitas
•Cada fita é composta por:
Açucares, radicais de fosfato e bases
nitrogenadas
- A informação genética é contida nos cromossomos.
nitrogenadas
–Adenina (A), Guanina (G), Citosina (C),
Tiamina (T)
–A com T (2 pontes de nitrogênio)
–C com G (3 pontes de nitrogênio)
•As fitas são conectadas através de pontes de hidrogênio.

5. •Os cromossomos são arranjos lineares de DNA:
ATTTGATCGCGCGTT
•Par de cromossomos homólogos (indivíduos diplóides)
–Bovinos 2n:60; Suínos 2n:38; Ovinos 2n:54
•Loci (plural: locos): A posição de um gene ou de um marcador•Loci (plural: locos): A posição de um gene ou de um marcador
genético em um cromossomo.
•Alelos: formas alternativas de um gene
•Haplótipos: Alelos em diferentes loci localizados de forma próxima
em um cromossomo tendem a ser herdados conjuntamente
(Ligação)

6. •Meiose (I e II): um tipo especial de divisão celular que ocorre no
processo de formação das gametas, através do qual uma célula tem
o seu número de cromossomos reduzido pela metade.
• Os cromossomos segregam de forma aleatória (Meiose I)
•“Crossing-over” ou recombinação: troca de segmentos
cromossômicos entre homólogos durante a meiose (Meiose I)

7. Que é crossing-over?
•Uma forte correlação entre a fração de recombinação e a
distância em pares de bases.
•O crossing-over ocorre quando existe troca de segmentos de
cromossomos homólogos (ex, os cromossomos paternos e
maternos)

8. A variação genética é devido a diferenças na seqüência de DNA
Os genes são uma sequência de DNA (ex: AGTCTAGGGATTAGA)
•As diferenças genéticas entre indivíduos são devidas às diferenças
na sequência de DNA:
Animal 1 AGTCTAG
Animal 2 AGTGTAG
•As diferenças genéticas são devido a variações naturais na
seqüência do DNA (polimorfismos)
Nem sempre as diferenças a nível genética (DNA) determinam
diferenças no fenótipo
–Depende se a variação estiver numa região codificante
–Exon/Intron

9. Algumas características são controladas por poucos
(um) genes
• – Cor da pelagem
• – Algumas doenças genéticas
• – Dupla musculatura
• – Presença de chifres

10. • A maioria das características produtivas são
controladas por vários genes e por efeitos ambientais
• - Muitos genes + efeito ambiental
• - Modelo infinitesimal (Fischer, 1918)

11. Mensagem I
• A seleção depende da disponibilidade de registros
fenotípicos
• Dependendo da herdabilidade da característica pode
fornecer uma idéia ou não do valor genético aditivofornecer uma idéia ou não do valor genético aditivo
do animal
• As informações de parentesco genético aditivo são
utilizadas para a estimação dos valores genéticos

12. Limitações da seleção tradicional
• Seleção tradicional depende fortemente
registros fenotípicos e resposta muito baixa
para algumas características:
– Características de difícil mensuração– Características de difícil mensuração
– Características que são expressos tardiamente
na vida do animal
– Caracteres limitados ao sexo
– Características de baixa herdabilidade

13. Resposta a seleção
• ΔG: Progresso genético anual
• i: intensidade de seleção
• r: acurácia de seleção
• σa: desvio padrão aditivo
• IG: intervalo entre gerações

14. Detecção de genes de efeito maior (QTL)
•Se temos informação sobre a localização do QTL no genoma
podemos:
–Diminuir o intervalo entre gerações
–Aumentar a acurácia dos valores genéticos–Aumentar a acurácia dos valores genéticos
–Incrementar a resposta à seleção
•Como encontrar os QTL?
1.-Mapeamento por ligação
2.-Abordagem de genes candidatos

15. Podemos observar diretamente os genes que afetam as
características quantitativas?
Uso de
marcadores
moleculares
•Localizar os genes que tem grande efeito sobre o
fenótipo
•Identificar diferentes alelos destes genes
•Permitem seguir ou rastrear a herança dos genes
(ao longo das gerações)

16. Uso de marcadores no estudo de
características quantitativas
• Características quantitativas
– Controladas por vários genes de pequeno efeito
– Sofrem maior influencia ambiental
– Não se sabe quanto ele contribui para o fenótipo
• QTL: Quantitative Trait Loci; Locos de um caráter quantitativo• QTL: Quantitative Trait Loci; Locos de um caráter quantitativo
identificado por marcadores moleculares.
• Finalidade: determinar quanto de uma característica
quantitativa é explicada por um ou mais marcadores

17. QTL
• São regiões cromossômicas relacionadas com variação
fenotípicas das características quantitativas
• Limitações:
• Dificuldade de avaliação dos caracteres quantitativos aliados a
necessidade de ligação dos marcadores com os QTLnecessidade de ligação dos marcadores com os QTL
• Dificuldade de obtenção dos próprios marcadores
• Estudo difícil e trabalhoso
• Obs: Há necessidade de mais pesquisas para tornar
mais eficientes o emprego dos marcadores moleculares
no estudo das características quantitativas

18. Busca de QTL
•O que necessitamos?
–Uma população de animais com genótipos dos
marcadores e os fenótipos para características relevantes
•Princípios chaves na busca
–Encontrar marcadores associados com diferenças nos
fenótipos
–O marcador está ligado com um QTL que determina as
diferenças de fenótipo

19. Uso de marcadores moleculares
Duas alternativas 1- DIRETAMENTE identificaram o
gene de interesse
Marcadores diretosMarcadores diretos

20. Aplicação: Análise de Genes Candidatos
•Genes de função conhecida relacionados com o desenvolvimento
de uma característica
•Principal vantagem prática: não há necessidade de construção de
famílias segregantes, podendo o efeito do gene candidato ser
avaliado em qualquer população (marcador direto)
•Outras Vantagens:
–Alto poder estatístico
–Ampla aplicabilidade
–Baixo custo e simplicidade
•Desvantagem: Difícil de encontrar
regiões candidatas
Dekkers and van der Werf, 2007

21. 2- INDIRETAMENTE identificação de marcadores
que estão próximos ao gene ou QTL de interesse
IMPORTANTE:
Distância entre marcador e a mutação
Marcadores indiretos

22. Porque é que a distância é importante?
Um marcador genético indireto (variantes A e B) ligado a um
gene principal (variantes círculo e triângulo):
Se organizamos o sêmen deste touro
obtemos:
Gametas não recombinantes Gametas recombinantes
A distância é proporcional ao
número de recombinantes

23. Mapeamento por ligação: LD e LE
• Marcadores em loci diferentes se encontram em
associação ao acaso (independentes) são ditos em
estado de equilíbrio de ligação (LE) na população.
• Marcadores em loci diferentes não estão em
associação ao acaso (não independentes) são ditos
em estado de desequilíbrio de ligação (LD) na
população.

29. MARCADORES GENÉTICOS
• Identificar ou etiquetar alguma coisa
• 1923: feijão com ausência de cor escura no tegumento x
tamanho do semente : seleção de forma indireta (tegumento
claro = marcador
• Qualidade de um bom marcadorQualidade de um bom marcador
» Herdável
» Fácil observação
» Herdabilidade alta
» Intimamente relacionado ao alelo que desejamos selecionar
• OBS: Essas qualidades tornam mas eficientes a seleção indireta
• Os marcadores genéticos podem ser morfológicos e moleculares.

30. MARCADORES MORFOLOGICOS
• Fenótipo de fácil identificação
• Normalmente determinada por único alelo.
• Exemplo 1: planta de milho jovem verde clara x esterilidade
masculina ( fenótipo importante na produção de híbrido mas de
difícil identificação = estão em lócus bastante próximos e tem altadifícil identificação = estão em lócus bastante próximos e tem alta
probabilidade de serem herdados juntos)
• Exemplo 2: cor amarela do milho x teor de vitamina (o mesmo
alelo para ambas características: mais fácil selecionar pela cor)
• Limitação dos marcadores morfológicos:
• Ocorrência em número reduzido
• Muitas características de interesse econômico não tem marcador morfológico
• Muitos marcadores que apresentam baixa herdabilidade

31. Marcadores moleculares
• O que seriam marcadores moleculares?
São alterações encontradas na sequência de
aminoácidos de uma proteína ou do próprio DNA,aminoácidos de uma proteína ou do próprio DNA,
que podem alterar uma determinada
característica em alguns indivíduos de uma
população

32. Marcadores moleculares
• Características de DNA que diferenciam dois
ou mais indivíduos e são herdadas
geneticamente.
• Os tipos de marcadores diferenciam-se pela
tecnologia utilizada para revelar variabilidade
do DNA.

33. Marcadores moleculares
• Marcadores de proteínas ( Produtos direto dos
alelos);
• Marcadores que utilizam o próprio DNA (são os• Marcadores que utilizam o próprio DNA (são os
próprios genes ou seqüências de DNA situadas
próxima ao gene de interesse):
» RFLP
» PCR
» AFLP
» Microssatélites

34. Marcadores de proteínas -bioquímicos
• Mais comuns: isoenzimas ( esterases, fosfatases,
peroxidases...)
• Procedimento consiste na extração e identificação da
proteína.
• Exemplo: Cevada izoenzima esterase x resistência um• Exemplo: Cevada izoenzima esterase x resistência um
virus ( seleção indireta)
• Vantagem:
– menor custo
– Codominância: identifica homozigotos e heterozigotos
• Limitações:
– Reduzida variabilidade
– Marcadores em número reduzido

35. Marcadores que utilizam o próprio DNA
• São os próprios genes ou seus vizinhos, isto é
seqüências de DNA situadas próxima ao gene que se
deseja marcar
• Vantagens;Vantagens;
• Grande variabilidade entre indivíduos
• Numero de marcadores suficientes para marcar todos os alelos de
todos os genes que se deseja marcar.
• Desvantagens:
• Técnicas laboratoriais mais caras, que os bioquimicos e os
morfológicos

36. Marcadores moleculares
princípio de funcionamento
O princípio básico envolvido na obtenção e detecção dos
marcadores bioquímico e molecular reside na utilização da
ELETROFORESE
Seu princípio é simples: moléculas de carga negativa migram para
o pólo positivo, e moléculas com carga positiva migram para oo pólo positivo, e moléculas com carga positiva migram para o
pólo negativo
A técnica de PCR (Polimerase Chain Reaction ou Reação em
Cadeia de Polimerase), a qual muito marcadores moleculares são
derivados e consiste na amplificação enzimática direcionada por
“primers” (iniciadores) de um DNA (PCR), é um método in vitro
que sintetiza milhões de cópias de uma seqüência nucleotídica
em poucas horas

37. Técnica de PCR
Reação em Cadeia de Polimerase
• Técnica que replica milhões de vezes um
fragmento de DNA, possibilitando a sua
detecção e análise.
• Extração do DNA
• Vários protocolos
• Kits prontos

38. Algumas classes de marcadores moleculares
RFLP (Restriction Fragmenth Lenght Polymorphism)
RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA)
Microssatélites ou SSR (Sequence Simple Repeats)Microssatélites ou SSR (Sequence Simple Repeats)
AFLP (Amplified Frangment Lenght Polymorphism)
SNP (Single-nucleotide polymorphism)

39. Os principais tipos de marcadores utilizados
atualmente em pecuária são:
• 1)Análise das variações no comprimento de
regiões de DNA tipo Microssatélite (testes de
paternidade e registro)paternidade e registro)
• 2)Painéis contendo diversos polimorfismos de
sítio único (SNP) (seleção e melhoramento)

40. RFLP (“Restriction Fragment Length Polymorphism”)
Significa polimorfismo no comprimento de fragmentos de
restrição (obtidos por corte de fita dupla de DNA).
Tome-se dois indivíduos distintos que têm o DNA extraído e
submetido a clivagem por enzima de restrição. O uso da técnica de
RFLP visa detectar diferenças na seqüência de DNA dos dois
indivíduos. Uma maneira de se fazer isto é sequenciar o DNA dos
dois indivíduos e comparar as seqüências obtidas.

42. • Admitindo-se que o fragmento de DNA identificado
pela sonda esteja intimamante ligado a um alelo de
interesse, pode-se selecionar esse alelo por meio
desse fragmento. Assim o fragmento RFLP funciona
como um marcador ou etiqueta do alelo de
interesse.

44. Usos marcadores RFLP
• Diversidade genética e identificação de paternidade
• Construção de mapas de ligação e mapeamento de QTLs
• Seleção assistida por marcadores (SAM)

45. RAPD-”Fragmentos de DNA amplificados
ao acaso” ( Williams et al, 1990)
• Marcadores moleculares anônimos distribuídos pelo
genoma;
• Utiliza “primers” curtos e de seqüências arbitrárias, com
seqüências alvo desconhecida;seqüências alvo desconhecida;
• Utiliza um “primer” único;
• Detecta polimorfismo em apenas um par de bases;
• Baseia-se na amplificação de DNA;
• Não Permite distinguir heterozigotos.

47. Microssatélites ou SSR
Comportamento Mendeliano e consistem de trechos de
DNA de unidades mono-, di-, tri-, tetra- ou penta-
nucleotídica repetidas ao acaso, dispersas por todo o
genoma eucarioto
Os produtos da reação são separados em gel deOs produtos da reação são separados em gel de
poliacrilamida
Vantagens (natureza multialélica, herança codominante;
fácil detecção por PCR; quantidades mínimas de DNA)
Desvantagens (custo final “primers informativos”)

48. Microssatélites
• Seqüências curtas (300 pb)
• Repetições em tandem (6 a 8 nucleotídeos =
mais comuns TG/AC)
• Mais utilizada em mapeamento genético,• Mais utilizada em mapeamento genético,
devido a sua grande varredura no genoma.

49. MÉTODO
as sequencias que flanqueiam Regiões repetidas são
amplificadas por um par de primers específicos (20 a
30 bases) - complementares as seqüências
microssatélites.
Cada microssatélite –é um loco genético altamente
variável, multialélico.
Separação por eletroforese (cada banda representa
um alelo diferente do mesmo loco)

54. AFLP- Polimorfismo de comprimento de
fragmentos amplificados (Vos et al., 1995).
Técnica:
• Clivagem do DNA genômico com duas enzimas de
restrição
• Ligação de adaptadores específicos aos terminais dos• Ligação de adaptadores específicos aos terminais dos
fragmentos clivados
•Pré-amplificação dos fragmentos,utiliza primers
especificos para cada adaptador mais uma base seletiva
(Eco + A, M+C)
• Amplificação seletiva utiliza primers específicos para o
adaptador, sitio de restrição mais três bases seletivas
• Eletroforese em gel de alta resolução

56. MARCADORES DERIVADOS DE
SEQÜENCIAS EXPRESSASSEQÜENCIAS EXPRESSAS

57. Marcador molecular – SNP
Polimorfismos de base única
Correspondem a posições onde existe uma alternância dos
nucleotídeos A, C, G e T, em uma freqüência alélica mínima de
1% em uma dada população
São polimorfismos estáveis
A grande maioria é neutra
Duas pessoas não relacionadas diferem em aproximadamente
1 base a cada 1000. Do total de 3 bilhões de bases em seu
genoma um indivíduo carregaria 3 milhões de SNPs.

58. SNP- Polimorfismo de um nucleotídeo
•Single Nucleotide Polymorphism ou Polimorfismos de
Nucleotídeos Únicos
• Polimorfismo baseados na alteração de uma única base
no genomano genoma
•Exemplo: AAGGTTA muda para ATGGTTA

59. Tipos mais comuns de SNPs:
•Transição: base púrica é
substituída por outra púrica
A G T C
• Transversão: púrica substituída
por pirimídica ou vice-versa :por pirimídica ou vice-versa :
A C A T
G C G T

60. •Podem ocorrer em regiões expressas e não expressas
• São estáveis do ponto de vista evolutivo
•SNP se ocorrer em pelo menos 1% da população
• Alta freqüência e distribuição no genoma:
Genoma humano: 90% polimorfismo – SNPs 1,42 milhão
Milho: 1SNP – 48pb (Regiões não-codificadoras)
Total – 21.502 SNPsTotal – 21.502 SNPs
São encontrados no genoma em :
•Haplogrupos: mutações que ocorrem próximas e são herdadas
juntas
Indivíduo Seqüência encontrada Haplogrupo
1 GATATTCGTACGGATGTATC AG
2 GATGTTCGTACTGATGTATC GT
•Individuais:

62. VANTAGENS
• Abundância no genoma
• Elevado grau de polimorfismo
• Detecção de diferentes alelos para genes de interesse
DESVANTAGEM
Sequenciamento de DNA em grande escala

63. Marcadores moleculares - aplicabilidade
Caracterização de diversidade genética em populações
naturais e genótipos cultivados
Sistemática e evolução (taxonomia molecular)
Identificação de genes de interesse zootécnico
Confecção de mapas genéticos
Clonagem de genes e mapeamento
Seleção assistida em melhoramento
Diversidade genética e seleção de genitores
Fingerprinting e proteção de cultivos
Análise de pureza genética
Mapeamento comparativo

64. Conclusão
As aplicações da biotecnologia na área animal
são múltiplas e estão em diferentes etapas de
desenvolvimento, algumas com problemas
técnicos a serem solucionados e outras que já
geraram produtos que podem entrar no mercadogeraram produtos que podem entrar no mercado
ou que já estão sendo comercializados. O
ambiente é efervecente e fascinante e,
certamente, contribuirá para a melhor qualidade
de vida do homem.

65. Obrigado pela a atenção de
vocês!!!vocês!!!