O documento descreve o processo de electroforese, incluindo a preparação do gel de agarose, carregamento das amostras de DNA, aplicação da voltagem, e visualização dos resultados. A electroforese permite separar fragmentos de DNA com base no seu tamanho através da migração em um gel sob a influência de um campo elétrico.

1. MÓDULO I
Electroforese

2. Electroforese:
uma técnica electrizante
Laboratório Virtual de Biotecnologia
Introdução
moléculas de DNA que se encontrem
A electroforese é uma das técnicas
em
suspensão
numa
solução
básicas da Biologia molecular e é uma
electrolítica (isto é, que possua iões
das mais utilizadas pelos cientistas no
livres) podem ser separadas através
seu
técnica
da aplicação de uma dada voltagem.
permite a separação de moléculas de
No final do processo, as cadeias de
diferentes tamanhos. Antes do seu
DNA
aparecimento,
de
(eléctrodo
fragmentos de DNA, por exemplo, era
moléculas
feita
entanto, o objectivo desta técnica é
trabalho
diário.
a
separação
recorrendo
laborioso:
a
Esta
a
um
método
ultracentrifugação
por
estarão
separar
próximas
de
os
carga
ânodo
que
positivo),
do
atrai
negativa.
fragmentos
de
No
várias
velocidade de sedimentação. Neste
moléculas por tamanho. A solução é
método, as amostras de DNA eram
“peneirar” esses fragmentos utilizando
sujeitas a uma centrifugação de alta
para esse efeito crivos moleculares.
velocidade envoltas num gradiente de
As
sal
através
ou
açúcar
que
separava
os
fragmentos por tamanho.
electroforese
poliacrilamida
em
pela
corrente
gel
de
dos poros do crivo, passam ou são
retidas. O crivo utilizado é o gel de
agarose
separar
solidificar, este gel forma uma rede
fragmentos de DNA. A partir daí esta
através da qual passam as moléculas
técnica disseminou-se de tal modo
de DNA.
e
rápida
uma
crivo
“empurradas”
técnica
simples
como
desse
são
eléctrica, e, de acordo com o tamanho
Em 1970, Daniel Nathans utilizou
a
moléculas
para
ou
de
poliacrilamida.
Ao
que, actualmente, ela é utilizada em
Para que se possa utilizar esta
virtualmente todos os laboratórios de
técnica, é necessário montar todo o
biologia molecular.
material necessário:
Primeiro, é necessário preparar o gel
O que é a electroforese?
de agarose (mais utilizado do que o
Electroforese significa literalmente
gel
de
poliacrilamida).
Para
isso,
“transportar através de electricidade”.
dissolve-se agarose (uma forma muito
Tem
pura de agar, substância obtida a
por
base
o
princípio
que
determina que a carga global de uma
partir
cadeia de DNA é negativa. Portanto,
solução-tampão que necessariamente
de
algas
marinhas)
com
a
2

3. irá cobrir o gel na montagem final do
pH da solução estáveis. Só depois de
material.
Normalmente,
tudo
electroforese
de
coberto
pela
solução-
-tampão é que se retira o pente,
solução-tampão Tris-Acetato de EDTA
ficando os poços onde se vão colocar
(TAE).
as amostras devidamente delimitados
Aquece-se
a
a
utiliza-se
estar
a
facilitar
DNA,
na
mistura
dissolução
e
para
deita-se
no gel (Fig.1).
cuidadosamente a mistura na tina de
electroforese,
recipiente
que
dará
Quanto às amostras que serão
forma ao gel e onde irá ocorrer a
carregadas
electroforese.
realçar
solidifique,
Antes
que
que
elas
é
são
importante
previamente
misturadas com o tampão de amostra
adequado o pente que fará os poços
(Loading dye), que tem como principal
onde se colocarão as amostras. Após
função
ter solidificado, obtém-se o gel que
amostra e, assim, impedir que esta
servirá de suporte à electroforese e
comece a flutuar no tampão antes que
de crivo para as moléculas que irão
a voltagem seja aplicada ao sistema.
migrar. De seguida, preenche-se a
Além disso, o tampão de amostra
tina de electroforese com solução-
possui um corante, o que possibilita a
-tampão até o gel ficar totalmente
visualização
coberto
é
electroforese (uma vez que o DNA não
razões:
é visível a olho nu). Normalmente
possibilita a passagem da corrente
utiliza-se como tampão de amostra
eléctrica e mantém as moléculas e o
uma mistura de azul de bromofenol
importante
esta.
por
Esta
duas
no
gel
gel,
local
por
coloca-se
o
no
solução
aumentar
do
a
densidade
progresso
da
da
Figura 1 – Montagem do material necessário para realizar a electroforese.
3

4. (Corante), xileno-cianol e glicose ou
O gel corado é posteriormente
glicerol (para aumentar a densidade),
exposto a luz ultravioleta (UV). O
dissolvidos na solução-tampão.
complexo
Quando
todo
etídio,
quando observado sob a luz UV,
preparado e todas as amostras são
torna-se fluorescente indicando a sua
carregadas nos devidos poços, inicia-
posição no gel. É importante perceber
-se a electroforese: liga-se a fonte de
que uma banda de DNA observada no
energia, o que faz com que seja
gel de agarose não corresponde a
fornecida corrente a cada um dos
uma única molécula de DNA mas sim
eléctrodos presentes de ambos os
a
lados
idênticas, todas do mesmo tamanho.
tina
material
de
está
da
o
DNA-brometo
de
electroforese,
vários
milhões
de
moléculas
criando-se um campo eléctrico ao
longo do gel. Os fragmentos de DNA
iniciam a sua migração, abandonando
os poços e movendo-se através do gel
de
agarose.
O
negativamente,
DNA,
migra
carregado
através
dos
poros do gel em direcção ao eléctrodo
carregado positivamente (ânodo).
O movimento visível das moléculas do
corante (que também migram em
direcção ao ânodo) permite controlar
a migração relativa das moléculas de
DNA,
que,
nesta
fase,
não
se
conseguem visualizar.
Figura 2 – Moléculas de brometo de etídio
Após a electroforese, é necessário
intercaladas na dupla hélice do DNA.
corar o DNA para podermos visualizar
os resultados. Para isso, mergulha-se
Aplicações
o
electroforese
gel
numa
solução
diluída
de
brometo de etídio. O brometo de
etídio
difunde-se
através
do
gel
A
da
técnica
electroforese
diversas
áreas,
é
de
aplicada
sempre
que
em
é
onde
necessário proceder à separação de
estão os fragmentos de DNA. Uma vez
fragmentos de DNA ou de outras
que o brometo de etídio
moléculas. Dada a sua simplicidade e
concentrando-se
molécula
planar,
moléculas
de
(Fig.2).
nas
regiões
é uma
nas
facilidade
corando-as
substituiu
intercala-se
DNA,
de
uso,
outras
esta
técnica
técnicas
de
separação. É utilizada para visualizar
fragmentos provenientes da digestão
4

5. de
enzimas
visualizar
de
restrição
ou
para
produtos da reacção de
PCR. A análise dos padrões de bandas
obtidos no gel de agarose é muito
importante no diagnóstico de várias
doenças genéticas, por exemplo.
Questões de análise
No
Laboratório
Virtual
de
Biotecnologia encontrará dois vídeos
que
ilustram
e
explicam
algumas
etapas da electroforese (canal 4 e 5
da LVBtv).
1 – Descreva o que ocorre durante
uma electroforese.
2 – Enumere as principais vantagens
desta técnica relativamente a outras
utilizadas anteriormente para separar
moléculas de DNA.
3
–
Faça
necessário
uma
para
lista
do
realizar
material
uma
experiência utilizando esta técnica.
4 – Indique duas aplicações desta
técnica.
5

6. ALA METODOLÓGICA
6
ALA CONCEPTUAL
Teoria:
Durante a electroforese
Conclusões:
as moléculas de DNA
Princípios:
migram todas à mesma
velocidade?
Registos/Observações:
Pista 1
Conceitos:
Desenho experimental:
Tamanho da
molécula de DNA
300 pb
900 pb
1700 pb
Pista
1
Pista
2
Pista 2

7. ALA METODOLÓGICA
7
ALA CONCEPTUAL
Teoria:
A concentração em
Conclusões:
agarose do gel
Princípios:
influencia a migração
das moléculas de
DNA?
Registos/Observações:
Pista 1
Conceitos:
Desenho experimental:
Tamanho da
molécula de DNA
300 pb
900 pb
1700 pb
Pista
1
Pista
2
Pista 2

8. ALA METODOLÓGICA
8
ALA CONCEPTUAL
Teoria:
A migração de um
Conclusões:
fragmento de DNA
Princípios:
influencia a migração
de outro?
Registos/Observações:
Pista 1
Conceitos:
Desenho experimental:
Tamanho da
molécula de DNA
300 pb
900 pb
1700 pb
Pista
1
Pista
2
Pista 2