Carne in vitro 
Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia 
Trabalho Interdisciplinar Orientado III (TIO-III) 
Unesp-Arara...
Nas apresentações anteriores... 
(TIO-I e II)
Relevância de Demanda
Relevância Ambiental
Relevância Ambiental 
(http://calmariatempestade.wordpress.com/2012/06/22/carne-de-laboratorio/)
Relevância Social
Etapas de Produção - Simplificado
Etapas de Produção - Diferenciação II
Tecido Muscular - Tipos
Miogênese
Tipos Celulares 
• Células Tronco Embrionárias: 
– Vantagens: 
• Em teoria, tem potencial ilimitado de proliferação; (esse...
Mecanismos de Regulação Gênica em 
Eucariotos 
http://genmol.blogspot.com.br/2011/09/genetica-molecular-sinopse-do-control...
Diferenciação do Tecido Muscular 
In Vitro 
• Necessidade de Estímulos 
Químicos: 
– Proteínas reguladoras; 
– Fatores de ...
Meio de Cultura 
• Deve conter: 
– Nutrientes; 
– Hormônios e proteínas de regulação gênica; 
– Fator de crescimento; 
– C...
Fator de Crescimento 
• Substâncias que controlam o ciclo celular (transição 
da fase G0 para G1); 
• Soro fetal bovino =>...
Transportadores de Oxigênio 
• Atuariam no lugar do sangue para manter 
concentrações adequadas no meio; 
• Opções: 
– Ver...
Suporte de Fixação 
• Promove a ancoragem da célula; 
• Deve possuir uma textura adequada para 
promover o alinhamento dos...
Mecanismos de Contração 
• Necessários para a diferenciação celular; 
• Poderiam ser: 
– Mecânicos; 
– Químicos (um materi...
Espessamento do Tecido – Sistema 
Vascular Artificial 
• Células começam a morrer por falta de nutrientes 
quando o tecido...
No TIO III...
Objetivos 
• Geral: Estabelecer técnicas que possam contribuir com a 
viabilidade de produção de Carne In Vitro em escala ...
Metodologia
1º - Isolamento das CS 
• Biópsia do tecido muscular; 
• Banho enzimático de colagenase tipo II, 
tripsina e DNAse, diluíd...
2º - Caracterização das Células 
Satélites e Mioblastos 
• Marcadores proteicos: 
– 14 proteínas características expressas...
2º - Caracterização das Células 
Satélites e Mioblastos 
• A sequencia de aminoácidos, tamanho da cadeia, peso molecular e...
2º - Caracterização das Células 
Satélites e Mioblastos 
• Para identificar os marcadores proteicos na 
cultura celular =>...
2º - Caracterização das Células 
Satélites e Mioblastos 
• Para garantir que a banda é realmente da proteína de 
interesse...
3° - Proliferação da Cultura Primária 
• Encubação a 37°C; 
• Alta concentração de fatores de crescimento; 
• Controle de ...
Determinação da Concentração de 
Glicose 
• Método de Bergmeyer e Bernt (1974): 
I) D-glicose + H2O + O2 -> Ácido D-glucón...
YSI Industrial Analyzer 
• Análise automatizada de várias alíquotas em 
simultâneo; 
• Permite quantificação de glicose, á...
Contagem das células 
• Hemocitômetro ou contador de partículas eletrônico; 
• Fases de crescimento da cultura:
4° - Proliferação em escala 
• Biorreator adequado para cultura de células animais: 
– Controle automatizado dos parâmetro...
Cisalhamento em Biorreatores com 
Aeração Direta
5° - Diferenciação do Tecido Muscular 
• As células são semeadas nos suportes; 
• Dois grupos de ensaios: 
– Suportes de C...
Biorreator para a Diferenciação
Biorreator de Fibra Oca Adaptado 
• Objetivo: maximizar a produção contornando as limitações de oxigenação 
e fornecimento...
Biorreator de Fibra Oca Adaptado 
• Dois meios de cultura: 
– Extracapilar: moléculas grandes; 
– Intracapilar: moléculas ...
Perspectivas do TIO 
• Conhecer melhor cada etapa do processo de 
produção da carne in vitro, e os conceitos práticos e 
t...
Referências Bibliográficas 
• BHAT et all, “Prospects for In Vitro Cultured Meat – A Future Harvest”, Principles of Tissue...
Grupo 
• Caio Ricardo 
• Camile Pedrosa 
• Euclides Formica 
• Larissa Gomes 
• Lucas Nakamura 
• Lucas Zamian 
• Lucas He...
TIO 3  - Carne In Vitro
TIO 3  - Carne In Vitro
Próximos SlideShares
Carregando em…5
×

TIO 3 - Carne In Vitro

547 visualizações

Publicada em

Projeto Carne In Vitro, TIO III - Trabalho Interdisciplinar Orientado, Unesp, set/2014

Publicada em: Educação
  • Seja o primeiro a comentar

  • Seja a primeira pessoa a gostar disto

TIO 3 - Carne In Vitro

  1. 1. Carne in vitro Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia Trabalho Interdisciplinar Orientado III (TIO-III) Unesp-Araraquara | Setembro-2014
  2. 2. Nas apresentações anteriores... (TIO-I e II)
  3. 3. Relevância de Demanda
  4. 4. Relevância Ambiental
  5. 5. Relevância Ambiental (http://calmariatempestade.wordpress.com/2012/06/22/carne-de-laboratorio/)
  6. 6. Relevância Social
  7. 7. Etapas de Produção - Simplificado
  8. 8. Etapas de Produção - Diferenciação II
  9. 9. Tecido Muscular - Tipos
  10. 10. Miogênese
  11. 11. Tipos Celulares • Células Tronco Embrionárias: – Vantagens: • Em teoria, tem potencial ilimitado de proliferação; (esse potencial poderia ser limitado por mutações genéticas a longo prazo) – Desvantagens: • Processo de diferenciação muito longo e complexo; • Células Satélites: – Vantagens: • Tem maior tendência à proliferação; – Desvantagens: • Adicionam uma fase de diferenciação a mais no processo; • São escassas no tecido muscular; • Mioblastos: – Vantagens: • Já são diferenciadas; • São abundantes; – Desvantagens: • Necessitam de engenharia genética para formarem colônias imortalizadas; • Proliferam-se mais lentamente;
  12. 12. Mecanismos de Regulação Gênica em Eucariotos http://genmol.blogspot.com.br/2011/09/genetica-molecular-sinopse-do-controle.html
  13. 13. Diferenciação do Tecido Muscular In Vitro • Necessidade de Estímulos Químicos: – Proteínas reguladoras; – Fatores de crescimento; – Nutrientes e oxigênio; • Necessidade de Estímulos Físicos: – Ancoramento das células; – Alinhamento correto para a fusão dos Mioblastos; – Contração das células para a formação dos Sarcômeros; Meio de Cultura Telas de Fixação
  14. 14. Meio de Cultura • Deve conter: – Nutrientes; – Hormônios e proteínas de regulação gênica; – Fator de crescimento; – Carregadores de oxigênio; • Desafio: – Custo viável;
  15. 15. Fator de Crescimento • Substâncias que controlam o ciclo celular (transição da fase G0 para G1); • Soro fetal bovino => Implicações éticas inviabilizam o uso em escala • Meios comerciais livres de soro (Ultroger G) => Caro • Meios alternativos (extrato de cogumelo) => Necessita de mais pesquisas
  16. 16. Transportadores de Oxigênio • Atuariam no lugar do sangue para manter concentrações adequadas no meio; • Opções: – Versões modificadas de hemoglobina (produzidas a partir de plantas e micro-organismos geneticamente alterados); – Versões químicas inertes (produzidas artificialmente);
  17. 17. Suporte de Fixação • Promove a ancoragem da célula; • Deve possuir uma textura adequada para promover o alinhamento dos mioblastos; • Poderia ser: – Comestível: • Dispensa etapa de remoção do tecido; • Pode incorporar qualidades ao produto; • Biopolímeros: colágeno, alginato, quitosana etc – Não comestível: • Etapa adicional de remoção das células (biodegradação);
  18. 18. Mecanismos de Contração • Necessários para a diferenciação celular; • Poderiam ser: – Mecânicos; – Químicos (um material que contraísse com variações no PH e Temperatura); – Elétricos (choques no tecido); • Estudos sugerem que estímulos elétricos são a melhor opção, não sendo difíceis de reproduzir em escala industrial;
  19. 19. Espessamento do Tecido – Sistema Vascular Artificial • Células começam a morrer por falta de nutrientes quando o tecido atinge de 2 a 3 mm de espessura; • Para superar esse problema, é necessária a criação de um sistema vascular artificial (a partir de colágeno); • Esse sistema foi possível por meio de processos de microfabricação, difíceis de reproduzir em escala industrial;
  20. 20. No TIO III...
  21. 21. Objetivos • Geral: Estabelecer técnicas que possam contribuir com a viabilidade de produção de Carne In Vitro em escala laboratorial e comercial. • Específicos: 1) Estudar o efeito de diferentes composições de meios de cultura na diferenciação e proliferação dos mioblastos, de modo a contribuir com o desenvolvimento de um meio economicamente viável para produção em escala; 2) Estabelecer protocolos básicos no cultivo de células animais, tais como composição e preparação do meio de cultura, avaliação e contagem de células, análise e separação de subprodutos metabólicos, etc;
  22. 22. Metodologia
  23. 23. 1º - Isolamento das CS • Biópsia do tecido muscular; • Banho enzimático de colagenase tipo II, tripsina e DNAse, diluídas em meio de cultura DMEM pré-aquecido a 37 °C; • CS encubadas em meio de cultura DMEM, a 37°C e 5% de CO;
  24. 24. 2º - Caracterização das Células Satélites e Mioblastos • Marcadores proteicos: – 14 proteínas características expressas na CS: • MyoD, Myf-5, MNF, c-Met, M-cadherin, Pax7, Miogenina, PCNA, Ki-67, Sox-8, CD-34, c-sky, p-27kip, V-rsc – Cada proteína está caracterizada de modo a permitir, além de identificar as CS, reconhecer processos metabólicos específicos de cada fase do ciclo celular • Exemplo: p-27kip - Há uma relação inversa entre a capacidade proliferativa da CS e a abundancia da proteína pk27kip, podendo estar envolvida no crescimento e na hipertrofia muscular.
  25. 25. 2º - Caracterização das Células Satélites e Mioblastos • A sequencia de aminoácidos, tamanho da cadeia, peso molecular e outras informações sobre cada proteína pode ser obtida no site da “RCSB Protein Data Bank” (http://www.rcsb.org/)
  26. 26. 2º - Caracterização das Células Satélites e Mioblastos • Para identificar os marcadores proteicos na cultura celular => Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (SDS-PAGE)
  27. 27. 2º - Caracterização das Células Satélites e Mioblastos • Para garantir que a banda é realmente da proteína de interesse => Western blotting seguido por sondagem com anti-corpos marcados.
  28. 28. 3° - Proliferação da Cultura Primária • Encubação a 37°C; • Alta concentração de fatores de crescimento; • Controle de pH: – O controle é feito por indicador no meio de cultura, de coloração vermelha em pH neutro e laranja ~ amarelo em pH ácido; • Controle da pressão osmótica: – Atmosfera de CO2 e umidade – Diminui o stress das células, diminuindo a evaporação do meio de cultura • Troca parcial periódica do meio de cultura: – Diminuir a concentração de metabólitos (ácido lácteo e amônia); – Reposição de nutrientes;
  29. 29. Determinação da Concentração de Glicose • Método de Bergmeyer e Bernt (1974): I) D-glicose + H2O + O2 -> Ácido D-glucónico + H2O2 II) H2O2 + o-dianisidina reduzida -> 2H2O + o-dianisidina oxidada (castanho) III) o-dianisidina oxidada (castanho) + H2SO4 + -> o-dianisidina oxidada (rosa) – A primeira reação é catalisada pela glucose-oxidase (GOD) e a segunda por peroxidase (POD). – O o-dianisidina atua como corante, e é reduzido por peróxido de hidrogénio a um produto que tem uma cor-de-rosa na presença de ácido sulfúrico (reação 3) e é medido colorimetricamente a 540 nm.
  30. 30. YSI Industrial Analyzer • Análise automatizada de várias alíquotas em simultâneo; • Permite quantificação de glicose, ácido lácteo, amido, glicina etc; • Baseado em métodos amperimétricos
  31. 31. Contagem das células • Hemocitômetro ou contador de partículas eletrônico; • Fases de crescimento da cultura:
  32. 32. 4° - Proliferação em escala • Biorreator adequado para cultura de células animais: – Controle automatizado dos parâmetros; – Sistema de aeração que não cause o cisalhamento das células; • Microcarreadores para células dependentes de ancoragem: – Microesferas de colágeno; • Fator limitante do tamanho do biorreator: – Baixa capacidade de diluição de O2 no meio de cultura;
  33. 33. Cisalhamento em Biorreatores com Aeração Direta
  34. 34. 5° - Diferenciação do Tecido Muscular • As células são semeadas nos suportes; • Dois grupos de ensaios: – Suportes de Colágeno; – Suportes de Alginato; • Os suportes vão para um biorreator especialmente concebido para este fim; • A concentração dos fatores de crescimento é diminuída no meio, o que desencadeia o processo de diferenciação;
  35. 35. Biorreator para a Diferenciação
  36. 36. Biorreator de Fibra Oca Adaptado • Objetivo: maximizar a produção contornando as limitações de oxigenação e fornecimento de nutrientes, que limitam o desenvolvimento máximo do tecido à espessura de 2~3 mm.
  37. 37. Biorreator de Fibra Oca Adaptado • Dois meios de cultura: – Extracapilar: moléculas grandes; – Intracapilar: moléculas pequenas e alta concentração de O2; fluxo mais intenso; • Os capilares seriam confeccionados com o biomaterial comestível do suporte; – Ensaios para avaliar a capacidade dessa confecção (plasticidade, elasticidade, permeabilidade, afinidade com as células etc)
  38. 38. Perspectivas do TIO • Conhecer melhor cada etapa do processo de produção da carne in vitro, e os conceitos práticos e teóricos relacionados; • Contribuir de alguma forma para o desenvolvimento de novas tecnologias; O trabalho que será desenvolvido nos próximos 5 semestres em TIO é de natureza teórica, mas sempre visado uma aplicabilidade prática.
  39. 39. Referências Bibliográficas • BHAT et all, “Prospects for In Vitro Cultured Meat – A Future Harvest”, Principles of Tissue Engineering (cap. 79), 4ª ed, 2014. • POST et all, “Principles of Tissue Engenering for Food”, Principles of Tissue Engineering (cap. 78), 4ª ed, 2014. • BUTLER, Michael. Animal Cell Culture and Technology, 2ª ed, 2004; • FOSCHINI et all. “Células Satélites Musculares”, Arq Bras Oftalmol. 2004; 67(4):681-7; • SANTIAGO et all, “Performance of a vortex flow bioreactor for cultivation of CHO-K1 cells on microcarriers”, Process Biochemistry vol. 46, Jan/2011 • DRURY et all. “Mooney Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications Biomaterials”, 24 (2003), pp. 4337– 4351; • ALBERTS et all. “Biologia Molecular da Célula”, 5ª edição, 2008; • DATAR et all. “Possibilities for an in vitro meat production system”, IFSET – Innovative Food Science and Emerging Tecnologies, n° 11, 2010; • POST et all. “Cultured meat from stem cells: Challenges and prospects” , Meat Science, n° 92, 2012; • TAVARES, Adriana Alexandre dos Santos. “Análise dos Efeitos Terapêuticos dos Electrões de Auger em Culturas de Células”, Tese de Mestrado em Engenharia Biomédica, Universidade do Porto, Julho de 2008; • “Inside the Meat Lab”, Revista Scientific American, n° 108, Junho de 2011;
  40. 40. Grupo • Caio Ricardo • Camile Pedrosa • Euclides Formica • Larissa Gomes • Lucas Nakamura • Lucas Zamian • Lucas Henares • Murilo Oliveira Unesp Araraquara Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia 3° Semestre - 2014

×