Produção de insulina recombinante

Obtenção do Hormônio Insulina a
partir
da recombinação genética
Benerval Gomes
Ellys Regiane
Alexa Laila
Cleyslani
Leyriane

● Em 2014, diabetes
matou mais que HIV,
malária e tuberculose
somados.
Fonte: https://noticias.uol.com.br/saude/ultimas-noticias/redacao/2015/09/17/em-2014-
diabetes-matou-mais-que-hiv-malaria-e-tuberculose-somados.htm?cmpid=copiaecola

● O Diabetes Mellitus é uma das doenças
crônicas que mais avança entre a população
mundial. A Federação Internacional do
Diabetes estima que são cerca de 250
milhões de pessoas com o problema em todo
o mundo – 4% delas (10 milhões) estão no
Brasil. Segundo a Sociedade Brasileira de
Diabetes, 33% da população brasileira dos 60
aos 79 anos de idade têm diabetes ou alguma
alteração relacionada à glicose.
Fonte: http://www.brasil.gov.br/saude/2012/04/diabetes

Os dois Tipos de Diabetes Mellitus:
● Tipo 1: em torno de oito
por cento dos casos, que
começa na infância e
adolescência e não tem
muita relação com a
hereditariedade. Nesse
caso, causa destruição
das células produtoras de
insulina ( hormônio
sintetizado no pâncreas
que promove a redução
da taxa de glicose no
sangue).
● Tipo 2: o mais comum,
incidente em mais de 90%
dos casos, tem relação
significativa com a
genética, com o
envelhecimento, o
excesso de peso e o
sedentarismo. Nesta
modalidade, existe uma
resistência à ação da
insulina no organismo.
● Fonte:
http://bvsms.saude.gov.br/bvs/pu
blicacoes/diabetes_mellitus.PDF

Função da Insulina no Organismo:
● A insulina exerce efeitos diversos sobre o
metabolismo da maior parte dos diferentes tipos de
alimentos – carboidratos, gorduras e proteínas. Sem
a insulina um ser humano não consegue crescer,
em parte por não poder utilizar mais que uma
pequena porção dos carboidratos que ingere, mas
também por suas células serem incapazes de
sintetizar proteínas;
● Promove a entrada de glicose nas células;
● Regula a formação de ácidos-graxos no fígado,
tendo função catabólica na oxidação de açúcares;
● Aumenta a velocidade no transporte de glicose para
dentro das células musculares e do tecido adiposo.

Origem da Produção Industrial de
Insulina:
● Desde o início da década de 1920, os pacientes diabéticos
foram tratados com insulina, que foi purificada de
pâncreas bovino ou suíno.
● O desenvolvimento no campo da engenharia genética
permitiu a produção de insulina em E. coli e levedura, que
foram aprovados para aplicações terapêuticas em
humanos pela FDA.
● Hoje em dia, a insulina humana recombinante é produzida
principalmente em E. coli ou Saccharomyces cerevisiae.
● Utilizando o sistema de expressão de E. coli, os
precursores de insulina (IP) são produzidos como corpos
de inclusão e polipéptidos totalmente funcionais são
obtidos finalmente por procedimentos de solubilização e
reenrolamento.

Continuação...
● A introdução da engenharia genética por Cohen e
Boyer em 1973 estabeleceu o fundamento para a
indústria biotecnológica atual, que se baseia na
utilização de microorganismos ou culturas de
células para a produção de proteínas que podem
servir como produtos farmacêuticos, muitas vezes
referidos como biofármacos.
● Alguns Anos mais tarde, os pesquisadores da
Genentech clonaram os genes de insulina humano e
de hormônio de crescimento e os expressaram em
Escherichia coli, demonstrando a utilidade e
aplicabilidade da engenharia genética na criação de
bactérias geneticamente modificadas que produzem
essas duas proteínas humanas.

Tecnologia de DNA Recobinante na
produção de Biofármacos
Alguns Biofarmacia produzidos por tecnologia
recombinante:
● Insulina humana
● Hormônio de crescimento humano
● Fatores de coagulação do sangue humano
● Vacinas
● Anticorpos monoclonais
● Interferon
● Antibióticos e outros metabólitos secundários

Modificação celular de E. colli para
produzir insulina humana:
● Uma das mais antigas produções tecnológicas recombinante de
DNA;
● Realizado pela Genentech em 1978;
● Utilizava-se antes a insulina extraídas de pâncreas bovinos e suínos,
mas induzia reações imunogênicas;
● Além disso, houve muitos problemas de purificação e contaminação;
● Para superar estes problemas, os pesquisadores inseriram genes de
insulina humana em um vetor adequado (E.colli), que passou a
expressar a proteína insulina semelhante a humana.

Vantagens de usar bactéria E.colli na
produção de biofármacos:
●Muitas referências e experiências disponíveis;
●Ampla escolha de vetores de clonagem;
●Expressão gênica facilmente controlada;
●Crescer com altos rendimentos;
●Produto formado chega até 50% da proteína celular total;
●Pode ser concebido para a secreção em meios de
crescimento permitindo a remoção de indesejados.
Desvantagens:
● Nenhuma modificação pós-tradução;
● Atividade biológica e imunogenicidade podem diferir das
proteínas naturais;
● Alto teor de endotoxina em gram negativos;
● O produto proteico expresso pode causar toxicidade
celular;
● Organismos de inclusão difíceis de processar.

Como o processo de recombinação genética é feito em
laboratório:
● Primeiro: em laboratório genes que codificam o hormônio insulina são
inseridos nos vetores que são moléculas de DNA que se duplicam de
maneira autônoma dentro de uma célula,carregando vários genes, entre os
quais alguns marcadores que permitam reconhecer sua presença dentro da
célula de E.colli.
● Segundo: o plasmídeo recombinante então são transferidos para células de
E.colli.
● Terceiro: uma vez que os inóculos estiverem prontos são levadas ao meio de
cultura em um balão de agitação para que se multipliquem.
● Quarta: o balão de agitação contendo o inóculo então é levado ao agitador de
incubação onde pH e temperaturas são monitoras.

Processo de Bioprodução de
Insulina Humana:
Etapas:
1. Produção em Bancada ou Pequena Escala;
2. Escala piloto;
3. Biorreator (produção em larga escala);
4. Purificação
4.1. Clarificação/filtração/centrifugação
4.2.Concentração e/ou purificação de baixa resolução
4.3. Purificação de alta resolução
4.4.Operações para acondicionamento final do produto
5. Ajuste da potência e adição de excipientes
6. Filtração estéril enchimento asséptico
7. Envase.

1. Produção em Bancada ou
Pequena Escala
● Na grande maioria dos processos industriais de
biofármacos, o desenvolvimento natural parte de
uma escala de produção menor para uma escala
maior. A variação de escala nesse sentido é
conhecida como aumento de escala ou "scale-up".
● Caso contrário, ou seja, quando se está operando
uma instalação industrial e se necessita elaborar
ensaios em pequena escala, a fim de verificar
certos aspectos tem-se a chamada redução de
escala ou "scale-down".
Fonte: BIOTECNOLOGIAINDUSTRIAL. VOLUME 11 ENGENHARIA BIOQUÍMICA

Continuação...
● Na escala de bancada, tendo em vista sua maior
flexibilidade e menor custo de operação, os dados
básicos sobre o processo devem ser levantados
dentro do maior nível de detalhes possível.
● Nessa escala são realizadas tarefas básicas, como
a seleção do microrganismo e o desenvolvimento
do meio de cultura ideal. São também escolhidas
as condições de temperatura e pH para o processo,
assim como a forma de operação do biorreator.

Continuação …..
● Caso o processo seja aeróbio, deve-se conhecer a
velocidade de consumo de oxigênio, a fim de que se
possa dimensionar adequadamente o sistema de
transferência de oxigênio.
● Ainda, esse levantamento de dados deve permitir a
elaboração de modelos matemáticos, a fim de se
poder visualizar o desempenho do processo em
condições não pesquisadas experimentalmente,
através da simulação do modelo, o que também
auxilia o raciocínio nas etapas subseqüentes.

Principais fatores a serem avaliados:
● Temperatura ( em torno de 37ºC)
● pH (em torno de 7)
● Crescimento Bacteriano;
● Taxa de Oxigênio Disponível;
● Composição do meio.
Fases do crescimento bacteriano:
Fase Lag: inóculo adapta-se ao meio;
Fase Log: crescimento, início das divisões celulares;
Fase Estacionária: fim do crescimento ou divisão celular;
Fase de declínio.

Exemplo de aparelhos
usados na produção de
pequena escala.
Ilustração de
variação de
escala.

Biorreatores típicos de cultura de células de bancada

2. Escala Piloto:
Operação é mais onerosa.
Manter constante grande parte das variáveis
do processo de bancada.
Buscar operar na mesmas faixas:
● temperatura;
● pH;
● meio de cultura, etc.

3. Biorreator: A Batelada ou Descontinuado

Sistema a Batelada ou descontínuo de
produção:
O fermentador é carregado com a matéria-prima e o
inóculo correspondentes, a fermentação prossegue até o
esgotamento dos nutrientes.
Concluído o processo e extraído o produto, o fermentador
é esvaziado, limpo e esterilizado antes de receber outra
carga.
A produção em bateladas é bastante utilizada na
indústria
farmacêutica porque o risco de contaminação permanece
relativamente baixo.

Principais Componentes Presentes em
um Biorreator a Batelada:
3.1 Meio de Cultivo;
3.2 Sensores;
3.3 Difusor de ar;
3.4 Chicanas ou quebra vortices;
3.5 Camisas ou serpentinas;
3.6 Agitadores (turbinas ou helices);
3.7 Filtros.

3.1 Meio de Cultivo
A composição do meio de cultura depende das necessidades
metabólicas do microrganismo escolhido. Este deve conter todos os
nutrientes necessários nas concentrações adequadas, que variam em
função do microrganismo e do objetivo do processo.
Composição básica:
●Água;
● Uma fonte de energia e de carbono: glicose (malaço de cana);
● Uma fonte de nitrogênio: inorgânica (sulfato de amônia, nitrato de
potássio etc.), orgânica (asparagina, succinato de amônia,
glutamato, ureia etc.) ou complexa (farinha de soja, peptona etc.);
● Sais minerais, tais como fosfato de potássio , sulfato de magnésio,
cloreto de cálcio (CaCl2) etc;
● Elementos-traço: ferro, zinco, manganês, cobre, cobalto,
molibdênio.
❏ Respiração aeróbia:C6H12O6 + 6 O2 +38 ADP + 38Pi 6 CO2 + 6 H2O + 38 ATP
Glicose

3.2 Sensores:
Sensores fornecem sinais adequados, mesmo sob condições ambientais
complexas, e que indiquem a evolução do processo. Principais sensores:
Temperatura, Acidez (pH) e Oxigênio dissolvido (pO2)
Temperatura:
Devido à estrita
dependência do
crescimento microbiano
para com a temperatura
e pela facilidade de sua
determinação, a
temperatura é a variável
mais frequentemente
medida e controlada.
•Temperatura ideal para o
crescimento da E.colli se dá
na em 37ºC
Acidez (pH):
Como a temperatura,
o pH é frequentemente
controlado nos
processos biotecnológicos,
devido à sua influência na
atividade enzimática
e no metabolismo
microbiano.
• O pH ideal para E.colli é
na faixa de 7.
Oxigênio
Dissolvido (pO2):
Como a solubilidade de
oxigênio em meio líquido é
baixa, o seu fornecimento
ao meio, por transferência
de massa, é de
fundamental importância
para evitar limitações ou
controlar o
desenvolvimento de
processos bioquímicos.

3.3 Difusor de ar:
O suprimento de ar aos fermentadores é feito através de difusores ou
dispersares de ar de vários tipos, sendo os de tubo aberto simples, em forma
de Y ou anel de distribuição, colocados sempre abaixo da última turbina, os
mais frequentemente utilizados.
Os difusores de tubo aberto são os mais frequentemente utilizados em
fermentadores agitados. Nesses casos, o tubo difusor deve ser
preferivelmente afixado centralmente sob a turbina e o mais distante
possível desta, a fim de reduzir o perigo de inundar a turbina em uma
grande bolha de ar com a consequente queda na eficiência da transferência
de oxigênio.

3.4 Chicanas ou quebra vórtices
A colocação de chicanas, quebra-vórtice ou "baffles" em fermentadores agitados
mecanicamente é fundamental, para aumentar a turbulência e, por conseguinte,
uma melhor oxigenação do meio.

3.5 Camisas ou serpentinas;
As camisas como as serpentinas podem ser internas como externas,
neste caso sob a forma de semitubos, têm a finalidade de fornecer calor durante
a esterilização como também retirar calor durante a fase de resfriamento e
manutenção da temperatura de fermentação.
Configurações de transferência de calor para biorreactores: (a) recipiente
encamisado; (B) bobina externa; (C) bobina helicoidal interna

3.6 Agitadores (turbinas ou helices)
As funções do agitador ou agitadores em reatores de fermentação são
múltiplas: homogeneização do meio, mistura da fase gasosa e aquosa, dispersão
do ar, transferência de oxigênio e calor, suspensão de sólidos; enfim, manter
as condições ambientais no meio de fermentação o mais uniforme possível.
A turbina de disco com seis pás planas de Rushton é o tipo mais frequentemente
utilizado.

3.7 Filtros
A esterilização do ar por filtração é, sem dúvida, a solução mais adequada
para a obtenção de altas vazões de ar esterilizado, em virtude dos baixos custos
envolvidos nesta operação, além de se dispor, presentemente, de filtros bastante
confiáveis.
Por esses motivos, a filtração é encontrada em praticamente todas as
instalações industriais, tendo também dominado as aplicações em instalações de
pequeno porte.

4.PURIFICAÇÃO
PURIFICAÇÃO
1. SEPARAÇÃO DE CÉLULAS E SEUS
FRAGMENTOS DO MEIO DO
CULTIVO
2. PURIFICAÇÃO DE BAIXA
RESOLUÇÃO
3. PURIFICAÇÃO DE ALTA
VELOCIDADE
4. OPERAÇÕES PARA
ACONDICIONAR O PRODUTO
CLARIFICAÇÃO/FILTRA-
ÇÃO/CENTRIFUGAÇÃO
ULTRAFILTRAÇÃO
CROMATOGRAFIA DE TROCA
IONICA E GEL FILTRAÇÃO
CRISTALIZAÇÃO

4.1. CLARIFICAÇÃO/FILTRAÇÃO/CENTRIFUGAÇÃO:
Separação de células e seus fragmentos do meio de cultivo
CLARIFICAÇÃO
• A clarificação é a primeira etapa no processo de purificação;
• Consiste na separação da célula do meio de cultivo.

CENTRIFUGAÇÃO:
Células em suspensão de um meio líquido sofrem sedimentação
por ação da força da gravidade (sedimentação);
A centrifugação compreende a aceleração de sedimentação, por
ação de um campo gravitacional centrífugo;
Através da centrifugação resultam suspensões mais concentradas
em relação à original;
A centrifugação baseia-se na diferença de densidade entre a célula
e o meio líquido, na viscosidade do meio líquido, na força motriz
e no diâmetro da partícula;
Na clarificação de microbianas, é utilizada centrifugas tubulares.

CENTRIFUGAÇÃO TUBULAR
Podem operar sob refrigeração, mas possuem capacidade
limitada de volume.

FILTRAÇÃO:
Filtração Tangencial: Microfiltração
Processos de microfiltração onde o fluido de alimentação escoa
tangencialmente à superfície do meio filtrante;
O fluxo filtrado e o coeficiente de retenção de solutos ou sólidos são
influenciados pela formação de um gradiente de concentração de
células ou solutos próximos à superfície da membrana e pelo
“fouling”, que é o bloqueio ou estreitamento dos poros da
membrana resultante da deposição de solutos no interior do meio
filtrante.

TIPOS DE MEMBRANAS
Membrana de fibra oca
Possuem elevada área filtrante por unidade de filtro e são
bastantes susceptíveis à entupimento

Membrana tipo placa e quadro
Possuem pequenas áreas filtrantes por unidade de volume,
são de fácil limpeza e podem ser aplicados em regime
turbulento.

4.2. Concentração e/ou purificação de
baixa resolução
Ultrafiltração:
Compreende a separação da molécula alvo em
relação a moléculas com características físico-
químicas significativamente diferentes.

As moléculas com base no tamanho e forma. A amostra é
colocada na câmara de ultrafiltração, onde fica diretamente acima da
membrana de ultrafiltro.
A membrana por sua vez assenta sobre um suporte macroporoso que
lhe proporciona resistência mecânica.
A pressão é então aplicada, fazendo assim com que moléculas
maiores do que o diâmetro dos poros são retidos no lado a montante
da membrana de ultrafiltro.

4.3. Purificação de alta resolução
• Compreende a separação de classes de moléculas com
algumas características físico-químicas semelhantes;
• Ela normalmente produz 98-99% de pureza. Emprego da
combinação de duas técnicas cromatográficas.
• CROMATÔGRAFIA IÔNICA
• GEL FILTRAÇÃO

CROMATÔGRAFIA IÔNICA
➢ É a mais utilizada porque suas resinas empregadas apresentam elevada
capacidade de adsorção de proteínas.
➢ É um processo de separação baseado na afinidade que componentes de uma
amostra tem com os sítios iônicos em uma matriz sólida. A fase estacionaria,
eletricamente carregada, tem a capacidade de reter solutos que estão na fase
móvel e apresentam cargas de sinais opostos.
➢ Para ocorrer a adsorção de íons da fase móvel na estacionária, controlam-se
fatores como pH e força iônica. Tem sua aplicabilidade muito ampla, já que todas
as proteínas são eletricamente carregadas quando expostas a um determinado
pH.

Gel filtração/Exclusão molecular:
• Consiste na separação de biomoléculas de acordo com seu tamanho
e forma. A coluna contém um polímero com ligações cruzadas com
poros de tamanho definido.
• As moléculas que são maiores migram mais rapidamente que os
menores porque não conseguem penetrar no interior dos poros.
• As moléculas menores, entram nos poros da coluna, levam mais
tempo percorrendo, eluiem tardiamente em relação às maiores.

4.4. Operações para acondicionamento final do produto
➢Cristalização

Cristalização:
• Esse é um processo de agregação de
cristais de moléculas presentes em soluções
homogêneas supersaturadas. Faz a
cristalização porque eles ficam estáveis, e
assim as moléculas são imobilizadas.
Formando assim cristais de insulina e
adicionar os excipientes para a formação do
liquido.

5. Ajuste da potência e adição de excipientes
SOLUÇÃO INJETAVEL DA INSULINA
É adicionado os excipientes:
➢ Glicerol: Solvente
➢ Metacresol
➢ Fosfato de sódio dibásico di-hidratado: fosfato de sódio
dibásico di-hidratado
➢ hidróxido de sódio: Agente alcalinizante
➢ ácido clorídrico (ajuste de pH): agente acidificante
➢ Água para injetáveis

6. Filtração estéril enchimento asséptico
Representação fotográfica de uma máquina de sopro-
enchimento-selagem, que pode ser particularmente
útil no enchimento asséptico de produtos líquidos

➢Milhares de vasilhames serão cheios com a
insulina pronta para o consumo humano. As
insulinas serão colocadas em tubos que serão
usados nas canetas, para facilitar a sua aplicação.

➢ O enchimento do produto nos recipientes do produto
final é realizado dentro da zona do grau A. O
processo de enchimento é altamente automatizado,
não necessitando de contato direto entre o operador e
o produto. Isso minimiza As possibilidades de
contaminação acidental do produto pelo pessoal de
produção.
➢ A insulina pode ser embalada e mantida refrigerada
por meses. Isso faz que haja um estoque para manter
a produção.

➢ As canetas de aplicação da insulina
Todo o processo do enchimento dos vasilhames são feitos por
máquinas. As diferentes partes das canetas são despejadas
em três
torres diferentes, que posicionam as peças automaticamente.
As canetas com insulinas são montadas desta forma:
Dosador na parte debaixo com os números
Acima o recipiente com o injetor que libera a insulina,
Na parte de cima da caneta é encaixada a agulha

➢ Para a produção da insulina pura, até ela sair da fábrica
empacotada, leva em média 7 meses, mas pode chegar a
9 meses ou mais.. A produção sem interrupções garante o
abastecimento constante.
➢ Como leva um grande tempo para poder fabricar a
insulina, são feitos controles e inspeções por funcionários
constantemente, para que tenha o mínimo de perda
possível.
➢ O controle de qualidade pega uma pequena parte de
cada etapa feita, para saber se está dentro do esperado.
➢ Apesar dos processos de fabricação da canetas serem
todos automatizados, os engenheiros fiscalizam cada
etapa também.

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