O documento descreve métodos para expressão e purificação de proteínas recombinantes, incluindo sistemas de expressão como bactérias, leveduras e células de mamíferos, além de técnicas cromatográficas como cromatografia de troca iônica e afinidade utilizadas na purificação. A purificação de uma proteína recombinante de P. vivax expressa em E. coli é apresentada como exemplo.

1. Expressão e Purificação de
Proteínas Recombinantes

2. Farmacêutica e Bioquímica – FCF/USP (2005)
Kátia Sanches Françoso
Mestre em Farmácia (Análises Clínicas) – FCF/USP (2012)
• Projetos de pesquisa – desenvolvimento de vacinas recombinantes,
biotecnologia, imunologia, biologia celular e molecular;
• Modelo procarioto (E. coli);
• Modelo eucarioto (P. pastoris);
• Clonagem, gene sintético, expressão e purificação;
• Transfecção e cultura celular;
• Antigenicidade e imunogenicidade (ELISA e citometria);
• Anticorpos monoclonais.

3. Pesquisa
Científica
Indústria
Vacinas e
Biofármacos
Agricultura
Proteínas Recombinantes
Proteína recombinante é uma proteína expressa a partir de um DNA
recombinante em um sistema heterólogo.

4. Produtos Biofarmacêuticos
Proteína Empresa (s) Fonte (s)
Hormônio do Crescimento Lilly / Serono Cadáver humano
Insulina Humana Lilly / Novo Nordisk Bovina ou suína
Hormônio folículo-estimulante
(FSH)
Serono Urina
Fator VIII Bayer Sangue
G-CSF Achè / Amgen _____________
Vacina Meningite B Novartis _____________
Vacina Hepatite B Merck _____________
Anti-TNF Janssen ______________

5. Sistema de Expressão Vantagens Desvantagens/Desafios
Bactérias
(procarioto)
Baixo custo
Escalável
Condições de cultura simples
Dobramento da proteína – solubilidade
Dificuldade de expressar proteínas de
eucariotos (mamíferos)
Leveduras
Processamento protéico eucariótico;
Escalável (fermentação)
Condições de cultura – simples
As condições de expressão precisam ser
optmizadas
Glicolisação nem sempre é desejada
Células de mamífero Processamento protéico de alto nível
Rendimento (por litro) mais baixo
Condições de cultura complexas
Custo elevado
Células de inseto
Processamento protéico similar ao de
mamíferos
Processo demorado e complexo
Custo mais elevado
Algas
Produção de biocombustíveis,
nutracêuticos e químicos
Tecnologia recente e menos desenvolvida
“Cell-free”
Expressão rápida e mais simples
Sistema aberto - componentes artificiais
Custo elevado para produção em larga
escala

6. Transcrição Tradução
DNA RNA Proteína
Dogma Central
Proteína Recombinante

7. Cromatografia
Técnica de separação de misturas, baseada na passagem da mistura
através de duas fases: uma estacionária (fixa) e outra móvel.
A separação depende da diferença de interação dos analitos entre a
fase móvel e a fase estacionária.
Propriedades Metodologia
Tamanho Gel filtração
Carga Cromatografia de troca-iônica
Hidrofobicidade Cromatografia de fase reversa
Capacidade de interação com metais Cromatografia de afinidade com metal
imobilizado
Reconhecimento específico Cromatografia de afinidade

8. Gel-filtração Interação
hidrofóbica
Troca-iônica Afinidade
Técnicas Cromatográficas

9. Técnicas
cromatográficas
Tipo de interação Eluição Vantagens /
Desvantagens
Gel-filtração
Não há interação
(tamanho molecular) ____________
Não há interferência de pH,
força-iônica ou temperatura;
Pequenos volumes e diluição da
amostra.
Interação
hidrofóbica
Hidrofobicidade
Alteração de pH, força
iônica ou polaridade;
Adição de detergentes.
________________
Afinidade
Antígeno – anticorpo
Hormônio – receptor
Afinidade por íons
metálicos
Ligante compettivo
Alteração de pH, força
iônica ou polaridade
Elevada sensibilidade,
resolução e capacidade de
purificação
Troca-iônica Interação por carga
Alteração de pH ou
aumento da
concentração de sal.
_______________

10. Interação entre a proteína alvo (analito) e um imobilizado na matriz
cromatográfica (fase estacionária), através de interação por carga.
INTERAÇÃO DEPENDE DA CARGA DA PROTEÍNA
Não interage
pH ácido pH básico
Interage com resinas
negativas (trocadores
catiônicos)
Interage com resinas
positivas (trocadores
aniônicos)
ELUIÇÃO:Elevação na concentração de sal ou alteração de pH
Cromatografia de Troca-iônica

11. Expressão e Purificação de
Proteína Recombinante de P. vivax

12. NH2 COOH
MSP119
Cauda de Histidina
Proteína 1 da Superfície do Merozoíta de P. vivax
MSP119
MSP1 - P. vivax
MSP119 recombinante de P. vivax
Plasmídeo
Transformação
E. coli Indução da
Expressão
Rompimento
(sonicação)
Purificação
Afinidade
Purificação
Troca-iônica

13. 116.0
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
PM
14.4
Após sonicação
116.0
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
PM
14.4
Purificação de Proteína Recombinante de P. vivax
116.0
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
PM
14.4
FT WB
Afinidade em Níquel
Troca-iônica

14. Aula Prática
Purificação por Troca-iônica

15. Quais as diferenças entre as
proteínas?
CARACTERÍSTICAS DA PROTEÍNA ALVO
Qual estratégia utilizar?
Proteína recombinante expressa em levedura e secretada no meio
Peso molecular: 53kDa e pI: 6,53
Possui cauda de histidina

16. LAVAGEM ELUIÇÃO
Cromatografia de
troca-iônica
IMIDAZOL
Cromatografia de Afinidade

17. --
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LAVAGEM ELUIÇÃO
NaCL
Cromatografia de Troca-iônica

18. COLUNA
COLETOR
DETECTOR
UV
BOMBA
GE HEALTHCARE
Injeção da amostra
Sistema Äkta-Prime

19. Coluna HiTrap QFF
Trocador aniônico
Solução A (equilíbrio) – Tris-HCl 20mM; pH=8.0
Solução B (eluição) – Tris-HCl 20mM + NaCl 1M; pH=8.0
Proteína dialisada em solução de equilíbrio
Sistema Äkta-Prime

20. Obrigada
katiafrancoso@gmail.com