O documento discute o potencial da terapia celular, especialmente células-tronco mesenquimais, no tratamento de tendinite equina. As células-tronco mesenquimais podem ser isoladas da medula óssea ou tecido adiposo e cultivadas para implante no local da lesão, onde podem promover neovascularização, melhorar a qualidade do tecido tendíneo e acelerar a cicatrização através de fatores de crescimento liberados. Os resultados iniciais sugerem que a terapia celular associada ao plasma r

1. Terapia celular no tratamento de tendinite equina – 2010 Profa. Ana Liz Garcia Alves

2. Terapia celular no tratamento de tendinite equina Profa. Dra. Ana Liz Garcia Alves Departamento de Cirurgia e Anestesiologia Veterinária Email: [email_address]

3. A enfermidade tendínea diminui o desempenho de cavalos atletas e representa um impacto econômico na indústria eqüina.

4. Transferir a força biomecânica dos músculos para o osso, promovendo a movimentação do esqueleto TFDS

5. TENDINITES Manifestações clínicas: Alta incidência do envolvimento do TDFS, em terço médio de metacarpo ou junto a bainha sinovial

6. Incidência de tendinites WILLIANS et al., 2001 ROSS, 2004 1992 N = 1045 (193); 18,5% 2003 N = 1432 (412); 28,8% LAM et al . , 2007 Grock, 2010

7. Tendões: tecido conjuntivo denso Células Fibroblastos /tenoblastos tenócitos células sinoviais células endoteliais Matriz extracelular 90%

8. Tendões: células matriz extracelular Água Fibras colágenas direcionadas longitudinalmente ao eixo tendíneo Substância fundamental Glicosaminoglicanas Proteoglicanas Glicoproteínas multiadesivas

9. Complexo hierárquico H.E. 100x

10. Propriedades biomecânicas grande resistência a tensão elasticidade suporta até 3% de esforço >3% alterações estruturais >8% rupturas

11. Lesão tendínea Reparação lenta Baixa qualidade Altas taxas de recidivas 56% (DYSON, 2004)

12. Fisiopatologia: Lesão com ruptura matriz Hemorragia intra-tendínea Processso inflamatório Proliferação de fibroblastos Angiogênese Produção de colágeno Extrínseca Paratendão

13. Fisiopatologia: Colágeno imaturo Arquitetura desorganizada Fibras de pequeno calibre Tipo III Maturação: aumento de: diâmetro das fibras fibras colágenas tipo I nº de ligações estáveis semanas à meses Média: 8 – 12 sem.

14. REGENERAÇÃO X REPARAÇÃO REPARAÇÃO: reposição com tecido conjuntivo (fibrose; fibroplasia) REGENERAÇÃO: reposição tecidual com igual tipo celular

15. Implante celular Hipótese: Implante intra-tendíneo de células-tronco aumente a produção de matriz tendínea, ao invés de tecido cicatricial, proporcionando um retorno a função estrutural tendínea.

16. Diagnóstico: Exame físico: Inspeção Claudicação Aumento de volume palpação: dor à pressão Ultra-som: localização evolução e tamanho exatos da lesão

17. Área da lesão = 31,04mm2 Área do tendão = 97mm2 Porcentagem da área de lesão = 30% Esquema do cálculo da porcentagem da área da lesão

18. Estratégias terapêuticas Fase inflamatória Minimizar inflamação e limitar ação de enzimas proteolíticas Fase fibroblástica Estimular a formação tecidual de boa qualidade Regeneração Fase remodelamento Restabelecer função sem recidiva (atividade física apropriada)

19. Tratamento: Lesão aguda: GELO (inibe ou reduz o P.I.) vasoconstrição - diminui hemorragia e reduz efeitos de mediadores inflamatórios ativa as endorfinas interrompe espasmo muscular resultante da dor Aplicar por em média 20min, 2 - 3x/dia + bandagem

20. Hidroterapia: Esteira / Game ready Mikail, 2007 Compressão cíclica em conjunto com água gelada A compressão cíclica estimula a drenagem linfática e auxilia a dirigir o frio em tecidos mais profundos (DAHLGREN, 2009)

21. Tratamento : antiinflamatórios não esteróides: Flunixin meglumine Fenilbutazona Ketofen Meloxican esteróides (devem ser evitados): retardam a cicatrização provocam mineralização distrófica (localmente) Dmso: ("capta radicais livres") IV, oral e local

22. ENGENHARIA TECIDUAL Célula tronco Meio Adequado Scaffold Fatores de crescimento Franz Marc

23. Células tronco São células que possuem a capacidade de se dividir dando origem a células semelhantes às progenitoras e de se diferenciar em outros tipos celulares diferenciação replicação célula tronco célula especializada célula tronco Identificada ( FRIEDENSTEIN, 1966 )- (JOHNSTONE et al, 1998)

24. Classificação das células tronco quanto a diferenciação

25. Células tronco pluripotentes induzidas (iPS) São células do organismo adulto que foram reprogramadas geneticamente para se comportar como células pluripotentes

26. Célula tronco adulta Célula tronco hematopoiética (CTH): isolada da MO, sangue periférico, sangue do cordão umbilical. Tem a capacidade de originar todos os tipos celulares sanguíneos Célula tronco mesenquimal (CTM): isoladas da MO, tecido adiposo, tecidos fetais, e outros tecidos adultos. São diferenciadas in vivo e in vitro em osteoblasto, adipócitos, condroblasto e mioblasto

27. EMBRIONÁRIAS TOTIPOTENTES Blastocisto Proliferação in vitro sem diferenciação Diferenciadas de acordo com as condições de cultivo Laboratório de Reprodução Animal FMVZ WAKITANI et al.2003: Formação de tumores

28. diferença * Célula tronco adulta * Célula tronco embrionária * Pode ser extraída no indivíduo adulto para implante autólogo * Menor risco da formação de teratomas nos implantes * Não necessita da destruição obrigatória do embrião (blastocisto) para a sua obtenção * Por ser pluripotente tem a capacidade de se diferenciar em diversos tipos celulares * Maior facilidade no cultivo e na diferenciação celular * Maior resistência a períodos longos de cultura

29. Células tronco Células embrionárias ? X Células cordão umbilical ? X Células mesenquimais ? Medula ? X Tecido gorduroso ? Células mononucleares ?

30. Células mesenquimais Potencial terapêutico nas lesões ortopédicas dos eqüinos em função de sua habilidade de Auto renovação e diferenciação.

31. Implante celular Qual a fonte celular mais apropriada? O implante deverá ser autólogo? Devemos expandir o número de células coletadas? Qual a melhor via de introdução dessas células? Por quanto tempo duram os efeitos benéficos das terapias? Podemos repetir os procedimentos? Em que fase da tendinite devemos aplicá-las? Qual o volume a ser administrado? O implante pode ser realizados apenas em lesões focais?

32. Tipo de implante Heterólogo Autólogo

33. DAVIS (1996) PERÍODO DO IMPLANTE

34. IMPLANTE CELULAR Células mesenquimal da medula óssea Isolamento e expansão (células mononucleares) 4 X 105 células Transplante imediato – pool celular Cultura e diferenciação 4 – 50 X 106 células Isolamento das células 3 – 4 semanas de cultivo

35. Coleta de células mesenquimais Sedação Analgesia local Introdução da agulha Jamshidi (8G e 5 cm) Coleta de sangue da MO em seringa com heparina Envio da amostra resfriada

36. Coleta de células mesenquimais

37. CTM derivadas da medula óssea Separação das células mononucleares em gradiente de densidade (Ficoll Hypaque) Realizado a contagem celular e a viabilidade celular no hemocitômetro As CTM são colocadas em cultura para expansão e isolamento Meio de cultura é trocado a cada 3 dias (sobrenadante é descartado) Aguarda a confluência mínima de 70% para realizar a tripsinização

38. Separação da fração mononuclear Ficoll Hypaque: – Filtragem – Centrifugação refrigerada – Separação Botão celular contendo a fração mononuclear

39. Identificação celular Citologia Zago&Covas, 20006 Microscopia confocal

40. Teste de viabilidade celular Azul tripan meta = 95%; média 86% 30µm

41. Preparo para o implante Volume: 0,7ml suspensão celular diluído em soro autólogo

42. CTM derivada da medula óssea 100x

43. Células mesenquimais em cultura Laboratório de Reprodução Avançada e Terapia Celular FMVZ – UNESP - Botucatu

44. Coleta do tecido adiposo na base da cauda Tricotomia e anti-sepsia da base da cauda Sedação e bloqueio anestésico local Incisão de aproximadamente 10 cm de comprimento ao lado da base da cauda

45. Separação da fração vascular estromal Realizado vários cortes no tecido adiposo Adição de solução de 2mg/ml de colagenase tipo 1 Adição de solução 10% de SFB Lavagem Contagem celular e viabilidade celular

46. Separação da fração vascular estromal

47. Plaqueamento das CTM derivadas do tecido adiposo 400x

48. Plaqueamento das CTM derivadas do tecido adiposo 200x 100x

49. Implante no local de lesão

50. Injeção de células mesenquimais no tendão flexor digital superficial

51. Comparação entre as principais fontes de CTM Medula óssea Tecido adiposo Apresenta maior grau de diferenciação Separação das células mononucleares em gradiente de densidade (Ficoll Hypaque) Maior concentração de CTM Maior crescimento em cultura Separação das células mononucleares por digestão enzimática (colagenase tipo 1)

52. IMPLANTE CELULAR FONTE: Tecido adiposo (TA) Medula óssea (MO) Número de células TA = 6 milhões/ cm3 de tecido MO = 40 milhões/aspirado Prevalência céls. TA = 1 / 4000 cels. nucleadas MO = 1/20000 cels. nucleadas. Aspirado TA 1500 MO 2000 DAHLGREN et al., JAVMA, 2005 FRISBIE et al., ESVOT 2005

53. Richardson, L.E. et al. Stem cells in veterinary medicine – attempts at regenerating equine tendon after injury . TRENDS in Biotechnology, vol.25, n.9, august, 2007. Pool celular – fonte tecido gorduroso 48 horas para retorno das células ao veterinário EUA Células mesenquimais - fonte medula óssea 10x106 cels. em cultura ou 50 x 106 cels. 3 semanas para retorno das células ao veterinário INGLATERRA, EUROPA E AUSTRÁLIA

54. AÇÃO COMPROVADA DA CTM fatores de crescimento (VEGF) Neovascularização imunomodulação Melhora histológica do tecido tendíneo Não foi provado que a CTM implantada se diferencia no tipo celular do tecido implantado

55. PLASMA RICO EM PLAQUETAS (PRP) Plaquetas são corpúsculos anucleados, com a forma de disco (2-4 μm), derivadas de células gigantes e multinucleadas da medula óssea, os megacariócitos Fonte autógena de fácil aquisição e de baixo custo Derivada do sangue total e deve conter cerca de 3 a 5 vezes mais plaquetas que os níveis fisiológicos Varia de 100.000 - 350.000 plaquetas/ μL nos eqüinos

56. PLASMA RICO EM PLAQUETAS Coleta de 81 ml de sangue total (citrato de sódio) Centrifugação Formação de 2 porções: o sobrenadante e a fração remanescente (PRP) Remoção de 50% do plasma sobrenadante e posterior centrifugação.

57. PLASMA RICO EM PLAQUETAS A plaqueta está em sua forma inativa Adiciona-se gluconato de cálcio para a ativação das plaquetas Liberam diversos fatores de crescimento (TGFβ, PDGF, EGF, VEGF)

58. IMPLANTE TENDÍNEO DO PRP Pode ser feito até 3 implantes (com intervalo de 15 a 21 dias) Controle ultrassonográfico (obs. necessidade + aplicações) O volume pode ser distribuídos conforme o tamanho da lesão

59. CONSTATAÇÕES PRINCIPAIS SOBRE TERAPIA CELULAR NA TENDINITE EQÜINA Realizar o implante entre 30 e 45 dias após lesão Implantar entre 10-30 x 106 células É interessante associar as CTM ao Plasma Rico em Plaquetas (PRP) Não recomendado o implante das células mononucleares (células inflamatórias)

60. CLÍNICO RESULTADOS FUNCIONAL

61. Avaliação ultra-sonográfica Doppler Terapia celular 14 dias Terapia celular 21 dias

62. Avaliação do implante: Biópsia Tendínea

63. Imunomarca ç ão nuclear para o anticorpo Ki-67 (clone MIB1), BC, DAB contra colora ç ão Hematoxilina, observado ao microsc ó pio ó ptico 400x. T – Grupo tratado. C – Grupo controle. C T Proliferação celular BARREIRA, 2005 – Tese de Dourorado 30µm RESULTADOS

64. RESULTADOS: Presença de neovasos H.E. 40x H.E. 40x Grupo tratado Grupo controle

65. Perspectivas Futuras Estágio clínico – avaliação dos efeitos Domínio das diferentes fases do implante Qualidade tecidual Abordagem racional C él ulas embrion á rias Regeneração com sucesso

66. Terapia celular

67. REFERÊNCIAS ALVES, A.L.G. et al. Effects of the betaaminopropionitrile fumarate and exercise on equine tendon healing: gross and histological aspects. J. Equine Vet. Sci. , v.21, n.7, p.335-340, 2001. ALVES, A.L.G. et al. Protocolo de isolamento de células mononucleares de medula óssea de eqüinos. Veterinária e Zootecnia, v. 16, p. 650-655, 2009. ALVES, A.L.G. et al. Tendon splitting surgical treatment on experimental equine acute tendinitis. Arch. Vet. Sci. , v.7, n.2, p.45-51, 2002. ALVES, A.L.G. Influência da beta-aminopropionitrila associada à atividade física na reparação de eqüinos após agressão pela colagenase . Análise ultrassonográfica e morfológica. 1998. 92f. Tese (Doutorado) – Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista, Botucatu. AVELLA, C.L. et al. Ultrasound evaluation of stem cell treated tendon injuries in the horse: repair or regeneration? Ultrasound , v.17, p.74-79, 2009. AVELLA, C.S. et al. 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68. Tratamento Cirúrgico: diminuir a inflamação inicial Drenagem (Splitting) tendíneo Estudar o tamanho da lesão

69. Tratamento Cirúrgico Splitting Indicado para o tratamento de tendinite crônica Utilizado para a drenagem de hematoma intra-tendíneo Após a cirurgia animal deve utilizar bandagem e permanecer em repouso por duas semanas

70. Tendinite FDS e espessamento ligamento anular Manifestações clínicas:

71. Tratamento Cirúrgico: Desmotomia do Anular - aplicação : tendinite distal ou tenossinovite crônica

72. Associações terapêuticas Anti-inflamatórios Reabilitação Sinergismo: tensão mecânica + Proliferação celular

73. Manipulação física: Exercício Laser Ultra-som Ondas de choque Estímulo elétrico

74. Atividade física DAVIS (1996)

75. REGENERAÇÃO Conceitos atuais: necessidade de descoberta dos fatores que determinam o sinal para a divisão celular de células estáveis e permanentes. Conceitos fixos: determinadas estruturas “nunca regeneram ” Microscopia confocal Elisabeth Ehler 2006