Medicina regenerativa humana e veterinária no tratamento de lesões da medula espinhal Maringá

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA, GENÉTICA E BIOLOGIA CELULAR
ESPECIALIZAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
JULIO CEZAR BUSIGNANI
Medicina regenerativa humana e veterinária no tratamento de lesões da
medula espinhal
Maringá
2016

medula espinhal
Trabalho de conclusão de curso apresentado ao
curso de Especialização em Biotecnologia do
Departamento de Biotecnologia da Universidade
Estadual de Maringá como requisito parcial para
obtenção do título de Especialista em
Biotecnologia.
Orientador: Prof. Me. Julio Cesar Polonio
Maringá
2016

medula espinhal
Trabalho de conclusão de curso apresentado ao Programa de Pós-graduação Especialização
em Biotecnologia do Departamento de Biotecnologia da Universidade Estadual de Maringá,
como requisito parcial para obtenção de título de especialista pela comissão julgadora
composta pelos membros:
COMISSÃO JULGADORA
Prof. Dr. .....................
(colocar universidade onde trabalha)
Aprovado em:
Local da defesa:

AGRADECIMENTOS
Agradeço, primeiramente a Deus, por estar sempre presente, dando-me força e sabedoria.
Obrigado Senhor, por permitir-me chegar até aqui, por ter sempre me acompanhado durante a
jornada de minha vida.
À Universidade Estadual de Maringá, em especial ao Departamento de Biotecnologia pela
possibilidade de realizar este curso e pela possibilidade de sentir-me motivado para novos
desafios.
Agradeço aos professores em nome do Coordenador: Prof. Dr. João Alencar Pamphile pela
amizade que desempenharam com dedicação às aulas ministradas.
À minha esposa, Tânia Mara Vendramini Busignani, pela dedicação em me fortalecer para
continuar durante toda esta caminhada e por me apoiar, ajudar e confortar em todos os
momentos de dificuldade.
Ao meu orientador, Mestre e doutorando Júlio Cesar Polonio, pela paciência, dedicação,
conselhos, amizade, pelo exemplo de dedicação e empenho ao ensino e à pesquisa.Aos
colegas de curso, que são muitos para aqui serem citados, pela amizade, apoio e demonstração
de companheirismo.
Agradeço à secretária do departamento Sra. Edenir Ferreira P. Antonio pela amizade, carinho
e atenção disponibilizada na condução e suporte do curso.
Às minhas filhas, Manuela e Marina, por compreender a minha ausência nos momentos em
que precisei dedicar-me aos estudos.

medula espinhal
RESUMO
As lesões e as doenças da medula espinhal, na medicina veterinária e humana, classicamente,
sempre tiveram um prognóstico sombrio. Esse prognóstico não diz repeito somente à natureza
da doença, mas também à dificuldade de indicar tratamento, uma vez que se refere a um órgão
extremamente sensível à manipulação direta. As descobertas sobre como as células-tronco
adultas imunomodulam os sinais moleculares proporcionaram evidenciar os efeitos
parácrimos envolvidos na reparação dos tecidos lesados. Existem, porém, problemas éticos
relacionados às células-tronco obtidas de embriões, que estão sendo transpostos por outras
fontes de célula-tronco estudadas, principalmente oriundas das células somáticas adultas ou
estaminais do tecido adiposo, da polpa dental e do bulbo olfatório. Foi demonstrado em
vários trabalhos, a capacidade de se diferenciar em uma variedade de tecidos, incluindo ossos,
cartilagem e neurônios. Verificou-se que células-tronco adultas são encontradas em todos os
animais com capacidade de manter e reparar tecidos danificados. No entanto, ao se tratar de
implante em medula com injúria, o contato das células-tronco, no local, produzem uma
variedade de fatores bio-ativos que contribuem nos resultados positivos da reparação. Como a
busca da cura para a paralisia ainda permanece indefinida, há resultados encorajadores, os
quais contribuíram para aumentar os interesses na terapia regenerativa. Portanto, nesta revisão
serão retratadas as terapias que utilizam células-tronco, com ênfase nas células estaminais
adultas induzidas, os resultados experimentais na regeneração em injúrias da medula espinhal,
aplicados em modelos animais, com perspectivas futuras para a medicina humana, os tipos de
células-tronco mais comumente usados, além dos obstáculos que essas tecnologias
enfrentarão.
Palavras-chave: Célula-tronco. Lesão medular. Veterinária. Regeneração celular.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Comparação entre os possíveis efeitos que as lesões na medula podem causar em
humanos e cães. (Fonte: O autor)............................................................................................. 12
Figura 2. Estratégias de reprogramação celular para terapia genética/celular.........................21

LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Tipos de células estaminais mais importantes ........................................................14

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
BO bulbo olfativo
CEE células estaminais embrionárias
CEM células estaminais mesenquimais
CETA célula estaminal do tecido adiposo
CEO células ensheathing olfativas
CEPi células estaminais pluripotentes induzidas
CFD células do folículo dental
CPE célula progenitora endotelial
CPN célula progenitora neural
CT células-tronco
CTA células-tronco adultas
CTAc célula tecido adiposo canino
CTAH célula do tecido adiposo humano
CTCU célula-tronco do cordão umbilical
CTD célula-tronco dental
CTDTc células-tronco derivadas do tecido adiposo canino
CTE célula-tronco embrionária
CTH células-tronco hematopoiéticas
CTM células-tronco mesenquimais
CTN células-tronco neural
CTNa células-tronco neural adulta
CTMO células-tronco da medula óssea
CTPD células-tronco da polpa dental
DPC duplicações da população celular
DPS duplicação populacional
LME lesão da medula espinhal
PBM proteína básica de mielina
PEG polietilenoglicol
PPL proteínas protoeolíticas
SNC sistema nervoso central

SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ……………………………………………………………………...09
2 METODOLOGIA………………………………..........................................……….10
3 REVISÃO DE LITERATURA ……………………...........................……………..10
3.1 As lesões da medula vertebral e sua fisiopatologia...............................................10
3.2 As células-tronco adultas ou somáticas................................................................13
3.3 As células-tronco específicas ou células-tronco neurais.......................................15
3.4 As células-tronco estaminais ou germinativas....................................................16
3.5 As células-tronco estaminais pluripotentes induzidas ........................................20
3.6 As aplicações médicas das células CEPi ...............................................................20
3.7 As células-tronco extraídas do tecido adiposo .....................................................23
3.8 As células ensheathing olfativas (CEO).................................................................24
4 PERSPECTIVAS E DESAFIOS TÉCNICOS ........................... ............................29
5 CONCLUSÃO ...........................................................................................................32
REFERÊNCIAS ............................................................................................ ..............32

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1 INTRODUÇÃO
Ao final do século XIX, o histologista e neurocientista Santiago Ramón y Cajal
(Nobel de medicina de 1906) estabeleceu o dogma central de neurologia em 1923: "O sistema
nervoso central é uma estrutura fixa, estável e imutável”(COLUCCI-D’AMATO et al., 2006),
isto é, novos neurônios não são possíveis de adição ou regeneração no sistema nervoso central
(SNC), ideia que prevaleceu durante vários anos (GOEL, 2016).
Recentemente, essa crença tem sido contestada por um número de estudos que
mostram que áreas limitadas do SNC adulto são, de fato, capazes de regeneração. Mesmo
mudando esse conceito, a realidade curativa em que se propõe alcançar mostra um longo
caminho a ser percorrido até o alcance da realidade da cura completa e efetiva. Isso se deve,
uma vez que os ensaios pré-clínicos demonstram para uma pouca reparação celular, em lesões
no SNC, resultando em prognósticos pouco favoráveis (KEYVANI et al., 2006).
As células-tronco (CT), por definição, são capazes de se auto renovar e se diferenciar
em vários tipos de células, apresentando, assim, uma solução valiosa para doenças do SNC,
como precursoras de neurônios e células da glia, essas últimas agindo como suporte
nutricional para o implante aos novos neurônios (RITFELD et al., 2011).
Trata-se de células primitivas, que durante o desenvolvimento do organismo dão
origem a outros tipos celulares geradores de diversos tipos de tecidos. Tais células possuem a
capacidade de autorreplicar – gerando cópias idênticas de si mesmas – e de se diferenciar em
vários tecidos (MONTEIRO et al., 2010). Elas podem ser classificadas quanto ao seu poder de
diferenciação: as totipotentes, as quais podem se diferenciar em todas as células embrionárias
e extraembrionárias; as pluripotentes, que podem produzir todos os tipos celulares do
embrião; as multipotentes, que podem gerar células de várias linhagens; as oligopotentes, que
podem produzir células dentro de uma única linhagem; e as unipotentes, que produzem
somente um único tipo de célula (GRINFELD e GOMES, 2004).
As células-tronco ainda oferecem a possibilidade de atuar como fonte de reposição de
células em tecidos danificados para tratar doenças como, o mal de Parkinson, o traumatismo
da medula-espinhal, os infartos, as queimaduras, as doenças do coração, o diabetes, as
osteoartrites, a artrite reumatóide entre outras (GRINFELD e GOMES, 2004). Observa-se
ainda, uma capacidade de desenvolver órgãos inteiros em laboratório e servir de modelos para
estudos e de implantes, na substituição de órgãos danificados (NARDI, 2007).

10
Em medicina veterinária, a administração de células-tronco, em clínicas, já é uma
realidade. Isso pode ser interpretado como uma evidência de ser uma terapia promissora,
como modelo no tratamento de doenças crônicas humanas (FORTIER, TRAVIS, 2011;
MARKOSKI, 2016).
Portanto, essa revisão, tem por objetivos retratar as terapias que utilizam células-
tronco com ênfase em células adultas induzidas, em resultados pré-clinicos, na medicina
regenerativa, especificamente, em resultados da medula espinhal com perdas da sensibilidade
e função motora, aplicadas em modelos animais. Também serão discutidas as perspectivas
futuras para apliacação na medicina humana, os tipos de células-tronco mais comumente
usadas, bem como os resultados experimentais, além das dificuldades que limitam essas
tecnologias.
2 METODOLOGIA
Utilizando os critérios de inclusão e exclusão pré-especificados com palavras-chaves,
foram identificadas as publicações que relatam as experiências relevantes ao tema. Tais
experiências foram selecionadas, independente do ano de publicação, por meio de pesquisas
limitadas àquelas indexadas, com a descrição de experiências com animais e possíveis
aplicações em seres humanos. A ferramenta utilizada para pesquisa e gerenciamento dos
documentos foi o software Mendeley sob as versões desktop e on-line.
3 REVISÃO DE LITERATURA
3.1 As lesões da medula vertebral e sua fisiopatologia
A história das lesões da medula espinhal começa com os antigos papiros cirúrgicos,
como os de Edwin Smith e os escritos médicos que descrevem a lesão como "vértebra
esmagada em seu pescoço". Essas lesões, bem como os sintomas de deterioração neurológica,
tratadas com massagens permaneceu como terapia até o fim da Segunda Guerra Mundial,
quando o primeiro centro de reabilitação voltado ao tratamento de pacientes com lesões na
medula espinhal foi aberto (ANDERBERG et al., 2007).
Sabe-se que a medula espinhal é o principal condutor de sinais ou impulsos nervosos
entre o cérebro e o corpo. As lesões que podem ocorrer são completas ou parciais, privando o
indivíduo da mobilidade e de estímulos sensoriais, bem como do controle do sistema nervoso

11
autónomo nas regiões abaixo do nível da lesão (Figura 1). Mas leva-se em conta o grau e a
localização em humanos, uma vez que a maioria das lesões da medula espinhal afeta os
segmentos cervicais, tornando os pacientes paraplégicos ou tetraplégicos (BARNABÉ-
HEIDER e FRISÉN, 2008).
Em cães, sua maior frequência está associada a lesões de impacto súbito, como por
exemplo, quando o animal é atingido por um automóvel. Em lesões primárias, na coluna,
podem ocorrer lacerações da medula, compressão da coluna (a partir do disco ou coágulo e
até mesmo seu rompimento), abalo da coluna associado à fratura vertebral ou hérnia de disco,
afetando o fluxo sanguíneo por coágulos levando à embolia (KARIMI-ABDOLREZAEE et
al., 2006).
As lesões na medula espinhal (LME) são classificadas de acordo com o tempo de
ocorrência, desde a lesão inicial: aguda - dentro de alguns dias de LME; subaguda - uma a
duas semanas após a lesão; ou crônica - quatro semanas ou mais após a lesão. Essa
classificação é importante para determinar as estratégias de transplante de células (BEN-HUR
et al., 2010).
Vale lembrar que, o trauma medular também se classifica em duas fases: a primária e
a secundária. A fase primária (mecânica) corresponde essencialmente a ruptura da arquitetura
normal da medula espinhal, na qual gera danos aos neurônios (THURET et al., 2006). Já a
fase secundária pode durar de alguns minutos a vários meses, resultando em isquemia e
resposta inflamatória.
A extensão do impacto e o grau da lesão neuronal secundária são fatores
determinantes na funcionalidade do tecido. Eles provocam o desequilíbrio da homeostase
iónica, com o acúmulo de neurotransmissores, como o glutamato, um neurotransmissor
excitatório do SNC, que em excesso, contribui para o bloqueio parcial ou completo na
condução axonal dos impulsos nervosos. Isso pode gerar sequelas motoras e sensitivas,
observadas em pacientes com LME (OYINBO, 2011).
Logo que o dano ocorre, agentes neurorregenerativos tendem a agir para promover o
crescimento axonal. ATP (trifosfato de adenosina) e "subprodutos da necrose celular são
liberados (ATP, DNA, e K +
), criando um ambiente citotóxico pós-lesão ativado pelas células
da microglia, recrutando mais fagócitos (AHUJA et al., 2016). Isso torna o ambiente da lesão
desfavorável às células transplantadas, como também a falta de promotores para a
implantação das células-tronco torna a abordagem dependente de uma preparação no local da
ferida medular para a fixação , sobrevivência e proliferação das células (EFTEKHARPOUR
et al., 2008).

12
Figura 1. Comparação entre os possíveis efeitos que as lesões na medula podem causar em
humanos e cães (Fonte: O autor).

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Diante destas condições, uma das opções seria a utilização de medicamentos, tais
como a eritropoietina e minociclina, que demonstraram, em ensaios pré-clínicos em modelos
animais, propriedades neuroprotetoras (KWON et al., 2005). Os rearranjos, que ocorrem nos
canais iônicos ao longo dos axónios, prejudicam ainda mais a propagação dos potenciais de
ação (NASHMI e FEHLINGS, 2001). Assim sendo, com a cronicidade da lesão uma cicatriz
é formada por células mortas formando uma barreira física impedindo a substituição por
células regenerativas .
Estruturas integras dos neurônios, como as bainhas de mielina, são fundamentais para
que ocorra a condução dos impulsos elétricos (SEKHON e FEHLINGS, 2001; GLEDHILL et
al., 1973), sua regeneração é fundamental para recuperação das funções (PLEMEL et al. 2014
; SIDDIQUI et al., 2015).
Dasari e colaboradores (2007) investigaram a remielinização axonal em lesões da
medula espinhal por meio da utilização de células-tronco do cordão umbilical (CTCU) e
demonstraram que a diferenciação dessas em neurônios, oligodendrócitos e astrócitos,
promovem o aparecimento de bainhas de mielina. Elas são encontradas em torno dos
axônios, quando aplicadas nas áreas lesionadas da medula espinhal, pelo fato de induzirem a
síntese de proteína básica de mielina (PBM) e proteínas proteolíticas (PPL), e promovem, na
área da lesão, a formação de mielina, recuperando a função locomotora (DASARI et al.,
2007), como também recupera a integração das vias aumentando a velocidade da condução
nervosa.
3.2 As células-tronco adultas ou somáticas
No indivíduo adulto, diferentes tecidos possuem a capacidade de renovação e
reparação total ou parcial (Tabela 1). Exemplos são: o sangue e a epiderme, que estão
constantemente se renovando. Em contrapartida, enquanto alguns tecidos, como o hepático,
podem ser reparados por completo, outros como músculos e tecidos nervosos apresentam um
potencial reduzido de auto reparação (NARDI, 2007).
Verifica-se que essa característica está relacionada com a presença de células-tronco
que se encarregam da reparação, proliferando as chamadas células tronco adultas (CTA) ou
células-tronco somáticas (WAGERS e WEISSMAN, 2004). A aptidão clonogênica capacita
essas células a renovar as estruturas dos tecidos que vão morrendo ao logo da vida
(MARKOSKI, 2016; BYDLOWSKI; et al., 2009).

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Tabela 1. Tipos de células estaminais mais importantes
Tipos de
células
Capacidade
de
diferenciação
Fonte de
obtenção
Vantagens Desvantagens Referência
Célula-tronco
embrionária
Pluripotentes Blastocisto Pluripotencia Dificuldades
éticas e
biofabricação
(VAZIN;
FREED, 2010;
MURRY;
KELLER, 2008)
Progenitores
neurais
Multipotentes Tecido fetal
embrionário
Questões
éticas e
biofabricação
(WALTON, N.
M.;et al., 2006)
Células-tronco
do sistema
nervoso
central
Multipotentes Tecido do
Sistema
Nervoso
Central
Autóloga, não
há questões
éticas
impedindo
Diferenciação
limitada;
questões de
biofabricação;
coleta evasiva
(GARZON-
MUVDI, et al.,
2009)
Células-tronco
mesenquimais
adultas
Multipotentes Medula óssea
(adultas)
Autólogas, de
fácil obtenção,
sem
preocupações
éticas
Potencial
limitado em
diferenciar-se;
biofabricação
dificultada
(CAPLAN,
2007)
Células-tronco
do cordão
umbilical
Multipotentes Cordão
umbilical
Autólogas,
sem
preocupações
éticas
Potencial de
diferencial
limitado
(WITKOWSKA-
ZIMMY, 2011)
Células
estaminais
pluripotentes
induzidas
Multipotentes
e Pluripotentes
Pele;
Tec.
gorduroso;
Entre outras
Autólogas,
sem
preocupações
éticas; Grande
potencial de
pluripotencia
Requerem
adição de
vetores virais
para
pluripotencia
induzida;
biofabricação
complexa.
(VERMA;
VERMA, 2011)
Com a função de manter a homeostase do tecido, receptores de superfície avisam às
células, quando ocorre uma lesão do órgão ou tecido, havendo a migração destas CT para
reparar ou substituir as áreas afetadas (WALSH e ANDREWS, 2003).
Essas células são indiferenciadas no meio de tecidos diferenciados, até a sua
especialização nos processos de crescimento, renovação e reparo. Um exemplo clássico é a
recuperação do fígado, após a perda da massa tecidual (WAGERS e WEISSMAN, 2004). As
CTA possuem algumas vantagens se comparadas com as células embrionárias, como: maior
facilidade de seu isolamento e a purificação; sem haver impedimento legal por questões éticas
e plenamente aceita em atividades experimentais; a possibilidade de obtenção autóloga com
menor imunogenicidade e rejeição, extraída de várias fontes teciduais, possivelmente, com
menor capacidade de formação de teratomas (tumores germinativos) (WAGERS e
WEISSMAN, 2004).
Barzaga et al. (2016) demonstraram o potencial de células estaminais de tecidos
adiposos (CETA) como fonte abundante de células para uso na terapia regenerativa, gerando

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células progenitoras endoteliais (CPE) e células progenitoras neurais (CPN), tecido com
grande volume e de fácil obtenção em modelos animais com grande reserva como os suínos
(ZUTTION et. al).
As CTA em embriões são isoladas em fase de blastocisto, porém enfrentam problemas
éticos, quanto à sua utilização (NARDI, 2007; OSTENFELD e SVENDESEN, 2003). Já os
tecidos provenientes da polpa dentária tem se mostrado fonte de CT, igualmente ao tecido
adiposo. Sua extração tem pouca invasão e dor, pois são provenientes do descarte de materiais
ortodônticos (YAO et al., 2004). Enquanto as células olfativas ensheathing COE,
semelhantes à macroglia neural, tem se mostrado também como uma estratégia terapêutica
(KAWAJA et al., 2009) e com grande capacidade de promover a reparação neural, em
conjunto com a bioengenharia (NOMURA et al., 2006). Tabakow et al. (2014) relatam que
COE autólogas têm sido usadas com sucesso para permitir que pacientes paralisados voltem a
andar novamente. Na medula óssea podemos encontrar duas populações distintas de CTs, as
quais coexistem de maneira funcional e interdependente: as células-tronco hematopoiéticas
(CTH) e as células-tronco extraídas do estroma da medula óssea (CTMO), são as mais
utilizadas nas terapias celulares. As CTMO são consideradas seguras devido seu baixo risco
em transformações malignas (NARDI, 2007).
3.3 As células-tronco específicas ou células-tronco neurais
Em outros tempos, acreditava-se que o sistema nervoso não se regenerava, sendo
incapaz dos neurônios se autorenovarem, ou seja , não ocorria a aneogêneses neural. Esse
fenômeno só ocorria apenas nos primeiros estágios embrionários e não de forma completa, ou
seja, o indivíduo nascia com uma determinada quantidade de neurônios e, conforme ocorria a
morte celular, esse número decrescia sem possibilidade de substituição futura. Atualmente,
estudos demonstraram que existem células-tronco estaminais neurais adultas no cérebro e na
medula espinhal, que são responsáveis pela capacidade de regeneração e autorenovação
(GRITTI et al., 2002).
Essas células são isoladas de diferentes regiões do cérebro, onde proliferam in vitro
mantendo assim sua população (GAGE, 2002) e produzindo fatores mitogênicos (PGF-2,
EGF) para dar origem a novos neurônios, astrócitos, oligodendrócitos e a maioria das células
do sangue (SOUZA et al., 2003; JOHANSSON et al., 1999). Sabe-se ainda que as
células-tronco neurais (CTN) dão origem a três camadas germinativas primárias: a

16
endoderme, a mesoderme e a ectoderme, que é a origem de todos os tecidos de vertebrados
(OSTENFELD e SVENDSEN, 2003).
Segundo Maia et al., (2012), as principais classes de células do sistema nervoso central
são as células nervosas (neurônios) e as células gliais (macroglia e microglia). Elas são
responsáveis pela produção de mielina e sustentação mecânica e metabólica.
As células ependimais, que revestem a superfície luminal da parede ventricular adulta,
ou os astrócitos, que residem na zona subventricular adjacente (células do tipo B), têm sido
sugeridas como uma fonte de células-tronco neurais adultas (CTNa) multipotentes (GRITTI
et al., 2002).
Atualmente, a melhor forma de obtenção da CTNa é através de biopsia do bulbo
olfatório (BO) (JESUS et al ., 2011; SOUSA et al; 2003; LINDEN, 2010). Trata-se de uma
abordagem pouco invasiva, se comparado com cirurgias cerebrais. Por meio dessa técnica,
podemos obter culturas de células progenitoras proliferativas, capazes de formar neuroesferas,
as quais são estruturas não aderentes com capacidade proliferativa, constituídas de células-
tronco neurais e células diferenciadas, associadas por elementos de matriz extracelular
(CAMPOS, 2004).
Salienta-se ainda que as CTNa expressam proteínas, tais como: a nestina, que
identifica a célula-tronco, a proteína ácida glial fibrilar (GFAP), a fibra estrutural NeuN e
marcadores de superfície MAP-2 (BARNABÉ-HEIDER; FRISÉN, 2008; PANAHI-JOO;
SOLOUK, 2015; MAYEUR et al., 2013).
3.4 As células-tronco estaminais ou germinativas
As primeiras ideias sobre as populações de células-tronco mesenquimais não
hematopoiéticas remontam, ao século XIX, à partir dos trabalhos do patologista alemão
Cohnheim. Ele defendia a hipótese de que células derivadas da medula não-hematopoiéticas
do osso poderiam migrar por meio da corrente sanguínea para locais distantes da lesão e
participar na regeneração de tecidos (HERNIGOU, 2015).
Em circunstâncias normais alguns tecidos, tais como o sangue, a pele, o intestino, o
trato respiratório e o testículo tendem a perpetuar sua autorenovação. A maioria das células
dos tecidos em mamíferos adultos exibem baixo volume de células renovadoras, respondendo
fracamente à pressão de regeneração, como o coração, enquanto outros respondem muito bem
como o fígado. Essas observações foram interpretadas como um indicativo da existência de

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função regenerativa das células-tronco dentro de alguns tecidos e a falta de função de células
estaminais em outros tecidos (WAGERS e WEISSMAN, 2004).
São dois tipos de células: as células estaminais embrionárias (CEE) e as células
estaminais pluripotentes induzidas (CEPi). As CEPi são derivadas de células somáticas,
através da expressão ectópica de determinados fatores numa localização que, normalmente,
não acontece a transcrição, incluindo Oct4, Sox2, KLF4, c-Myc, Nanog e Lin28 (esse último
regulador da pluripotência) (MAHERALI et al., 2008).
As CEPi podem ser obtidas em qualquer fase da vida humana e a partir de várias
células somáticas específicas do doador (fibroblastos da pele, células adiposas e de sangue
periférico, etc.). Essas são as razões pelas quais o uso de CEPi é, atualmente, a estratégia
preferida na biomedicina (WARREN et al., 2010), podendo originar vários tipos de células do
organismo, via diferenciação para quase todos os tipos celulares (WARREN et al., 2010),
porém, com potêncial terapêutico limitado pelo risco em originar tumores (YAMANAKA,
2012).
Devido à sua capacidade proliferativa multipotêncial, as células derivadas da
placenta também ganharam interesse como células de origem e candidatas no campo da
reparação de danos nos nervos. Em estudos realizados com a indução de células estaminais,
que tem a capacidade de se diferenciar ou autorenovar, derivadas de placenta
humana, conseguiram a diferenciação em células neurais, que transplantadas na região da
medula espinhal, após lesão medular em ratos, obtiveram resultados positivos contribuindo
para a restauração da ferida na medula espinhal, sem causar a rejeição (LI et al., 2014).
As células estaminais embrionárias (CEE) são geralmente obtidas a partir da pré-
implantação de blastocistos, na fase de embriões, criados durante procedimentos de
fertilização in vitro. Também podem ser gerados por transferência de núcleos de células
somáticas ou ativação partenogenética de ovos. Pelos riscos das CEE transplantadas
apresentarem teratomas, essas devem ser diferenciadas, antes do enxerto (PANAHI-JOO;
SOLOUK, 2015).
Existem duas formas conceituais diferentes de empregar células estaminais para a
reparação da medula espinhal. Em primeiro lugar, pode-se utilizar o transplante de células
estaminais somáticas para a medula lesionada. Em segundo, as células estaminais neurais
endógenas, existentes na própria medula espinhal adulta, podem ser recrutadas ou moduladas
para promover a recuperação (BARNABÉ-HEIDER e FRISÉN, 2008). Os primeiros
estudos, os quais demonstraram o potencial de transdiferenciação das CTM em células
neurais, foram conduzidos por Woodbury et al., (2000) e Sanchez-Ramoz et al. (2000), onde

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utilizaram células adultas provenientes da medula óssea de humanos e de roedores. Esse
experimento apresentou uma rápida mudança morfológica em fibroblastos sem a necessidade
de se transformar em célula-tronco para gerar neurônios com marcadores neurais. Utilizando
agentes químicos, vários foram os protocolos que tiveram como base a utilização de fatores
de crescimento neurotrópicos, tais como líquido cefalorraquidiano autólogo, produtos de
fitoterapia e outros agentes químicossintéticos (MAIA et al., 2012).
Estudos mostraram que, quando o transplante foi adiado por 2 semanas após a lesão,
ocorreu uma taxa de sobrevivência substancial de 40% das células transplantadas. Isso sugere
a eficiência do fator de crescimento para maximizar a sobrevivência da célula
(EFTEKHARPOUR et al., 2008).
A baixa taxa de sobrevivência de células estaminais mesenquimais (CEM) da medula
óssea transplantadas in vivo continua a ser um problema. Para promover a sobrevivência de
neurônios motores a Neurotrofina-3 seria uma ferramenta a melhorar o efeito terapêutico.
Conforme foi demostrado por pesquisas, em que a transfecção in vitro do gene da
neurotrofina-3 aumenta o número de células estaminais mesenquimais de medula óssea na
região da lesão da medula espinhal (EFTEKHARPOUR et al., 2008; DONG, Y.; YANG, L,;
et al.,2014).
Diante disso, tem sido difícil gerar linhagens celulares específicas com alta pureza e
sem anormalidades cariotípicas. As preocupações com o transplante de células neurais
derivadas de células CNE em LME esbarram em problemas éticos de derivação celular, pois
aumentam as possibilidade de formação de tumores, resultando em uma diferenciação
incompleta ou aberrante, e não em células neurais (MOTHE e TATOR, 2012).
Estudos recentes com foco em fontes alternativas de células-tronco tem mostrado que
as células-tronco dentais (CTD), incluindo as células-tronco da polpa dentária (CTPD) e as
células do folículo dental (CFD), possuem propriedades de células estaminais mesenquimais,
com potencial de diferenciação em células neurais e em diferentes tipos de células, tais
como osteócitos, condrócitos e adipócitos (ISOBE et al., 2016).
Esses dados propõem novas fontes para a terapia com células estaminais de potencial
alternativa para o tratamento de neuropatias entre elas a isquemia cerebral (YALVAC et
al.,2009).
Isso permitirá que os profissionais da saúde informem aos pacientes ou a seus
representantes legais que, embora essa ainda seja uma técnica experimental, ela mostra-se
promissora e que esses tecidos, que são normalmente descartados, podem ser recolhidos e em
um banco e criopreservados para uso futuro (JESUS et al., 2011).

19
As técnicas para a coleta e cultivo de células, a partir de dentes de leite, provaram ser
relativamente simples e rápidas, porém, são necessários cuidados, no momento da coleta pelo
fato do risco de contaminação, pela cavidade bucal e pelos dentes cariados (JESUS et al.,
2011).
Na área da veterinária, as células-tronco e as derivadas de tecido adiposo canino
(CTDTc) demonstraram grandes possibilidades de fornecer células-tronco com ótimas
propriedades biológicas (GUERCIO et al., 2012).
Em células do bulbo olfatório (CBO) foram observadas células parecidas com células
da glia de neurônios primeiramente identificadas por Golgi (1875) e Blanes (1898).
Inicialmente, eles consideraram como células de Schwann do sistema olfativo, devido à sua
localização dentro da mucosa olfativa e bulbo olfatório. Uma das primeiras indicações das
suas propriedades veio de um estudo imuno-histoquímico de nervos olfativos, utilizando
anticorpos para a proteína glial fibrilar ácida (GFAP), um marcador geralmente considerado
para definir os astrócitos. Como as células de Schwann dos nervos olfativos expressam
GFAP, sugerem uma semelhança com os astrócitos, que são células neurológicas
(COLUCCI-D’AMATO et al., 2006; HIGGINSON e BARNETT, 2011).
Assim sendo, verifica-se que estudos clínicos ainda são necessários para a
transferência de resultados experimentais com animais para seres humanos. Investigações
utilizando CTMO autóloga não manipulada, isto é, não reprogramada e lesão transversal da
medula espinhal (LME) de pacientes humanos, resultaram em dados de 20 pacientes com
LME completa e que receberam transplantes entre 10 a 467 dias após a lesão. O estudo
demonstrou que a implantação das células parecem ser seguras não havendo complicações
após a implantação celular, mas mesmo assim são necessários um maior número de estudos
para que os implantes sejam definitivamente seguros. Também constatou-se que o transplante,
dentro de uma janela terapêutica de 3-4 semanas após a lesão, vai desempenhar um papel
importante em qualquer tipo de células estaminais no tratamento LME (SYKOVÁ; et al.,
2006) (PARK et al., 2013).
A idade real de uma cultura é normalmente registrada em duplicações da população
celular (DPC). Porém, Colter et al. (2000) descobriram que CTM pode ser expandida até 30
DPCs. Os estudos demostraram uma série de alterações, nos parâmetros fisiológicos
funcionais e moleculares que ocorreram durante as culturas de longo prazo. Essas alterações
incluíram: o Fenômeno Hayflick típico do envelhecimento celular (FEHRER e
LEPPERDINGER, 2005) e o potencial de proliferação é diminuído pelo fato do
encurtamento dos telômeros (COLTER et al., 2000; BONAB et al., 2006).

20
Markoski (2016) descreve que as colônias derivadas de uma única célula de CTM
pode ser expandidas até um máximo de 50 DPCs em cerca de 10 semanas.
3.5 As células-tronco estaminais pluripotentes induzidas
Em 2006, as células estaminais induzidas com propriedades semelhantes a células
embrionárias estaminais puderam ser geradas a partir de fibroblastos de rato por introdução
simultânea de quatro genes. Essas células modificadas são designadas como células-tronco
estaminais pluripotentes induzidas (CEPi).
As células adultas foram geneticamente reprogramadas para um estado de células-
tronco embrionárias e forçadas a expressar genes e fatores importantes para a manutenção
das propriedades, os quais definem uma célula-tronco embrionária. Embora essas células
cumpram os critérios que definem as células estaminais pluripotentes, clinicamente não se
sabe se CEPi diferem em eficiência da células estaminais embrionárias (CEE)
(YAMANAKA, 2012; VASKOVA et al., 2013; WARREN et al., 2010; AHUJA et al., 2016).
3.6 As aplicações médicas das células CEPi
A tecnologia de reprogramação de CEPi possibilitou modelar células adultas para
tratar doenças humanas (Figura 2). Essa tecnologia é eficaz, principalmente às desordens
neurodegenerativas. Nesse tratamento, as células CEPi, específicas do próprio paciente
obtidas por biópsia da pele, tem as células isoladas e transformadas por co-expressão ectópica
de fatores da transcrição (WARREN, L et al.,2010).
Também podem ser utilizadas em casos em que se conhece a mutação causadora da
doença (a exemplo da doença de Parkinson), em que o direcionamento de genes pode ser
utilizado para reparar a sequência de DNA. As células CEPi específicas de pacientes com
correção de genes, então, sofrem diferenciação dirigida para o subtipo neuronal afetado (por
exemplo, neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo) e serem transplantadas para o cérebro
do paciente (enxertar o eixo nigroestriatal) (PERNAUTE, et al., 2003).
Alternativamente, é dirigido a diferenciação das células CEPi, específicos do paciente,
para o subtipo neuronal afetado, permitindo que a doença do paciente seja modelada in vitro
e potenciais medicamentos podem ser testados, auxiliando na descoberta de novos compostos
terapêuticos.

21
Figura 2. Estratégias de reprogramação celular para terapia genética/celular (ROBINTON, D. A.;
DALEY, G. Q., 2012)
O desenvolvimento de CEPi se refletiu na fusão das três principais correntes científicas, que
por sua vez levou a novos ramos adicionais de investigação. A primeira corrente foi a
reprogramação por transferência nuclear. Em 1962, John Gurdon divulgou a notícia que seu
laboratório tinha gerado girinos de ovos não fertilizados e que tinham recebido um núcleo das
células intestinais de rãs adultas (GURDOM, 1962 ).
Em três décadas mais tarde, Ian Wilmut e seus colegas relataram o nascimento de
Dolly, o primeiro mamífero gerado por clonagem somática de células epiteliais mamarias
(WILMUT et al., 1997 ).
O sucesso obtido com a clonagem somática demonstrou que as células diferenciadas
ainda contém toda a informação genética que é necessária ao desenvolvimento de organismos
inteiros e que contêm fatores de ócitos, que podem reprogramar os núcleos das células
somáticas.
Em 2001, o grupo de Takashi Tada mostrou que CES também contém fatores que
podem reprogramar células somáticas (TADA et al., 2001). No entanto, ainda há debates que
buscam saber se CEPi são funcionalmente equivalente a CTE.
Essa questão deve ser respondida apenas pela ciência, não pela política de negócios
médicos, pois a eficiência do processo de transplante permanece baixa, normalmente, menos
do que 1% de fibroblastos transfectados para tornar CEPi.

22
No início das pesquisas, a baixa eficiência em se diferenciar em outros tecidos
levantou a possibilidade das CEPi não serem células estaminais e sim células que
coexistiam na cultura de fibroblastos (YAMANAKA, 2012).
Estudos anteriores demostraram que as CEPi podem ter como fonte linfócitos igual
aos fibroblastos diferenciados em neurónios pós-mitóticos (KIM et al., 2009). Assim, a
maioria, se não todas as células somáticas, tem um potencial para se tornar CEPi, embora com
eficiências diferentes.
Há muitas maneiras de gerar CEPi livre de integração. Esses métodos incluem o
plasmídeo (YOSHIDA et al., 2009), o vírus Sendai (FUSAKI et al., 2009), o
adenovírus(YUAN et al., 2008), os RNAssintéticos (WARREN et al., 2010), as proteínas
induzidas ou células-tronco neurais, por meio da "expressão do gene forçada", que pode ser
usadas para reparar áreas cerebrais danificadas ou tratar doenças degenerativas (YUAN e
ARIAS-CARRIÓN, 2008).
Verifica-se ainda a ocorrência de várias tentativas para induzir a reprogramação por
moléculas pequenas como plasmídeos e vírus Sendai, que atualmente são utilizados
rotineiramente em muitos laboratórios.
No Centro de Pesquisa e Aplicação Celular da Universidade de Kyoto, identificou-se
que os métodos que mais favoreceram a reprogramação das células-tronco são o uso de
plasmídeos epissomal e/ou retrovírus para estudos in vitro. A rotina de utilizar esses métodos
é devido sua simplicidade e reprodutibilidade (YAMANAKA, 2012).
Os métodos laboratoriais utilizados têm revelado que o padrão de expressão de genes,
como microRNAs, metilação do DNA, bem como conjuntos dos padrões de modificações
covalentes das histonas ou epigenética fazem das CEPi, semelhantes às células estaminais
embrionárias.
No entanto, foram demonstradas que as CEPi possuem algumas características
específicas que podem ser adquiridas durante o processo de reprogramação (VASKOVA et
al., 2013), além de traços de epigenéticose transcriptomicosdo tecido do doador. Essas
características residuais de tecido somático de origem são chamadas de "memória
epigenética", na qual podem modificar as expressões dos genes sem alterar as sequências das
bases no DNA (PAYÃO et al., 2009).
Enquanto as células CEPi prometem abrir uma nova era com grandes oportunidades
em ciências biomédicas, em termos de terapias celulares e medicina regenerativa, são as
preocupações relacionadas com a segurança da terapia celular um dos fatores a serem
resolvidas antes da aplicação clínica (YAMANAKA, 2012).

23
A introdução de genes em células somáticas adultas se transformam em células-tronco
com pluripotência celular comparada às células embrionárias. Com a evolução das pesquisas
em células autólogas somáticas do sangue ou de fibroblastos da pele, modificadas em CEPi
para transplante em lesões medulares, resolve problemas éticos e de rejeição em transplante.
Oh et al., (2012) fizeram a utilização de célula estaminal do tecido adiposo (CTEA)
induzidas à diferenciação neuronal, juntamente com Matrigel (scaffold), onde comparou
modelos animais caninos com o controle. A partir desse experimento, observa-se que houve
uma melhora significativa e apresentaram maior apoio sobre as patas traseiras e redução da
fibrose.
Além disso, identificou-se que a expressão de neurotrofinas, como fator de
crescimento do nervo (NGF) e neurotrofina-3 foi aumentada, os marcadores inflamatórios
COX2 e interleucina-6 (IL-6) foram diminuídos, Cdc42 e Rac1 foram aumentados e vários
outros marcadores de regeneração neural . Os efeitos anti-inflamatórios e estrutural
percebidos com associação da CTEAcom Matrigel podem melhorar a eficácia das células-
tronco mesenquimais neuro-induzidas (PARK et al., 2012).
3.7 As células-tronco extraídas do tecido adiposo
O tecido adiposo pode representar uma fonte potencial de células-tronco adultas para
aplicações na engenharia de tecidos e medicina veterinária. Ele pode ser obtido em grandes
quantidades, sob anestesia local, e com o mínimo desconforto.
O tecido adiposo canino é obtido por biópsia de tecido adiposo subcutâneo ou
lipectomia assistida por sucção (ou seja, lipoaspiração). O tecido adiposo é processado para se
obter uma população de fibroblastos de células semelhantes a células estaminais derivadas de
tecido adiposo humano (CTAh).
Essas células estaminais derivadas de tecido adiposo canina (CTAc) podem ser
mantidas in vitro durante períodos prolongados com duplicação da população estável e baixos
níveis de senescência (VIEIRA et al., 2010).
O estroma do tecido adiposo é rico em células progenitoras de haste capazes de sofrer
diferenciação osteogênica, condrogênica e linhagens adipogênicas, em condições in vitro ,
bem como in vivo, com capacidade de conservação sob criopreservação em azoto líquido sem
perder a capacidade morfológica de fibroblastos (MARTINELLO et al., 2011).
A coleta utilizada para CTA é minimamente invasiva para o paciente e de transplante
autólogo (DASARI et al., 2014; BLACK et al., 2007).

24
Penha et al. (2014) examinaram os efeitos terapêuticos de células-tronco
mesenquimais (CTM) autólogas da medula óssea, em transplantes em quatro cães com lesões
medulares traumáticas naturais.
As CTM foram cultivadas in vitro, e a taxa de proliferação e de viabilidade das
células foram avaliadas. Foram preparadas suspensões de células e administradas
cirurgicamente na medula espinhal. Os animais foram clinicamente avaliados e examinados
por ressonância magnética nuclear. Dez dias após o procedimento cirúrgico observou-se no
transplante de CTM uma recuperação progressiva do reflexo panículo e reduziu a resposta à
dor superficial e profunda, embora ainda baixos os reflexos proprioceptivos, além das
respostas de reflexo dos membros posteriores com movimentos atáxicos, cada cão
demonstrou uma melhoria ao longo do tempo: Recuperação do reflexo consciente ocorreu
simultaneamente com melhora moderada nas funções do intestino e da bexiga urinária em
dois dos quatro cães. Até o 18º mês de acompanhamento clínico, observou-se uma melhoria
clínica notável acompanhada por melhora nos movimentos em três dos quatro cães. No
entanto, nenhum ganho clínico foi associado a alterações na ressonância magnética. Os
resultados desse estudo pré-clínico indicam que CTM da medula óssea tem um grande
potencial como terapia em injúrias medulares (PENHA et al., 2014).
Modelos animais como pequenos roedores têm várias limitações ao extrapolar os
resultados para seres humanos: o pequeno tamanho limitam a demanda proliferativa
implantado no tecido transplantado e ainda o curto período de vida do rato também impede as
medições e estudos de longo prazo. Modelos em grandes animais, como o cão, ganham mais
fidelidade nos resultados para tratamento a patologias humanas.
Considera-se que há muitos modelos caninos, em que doenças genéticas humanas
são melhores caracterizadas, do que outros animais, tornando-os ideais como ferramenta para
estudos in vitro e in vivo em avaliação pré-clínica para o rastreio de drogas (VIEIRA et al.,
2010; BREHM et al., 2012).
3.8 As células ensheathing olfativas (CEO)
A ideia de usar implantes intra-espinhais de células olfativas ensheathing (CEO)
surgiu como uma estratégia terapêutica para melhorar a recuperação pós-lesão medular em
experimentação com animais de laboratório para futuras aplicações em seres humanos
paralisados (KAWAJA et al., 2009).

25
As células (CEO) são células gliais ensheathing obtidas a partir de lâmina própria
da mucosa nasal para captação de neurônios receptores olfativos. Essas células têm
semelhanças com células de Schwann e astrócitos com um fenótipo mais próximo das células
de Schwann. Essas são células da neuroglia do sistema nervoso periférico, as quais formam as
bainhas isolantes de mielina dos axônios periféricos (MAYEUR et al.,2013).
Elas são obtidas da mucosa nasal (lâmina própria) e tem se mostrado efetivas em
lesões da medula, em modelos animais (SAMADIKUCHAKSARAEI, 2007), pouco invasiva
em autotransplante (KAWAJA et al., 2009; TETZLAFF; et al., 2011; GOEL,2016;
SIDDIQUI et al.,2015) isoladas de ratos, cães, porcos, primatas não humanos e em seres
humanos (KAWAJA et al., 2009).
No entanto, a maioria dos transplantes experimentais têm se concentrado em células
do bulbo olfatório e da mucosa, que são mais acessíveis, mesmo não tenham sidos
comparadas as suas eficiências com as demais células-tronco utilizadas em testes pré-clínicos
na recuperação da medula. (MAYEUR et al., 2013; RAISMAN, 2001).
É possível que mecanismos de neuroproteção promovam a recuperação funcional no
local da lesão, porém, os reais resultados clínicos com CEO são modestos (TETZLAFF; et
al., 2011).
As CEO em cultivo são de difícil identificação (BARNETT; RIDDELL,
2007;HIGGINSON E BARNETT, 2011; BREGMAN et al.,2002). Uma vez resolvida a
questão metodológica de isolamento e caracterização da CEO a estratégia terapêutica de
regeneração medular será viável (KAWAJA et al., 2009).
Como ocorre a falta de matriz extracelular no local da lesão em orientar e organizar as
células de cura no interior da ferida situação que interfere com o processo de regeneração
após a lesão, diversos estudos foram realizados para investigar o potencial de enxertos
bioscaffold (estruturas artificiais para implante) promovendo a regeneração na lesão
(DONNELLY et al., 2012), fornecendo uma ponte, através da qual os axónios em regeneração
podem ser corretamente guiados de uma extremidade da lesão para a outra extremidade.
A aplicação dessas combinações e mais os diferentes fatores de crescimento e
componentes celulares, formando as camadas, promovem os efeitos de cura
(SAMADIKUCHAKSARAEI, 2007). Segue exemplos desses componentes:
O colagénio, Neuragen ™ Nerve Gide, um enxerto de nervo periférico de colágeno
tipo I, que recebeu autorização da FDA para ser comercialização em 2001, tem demonstrado
que a inclusão de colagénio, suplementado com fatores de crescimento de fibroblastos1
(FGF1) ou neurotrofina3(NT3) dentro dos canais de guia de hidrogel melhoram a regeneração

26
axonal, o FGF1, regeneração reticular de neurônios motores do tronco cerebral vestibulares
(TSAI et al., 2006).
O alginato é uma matriz extracelular derivada de algas castanhas ou marrom que, a
partir da qual uma esponja foi desenvolvida para a reticulação das fibras com ligações
covalentes Poli (ahidroxiácidos). Trata-se de polímeros sintéticos biodegradáveis com
excelente biocompatibilidade e a possibilidade de mudar suas especificações e, especialmente,
suas propriedades mecânicas e taxas de degradação, por alteração da composição e
distribuição das suas unidades de repetição (NOVIKOVA, L. N. 2006).
Os hidrogeles sintéticos, tais como poli [N2(hidroxipropil) metacrilamida] (pHPMA)
hidrogel (NeuroGel ™) e poli (metacrilato de metilocometacrilatode 2hidroxietilo)
(PHEMAMMA) consistem de redes reticuladas de copolímeros hidrofílicos que incham em
água e fornecem os substratos tridimensionais para fixação e crescimento celular. PHEMA
tem uma fração de volume mais baixa em comparação com NeuroGel. Quando ambos
NeuroGel e PHEMA foram implantados no córtex de rato, a NeuroGel foi invadida por
diversos elementos de tecido conjuntivo, mas PHEMA impedido o crescimento interno de
tecido conjuntivo e invasão de astrócitos (LESNÝ et al., 2002).
O polietileno glicol (PEG) é um polímero tensoativo solúvel em água. Breve
aplicação da solução aquosa do polímero para o local da lesão nos selos da medula espinal e
reparação de quebras da membrana celular, inverte a permeabilização da membrana produzida
pela lesão, inibe a produção de radicais livres (BORGENS, R. B et al.,2000)
A fibrina é derivada a partir de sangue, sendo um componente principal de formação
de coágulos. Funções de fibrina como ponte molécula para muitos tipos de interações célula a
célula. No local da lesão, muitas células ligam-se, diretamente à fibrina através dos seus
receptores de superfície. Isto ajuda a localização destas células para o local da lesão e exercer
a sua função especializada (LAURENS, N et al.,2006)
O Matrigel é uma matriz extracelular extraído do sarcoma Engelbreth Holm Swarm
(EHS) e contém laminina, fibronectina, e proteoglicanos, laminina com predominando. Em
um estudo in vitro demonstrou-se que a estimulação da proliferação celular de Matrigel
preserva as características morfológicas típicas de células ensheathing olfativas, as células de
Schwann e as células do estroma da medula óssea em cultura e também suporta o crescimento
da raiz dorsal neurônios do gânglio (IANNOTTI, C. et al.,2003)
A fibronectina (FN) é uma glicoproteína encontrada em muitas matrizes
extracelulares e no plasma. Ela está envolvida na fixação das células e migração, devido à sua
interação com receptores da superfície da célula (AHMED et al., 2003). Agregados fibrosos

27
de fibronectina do plasma têm sido usados para fazer tapetes de fibronectina. Estas esteiras
contêm poros orientados numa única direção.
A agarose é um polissacáridio derivado de algas marinhas. Recentemente, um
andaime de agarose liofilizado com poros uniaxiais lineares que se estende através do seu
comprimento total foi produzido e a sua biocompatibilidade e capacidade para funcionar
como um depósito para fatores de crescimento foi confirmada por estudos in vitro estudos
(AHMED et al., 2003).
Estudos pré-clínicos demonstraram que os hidrogéis de polímero macroporosos à base
de derivados de HEMA ou HPMA são materiais adequados para colmatar, tapar as cavidades
após LME; as suas propriedades químicas e físicas pode ser modificadas para uma utilização
mais específica, implantes em 3D semeaduras com diferentes tipos de células pode facilitar o
crescimento de axônios CEM foram isoladas a partir de medula óssea de rato pela sua
aderência a plástico, marcadas com nanopartículas de óxido de ferro e expandido in
vitro ( SYKOVÁ, E. ,2006).
Hidrogel microporosos à base de derivados de metacrilato de 2-hidroxietilo
(HEMA)ou metacrilamida 2-hidroxipropilo (HPMA) foram preparados e em seguida,
modificados por sua copolimerização com um agente de ligação composto de reticulação
hidroliticamente degradável, N, O-dimethacryloylhydroxylamine (MANHOMA)(YIN,
W.,2002) ou por cargas eléctricas de superfície diferentes, hidrogéis semeados com CME
foram implantados em ratos com medula espinhal hemi seccionadas os hidrogéis
biodegradáveis que estavam em contato direto com o tecido da medula espinhal foram
reabsorvidos pelos macrófagos e substituído por um tecido recém formado, contendo
elementos de tecido conjuntivo, os vasos sanguíneos e processos astrocíticos GFAP-
positivos e neurofilamentos NF-160-positivos, além disso, hidrogéis semeados com CEM
marcados com nanopartículas em ratos hemiseccionados nas medulas espinhais. Foram
visíveis em imagens de Ressonância Magnética como áreas hipointensas, e subsequente
coradas histológicamente com azul da Prússia que confirmou as células marcadas
positivamente dentro dos hidrogéis (SYKOVÁ; et al., 2006 b; AHUJA et al., 2016).
Os polímeros hidrófilos, agentes tensoativos e os polímeros de três blocos são
conhecidos para selar defeitos em membranas celulares. Em experiências anteriores com
animais de laboratório essa capacidade foi explorada, usando polietilenoglicol (PEG) para
reparar os axônios da coluna vertebral após grave lesão da medula, padronizado a LME em
cobaias. (LAVERTY et al., 2004). Os resultados deste ensaio piloto forneceu evidências

28
consistentes de que a injeção de polímeros inorgânicos em neurotrauma agudo pode ser uma
intervenção simples e útil durante a fase aguda do ferimento (LINDEN, 2010).
Com resultados promissores, em animais experimentais, estão agora a ser investigados
nos ensaios clínicos em LME, oriluzoleum bloqueador do canal de sódio e a minociclina, um
agente anti-inflamatório (BAPTISTE e FEHLINGS,2007). Entetanto, os agentes
neuroprotetores, por si só, podem ser insuficientes para promover a reparação em grande
LME, onde existe extensa perda de tecidos.
Em um modelo de rato LME (OKANO et al., 2003; HOFSTETTER et al., 2005 )
demonstrando que células estaminais adultas endógenas da medula espinal pode facilitar a
recuperação funcional, não totalmente eficiente, pois na fase aguda da LME "fase
inflamatória" devido à regulação positiva de citocinas inflamatórias, neurotransmissores
excitatórios e de radicais livres, prejudicam o transplante, por outro lado, promovem a
proliferação de células progenitoras endógenas; e a geração de substrato favorável para o
crescimento axonal e a própria vascularização (PARR et al., 2007; PARK et al., 2010; JUNG
et al.,2009; LIM et al., 2007). Na fase crônica, cerca de 2 semanas ou mais após a lesão, entra
na fase de formação de cicatriz da glia, o que também impede a regeneração axonal, portanto,
a fase subaguda da LME é considerado como a janela de tempo ótimo para o transplante.
O entusiasmo dos pesquisadores e as esperanças depositadas por uma parcela
considerável da população buscam poder um dia serem beneficiadas pelos avanços
alcançados na área da medicina regenerativa (ROWLAND et al., 2008a). Sendo que ainda são
necessárias muitas pesquisas e boa vontade políticas, éticas e morais para compor o cenário
ideal ao pleno desenvolvimento dessa nova área terapêutica. O tratamento de doenças
utilizando células-tronco ainda não é reconhecido como parte do arsenal terapêutico
clinicamente comprovado, pois ainda se considera experimental pela comunidade científica .
Ressalta-se, portanto, que o uso de células-tronco para essa finalidade encontra-se, neste
momento, restrito às pesquisas clínicas (DE e INSUMOS, 2010).
Não há ainda evidências conclusivas sobre quais tipos de células-tronco gliais ou
adultos são mais eficazes no tratamento da LME. A sua capacidade para incorporar na medula
espinhal danificada e de se diferenciarem em linhagens neurais, para exercer efeitos neuro-
protetores, regenerando axónios danificados, para melhorar os défices funcionais, ainda são
discutidos, como uma terapia única ou em combinação com outras estratégias (HERNÁNDEZ
et al., 2011).
Uma das perspectivas tentadoras é in situ, sem qualquer necessidade de cultura de
células ou de enxerto, transplantar diretamente, sem reproduzir o efeito induzido pela

29
expansão e transplante de células estaminais neurais endógenas na promoção da
recuperação. Isso ofereceria uma terapia autóloga não-invasiva, que poderia contornar muitas
das limitações e riscos nas estratégias de transplante. No entanto, é difícil prever esse cenário
(BARNABÉ-HEIDER; FRISÉN, 2008; BHANOT et al., 2011).
4 PERSPECTIVAS E DESAFIOS TÉCNICOS
Na medicina veterinária o transplante de células-tronco de medula óssea pode ser um
tratamento promissor, confiável e seguro para as lesões na medula espinhal, aguda e crônica,
trata-se de uma terapia não muito cara e não muito trabalhosa para a veterinária, onde os
valores de cada aplicação custam, em média, a partir de R$ 1,2 mil.
Normalmente, se faz entre 1 a 3 aplicações, dependendo da doença e da gravidade,
baseada na morfologia dos tecidos, sendo os cães um modelo animal ideal para estudar as
patogêneses e os tratamentos das doenças debilitantes humanas (BOEKHOFF et al., 2012).
Muitos dados pré-clínicos atuais apoiam o transplante de células e estabelecem a reparação
em modelos animais LME (BARZAGA et al., 2016).
Na medicina humana, apesar do uso indiscriminado dessas terapias por parte de
clínicas espalhadas pelo mundo, vendendo o que pela ciência ainda não pode ser vendido sem
a comprovação de cura, o presente ainda é sombrio (TURNER, et al.2016), sendo os únicos
tratamentos com eficácia comprovados àqueles com o uso de célula-tronco no tratamento de
doenças do sangue.
Considera-se que mais trabalhos precisam ser realizados para determinar (a) o tipo
de célula que é o mais adequado para o transplante, (b), o tipo de célula que tem a maior
neurogênica, isto é, potencial de plasticidade, (c) o tipo de célula ou técnica de transplante
capaz de superar o microambiente hostil e facilitar a restauração de tecido neural
danificado(ANTONIC et al., 2013).
Entre as células estaminais utilizadas em procedimentos, estão aquelas com maior
probabilidade de sucesso terapêutico que são as CTMO (isolado a partir de medula óssea ou
de tecido adiposo do estroma mesenquimal) por sua capacidade em promover a reparação de
tecidos e ativação de fatores parácrinos, imunomodulação e percepção da célula na
sinalização homing.
Deve ser dada especial atenção à saúde do paciente: quanto mais comprometida e
crônica a lesão, mais difícil é a indução da ativação homing de células-tronco e da
subsequente reparação. Curiosamente, a melhoria no resultado sensorial, parecem estar

30
ligados às diferenças de fatores relacionados com o tratamento (isto é, biologia das células
estaminais), enquanto os resultados ligados a função motora parece ser mais direta a fatores
relacionados com a lesão, sendo, portanto, os resultados positivos menos dependente das
características biológicas das células estaminais utilizadas e sim da lesão (ANTONIC et al.,
2013).
Deve-se considerar que qualquer forma de manipulação genética em células de
conversão em estados mais primitivos, desencadeia taxa de proliferação e, portanto, um
potencial mais elevado para a malignidade, mesmo com as técnicas de transfecções lentivirais
em ensaios de transferência nuclear realizados com células somáticas maduras podem resolver
o problema de fonte de células-tronco. No entanto, não resolvem o problema da formação de
tumores. Portanto, embora promissores, estas técnicas não estão ainda prontas para uso
generalizado (LINDEN, 2010).
Mesmo com estratégias mais sofisticadas para modificar células para certas
características genéticas, no desenvolvimento de fontes purificadas de células tronco
específicas para cada tipo de tecido estarem sendo testadas, muitas questões precisam ainda
de respostas (TETZLAFF; et al., 2011).
Desta forma, muitos esforços ainda são necessários para a determinação dos
mecanismos que promovem o homing celular para a utilização da terapia celular em medicina
veterinária ou humana.
Outra abordagem promissora, que está atualmente em desenvolvimento é o
recrutamento de células-tronco autólogas, que podem ser conduzidas para se diferenciar em
neurônios maduros, a fim de repovoar áreas danificadas (WEI et al., 2013; NISHIDA et al.,
2012).
Com essa técnica, as próprias células contém o reconhecimento sobre os fatores e as
cascatas de sinalização celular, no local da lesão, que posteriormente promovem a
diferenciação neuronal e eventualmente a restauração (LIM et al., 2007).
Por fim, a reorganização dos circuitos neurais locais, auxiliado pelo repovoamento do
tecido danificado com os neurônios recém-gerados (sejam implantados ou recrutados
localmente) é crucial para restaurar a função neural a mielinização para a passagem dos
pulsos nervosos (SILVA MEIRELLES, et al., 2006).
Os mecanismos para esse processo, e maneiras de interferir com ele, permanecem
largamente desconhecidos e exigem mais esclarecimentos. Talvez o próximo passo nesta
linha de pesquisa deve ser a utilização de combinações de diferentes transplantes de células

31
estaminais, uma vez que foi demonstrado que cada tipo de célula é capaz de recuperar apenas
uma parte do tecido perdido.
Em outras palavras, nenhuma célula de um único tipo individual pode recuperar toda
uma região composta de células diferentes com diferentes funções (MARIANO et al., 2014).
Futuras investigações revelarão se as células-tronco do líquido amniótico realmente irão
representar um tipo intermediário com vantagens em relação tanto às células-tronco
embrionárias quanto às adultas somáticas (BYDLOWSKI; et al., 2009).
A descoberta de quatro fatores capazes de gerar uma célula pluripotente de células
somáticas adultas, fornecendo uma fonte ilimitada de células com a possibilidade de
desenvolver terapias autólogas no futuro (WEI et al., 2013). Embora as questões
anteriormente desconhecidos com CTEPi, como memória epigenética e senescência precoce,
estão sendo estudados, essas células continuam a ser uma estratégia terapêutica
chave (VASKOVA et al., 2013). Dados claros e inequívocos em relação a essa
transdiferenciação, ainda precisam ser obtidos para fundamentar a validade de tais terapias
(MAIA et al., 2012).
No Brasil, em 2005, foi aprovada a Lei de Biossegurança, a qual regulamenta o uso
das CTEs humanas para fins de pesquisa. Porém, sua obtenção é restrita aos embriões
congelados há mais de três anos, que seriam utilizados para fertilização in vitro, porém foram
inviáveis, com consentimento dos progenitores.
É de suma importância estabelecer normas para protocolos das técnicas de expansão
celular, critérios de qualidade do produto e controles de segurança que ainda não estão
disponíveis na maioria dos países.
Agências reguladoras do governo estão esperando ansiosamente por respostas
detalhadas a estas perguntas para possam estabelecer políticas de regulatórias para enfrentar
os desafios deste campo emergente para que, dessa forma avance rapidamente para beneficiar
os pacientes que sofrem por um grande número de doenças (DE e INSUMOS, 2010).
Observa-se que ainda faltam mais trabalhos com modelos de grande porte com lesões
medulares em cães e primatas para serem considerados essenciais para confirmar os
resultados experimentais obtidos em ratos (KIRKNESS., et al., 2003). Bem como nas lesões
crônicas (TETZLAFF., et al., 2011). Assim, é muito importante provar a eficácia do
transplante de células (NAKAMURA e OKANO, 2013);(ROWLAND et al., 2008b) e
extrapolar os resultados obtidos para a espécie humana,(SYKOVÁ; et al., 2006a), além de se
ter o cuidado em considerar algumas diferenças anatômicas, como por exemplo, a importância
dos tratos córtico-espinhal e rubro espinhal, em que nos humanos lesões no trato córtico-

32
espinhal resulta em hemiparesia espástica grave, enquanto que, nos cães resultam apenas em
anormalidades leves de postura e marcha, perdas mais sutil do posicionamento e alteração na
resposta de saltar. Isso se deve ao fato de que em cães, ao contrário dos humanos, o trato
rubro espinhal é mais importante para realização da marcha (SARMENTO et al., 2014a).
5 CONCLUSÃO
A partir desse percurso de pesquisa, conclui-se que as agências reguladoras serão
primordiais a respeito das pesquisas clínicas e uso de células tronco, buscando em modelos
animais a caracterização de linhagens de células semelhantes aos seus equivalentes humanos,
sendo dessa forma aplicáveis, tanto na medicina veterinária, quanto na humana.
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