1. Universidade Federal do Pará
Mestrado em Genética e Biologia Molecular
Karina Melo
Talita Fernanda
Belém-PA
2012

2. RNA seq
Uma abordagem desenvolvida para
transcriptoma usando tecnologias de
sequenciamento “next generation”
Permite
Determinar a
Medição dos níveis
estrutura funcional
de transcritos
dos genes

3. RNA seq
 O termo RNA-seq tem sido usado para representar
o transciptoma revelado por sequenciamento de
cDNA por NGS (sequenciadorres de segunda
geração);
 Permite a quantificação dos níveis de expressão
gênica, mesmo em transcritos que possuem níveis
mais baixos de expressão devido a sua alta
sensibilidade;
 Útil para descobrir novas transcrições, identificação
de mutaçoes, indels, splicing alternativos;

4. RNA seq
 Metodologia
Fonte: Snyder et al, 2009.

5. RNA seq
 Sequenciamento:
 Ilumina IG.
 Applied Biosystems SOLiD.
 Roche 454 Life Science systems
Biosystems HeliScope™ Single Molecule
Sequencer.
 Pacific Biosystems PACBIO RS.

6.  Tabela 1: Principais características técnicas das plataformas
454 GS-FLX, ILLUMINA E SOLID
Fonte: Adaptado de: Metzker 2010; Carvalho & Silva 2010.

7. RNA seq
 Após o sequenciamento os resultados
são alinhados num genoma de referência
ou montados de novo.
Genoma de referência
“Ab initio”
Montados de novo

8.  Preferencialmente o método “Ab initio”;
 Quando não se possui genoma de referência pode ser
utilizado na montagem o genoma de um organismo
filogenéticamente próximo;
 Combinando as duas estratégias: mesmo que se possua o
genoma de referência, é recomendado alinhar novamente
usando o alinhamento gerado “de novo”;
 Método “de novo” é mais efetivo quando utilizado em
genomas de procariontes; pois esta abordagem está mais
suscetível a erros de sequenciamento, gera transcritos mais
fragmentados, além de um volume de dados computacionais
muito maior.

9. Análise dos dados após
o Sequenciamento:
Quantificação do nível de
expressão gênica
Fonte: Marthin & Whang 2011

10. RNA seq
 Aplicação RNAseq.
CDS 1 CDS 2
Ambiente Normal
CDS 1 CDS 2
Estresse térmico
CDS 1 CDS 2
Estresse osmótico

11. RNA seq
 Vantagens.
- Permite detectar transcritos mesmo sem a presença de um
genoma de referência;
- Pode detectar variações nas sequencias genômicas;
- Possuem pouco ruído de fundo, podendo ser mapeado sem
ambiguidade em regiões distintas do genoma;
- Requer uma quantidade muito menor de amostras de RNA;
- Já revelou várias regiões de transcrição e isoformas de
splicing novas de genes conhecidos;
- Capaz de rastrear com acurácia as mudanças na expressão
gênica durante diferentes estágios da diferenciação de
células e do desenvolvimento de alguns organismos.

12. Fonte: Wang et al. 2009

13. RNA seq
 Desvantagens.
- Moléculas de RNA necessitam ser fragmentadas para que possam se
adequar às tecnologias de sequenciamento de nova geração,
podendo em cada processo de fragmentação influenciar no resultado
produzido;
- Por usar sequenciamento de larga escala, enfrenta desafios durante o
armazenamento, recuperação e processamento das grandes
quantidades de dados gerados;
- Permite maior cobertura e por isso requer mais sequenciamento que,
por sua vez, aumenta o custo;
- Para sua validação é exigido o uso de triplicatas para cada
experimento;
- Sujeito a erros de sequenciamento devido ao grande volume de
dados gerados, sendo necessário dedicar maior tempo na análise
pós-montagem para resolvê-los

14.  Perspectivas RNA seq
 Embora o RNA-seq ainda seja um método pouco utilizado
devido a seu recente desenvolvimento, ele possui muitas
vantagens em relação a outros métodos, como o
microarray podendo vir a substitui-lo;
 Os próximos desafios a esta metodologia é ser
amplamente utilizada em genomas mais complexos para
identificar níveis de expressão de transcritos raros;
 O uso de novas tecnologias (sequenciamento pair-end e
strand specif) podem vir a facilitar esta meta permitindo
uma maior cobertura genômica com o uso de sequencias
longas (reads);

15. RNA seq
 Ampla utilização em mais organismos, como plantas
poliplóides, comunidades de microorganismos
(metatranscriptômica);
 Avanços nos sistemas computacionais e nos próprios
computadores, permitindo um maior rapidez na análise
dos dados;
 Futuro da “montagem” transcriptômica: “Não será
necessário montar” (Martin & Wang 2009).

16. RNA seq
 Aplicações no estudo de doenças genéticas.

17. RNA seq
 Aplicações no estudo de doenças genéticas.
- Detecta alterações na molécula de RNA em células
cancerosas;
- Permite identificar níveis de expressão e de novos
transcritos;
- Identifica mecanismos de splicing alternativo e
fusões gênicas;
- Detecta mutações, entre elas rearranjos
cromossômicos, que levam a transcritos quiméricos;

18. Obrigada!!