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Introdução
• Os
antibióticos
β-Lactâmicos
interferem na síntese da parede
celular bacteriana. A penicilina
acopla num rece...
Introdução
• Inicialmente, a primeira forma de
defesa bacteriana descoberta era
mediada pela expressão da
enzima β-Lacmata...
Introdução
Mecanismo de resistência

Importância Clínica

• A resistência dos MRSA aos βLactâmicos se dá pela aquisição do...
Objetivos
• 4 linhagens isoladas de MRSA, que não possuíam os genes mecA
ou mecC, mas ainda sim eram fenotipicamente resis...
Métodos
• Os isolados foram cultivados em
placa Agar sangue e em caldo TSB a
37°C.
• Os
testes
de
sensibilidade
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Métodos
• O DNA dos isolados foi extraído
em overnight cultures usando o
MasterPure Gram-positive DNA
Purification Kit.
• ...
BLAST – ferramenta básica de busca por alinhamentos locais
• Existem variações nos programas BLAST, mas todos
compartilham...
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
Resultados
• Foram identificadas 4 mecA/C-negative isolados (XB84,
XB85, XB86 e XB87) que exibiam resistência a
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Resultados
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Resultados
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Resultados
• Além da β-Lactamase e da PBP2a, outras cinco proteínas (PBP2,
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Resultados: substituições de aminoácidos
• 1º Lugar: substituição no domínio da transpeptidase PBP1.
XB85 (ST1)

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Resultados: substituições de aminoácidos
• 2º Lugar: Substituição no domínio da transpeptidase de PBP2.
XB84 (ST15)

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Resultados: substituições de aminoácidos
• 3º Lugar: compartilhamento da substituição no domínio da
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• Um número de substituições únicas também foram encontradas
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Discussão
• Neste trabalho foram identificados MRSA isolados pertencentes a
três STs. Esta resistência não parece ser medi...
Discussão
• Dado o pequeno número de isolados nesse estudo, a busca alvo
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Referências
• Biologia molecular do Gene. 5º edição, James D. Watson [et al]
• Microbiologia / Gerard Tortora, Berdell R. ...
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Estudos sobre os possíveis mediadores da resistência dos MRSA mecA/C-negativos à antibióticos betal-lactâmicos.

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Novel mutations in penicillin binding protein genes in clinical staphylococcus Aureus

  1. 1. Novel mutations in penicillin-binding protein genes in clinical Staphylococcus aureus isolates that are methicillin resistance on susceptibility testing, but lack the mec gene. Xiaoliang Ba, Ewan M. Harrison, Giles F. Edwards, Matthew T. G. Holden, Anders Rhod Larsen, Andreas Petersen, Robert L. Skov, Sharon J. Peacock, Julian Parkhill, Gavin K. Paterson and Mark A. Holmes George Alves do Nascimento Biologia Molecular Aplicada a Farmácia
  2. 2. Introdução • Os antibióticos β-Lactâmicos interferem na síntese da parede celular bacteriana. A penicilina acopla num receptor presente na membrana interna bacteriana (PBP) e interfere com a transpeptidação que ancora o peptidoglicano estrutural em volta da bactéria, impedindo a síntese da parede celular bacteriana.
  3. 3. Introdução • Inicialmente, a primeira forma de defesa bacteriana descoberta era mediada pela expressão da enzima β-Lacmatamase. • Com o objetivo de escapar da ação da β-Lactamase, foi criada a primeira penicilina semi-sintética. A meticilina. • Porém, desde sua introdução, em 1961, surgiram várias linhagens de SA que haviam desenvolvido resistência a meticilina, os MRSA, sendo estes resistentes a maioria dos antibióticos β-Lactâmicos. Desenvolvimento da Oxacilina.
  4. 4. Introdução Mecanismo de resistência Importância Clínica • A resistência dos MRSA aos βLactâmicos se dá pela aquisição do gene mecA ou seu variante, o gene mecC, que codificam uma (PBP)2a alternativa, que tem menor afinidade pelos antibióticos β-Lactâmicos. • Também tem sido estudada a resistência a oxacilina (BORSA), atribuindo essa resistência a superprodução de β-Lactamase e também à mutações cromossômicas. • A detecção dos mec genes ou da PBP2a, são padrão ouro no diagnóstico de MRSA.
  5. 5. Objetivos • 4 linhagens isoladas de MRSA, que não possuíam os genes mecA ou mecC, mas ainda sim eram fenotipicamente resistentes aos antibióticos β-Lactâmicos, foram estudas quanto ao possível mediador dessa resistência. • As 4 linhagens tiveram seus genomas sequenciados e analisados em uma gama de ensaios fenotípicos. • MRSA mec-negativos podem ser causas de infecções em seres humanos , mas podem ser classificados como susceptíveis a meticilina, com base apenas nos testes para PBP2a e mec genes. Um potencial motivo para a falha do tratamento.
  6. 6. Métodos • Os isolados foram cultivados em placa Agar sangue e em caldo TSB a 37°C. • Os testes de sensibilidade antimicrobiana foram realizados usando um disco de susceptibilidade de acordo com os critérios da BSAC (Methods for Antimicrobial Susceptibility Testing). • Os isolados foram testados para produção de β-Lactamase usando o β-Lactamase (nitrocefin) indentification sticks.
  7. 7. Métodos • O DNA dos isolados foi extraído em overnight cultures usando o MasterPure Gram-positive DNA Purification Kit. • A sequencia genômica foi obtida através da Illumina Library e Hiseq sequencing. • Os genes que codificam as PBP foram identificados usando o software BLAST.
  8. 8. BLAST – ferramenta básica de busca por alinhamentos locais • Existem variações nos programas BLAST, mas todos compartilham a característica comum de encontrar regiões de similaridade entre diferentes genes codificantes de proteínas. • Uma pesquisa BLAST permite que um investigador compare uma sequencia fornecida em uma consulta com uma biblioteca ou base de dados de sequências e identificar as bibliotecas de sequências que se assemelham à sequência consultada e que estejam acima de um certo grau de semelhança.
  9. 9. http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
  10. 10. Resultados • Foram identificadas 4 mecA/C-negative isolados (XB84, XB85, XB86 e XB87) que exibiam resistência a penicilinas. Pertencentes ao STs 15, 1, 15, 8 respectivamente. • Todos os quatro apresentaram resistência a oxacilina, cefoxitin e penicilina nos testes de sensibilidade (BSAC), exceto XB84 que apresentou um limite de tolerância para oxacilina.
  11. 11. XB84 XB85 Positivo para a produção de βLactamase, medidos pelo Nitrocefin XB86, Resultado negativo para a produção de β-Lactamase XB87
  12. 12. Resultados • Para melhor elucidar a base molecular da resistência, os quatros isolados tiveram seu genoma sequenciado. • Isso confirmou que nenhum dos isolados continha os mec genes A/C ou nenhuma sequencia homologa a estes.
  13. 13. Resultados • Depois foi usado o BLAST para identificar outros isolados numa coleção genômica, que compartilhassem 100% de identidade de nucleotídeos ao longo todo o locus da β-Lactamase (bla) (blaz, blaI, blaR). • Foram identificado 3 isolados com o gene blaZ tipo A e 12 isolados com o gene blaZ tipo C, sendo testada a resistência desses isolados a oxacilina e cefoxitin ( Dados não foram inclusos). • Nenhuma associação foi encontrada entre a presença do blaZ gene em sua varias formas e a resistência. • Realizou-se testes de susceptibilidade nestes isolados, agora na presença do acido clavulânico, nas proporções 2:1 ou 1:1. • Nenhuma redução foi vista nas zonas de inibição da oxacilina, cefoxitin ou penicilina em combinação com o ácido clavulânico. Isso sugere que a βlactamase não é a mediadora da resistência.
  14. 14. Resultados • Além da β-Lactamase e da PBP2a, outras cinco proteínas (PBP2, PBP4, GdpP, YjbH, e AcrB) veem sendo relatadas por estarem associadas a resistência em SA. • As sequencias de DNA dos quatro isolados que codificam as cinco proteínas foram comparadas com um painel de isolados sensíveis pertencentes aos mesmos STs. • Foi descoberto um pequeno número de substituições de aminoácidos presentes nas PBP1, 2, 4 e YjbH em um ou mais isolados resistentes mais ausente nas sensíveis.
  15. 15. Resultados: substituições de aminoácidos • 1º Lugar: substituição no domínio da transpeptidase PBP1. XB85 (ST1) XB86 (ST15) XB87 (ST8) Substituição His 449 Tyr
  16. 16. Resultados: substituições de aminoácidos • 2º Lugar: Substituição no domínio da transpeptidase de PBP2. XB84 (ST15) XB86 (ST15) XB87 (ST8) Thr – 552 Ile
  17. 17. Resultados: substituições de aminoácidos • 3º Lugar: compartilhamento da substituição no domínio da transpeptidase PBP3. XB84 (ST15) XB85 (ST1) XB86 (ST15) Ser – 664 Phe
  18. 18. Resultados: substituição de aminoácidos • Foi identificado duas diferentes substituições não conservativas na mesma posição do domínio da transpeptidase PBP1: Tyr - 336 Asn Tyr - 336 Cys
  19. 19. Resultados: substituições de aminoácidos • Um número de substituições únicas também foram encontradas em um dos isolados resistentes que estavam ausentes nos isolados sensíveis do mesmo ST. • Duas outras substituições foram encontradas em PBP2: Thr – 31 Met em XB85 Asp – 156 Tyr em XB86 Thr – 371 Ile em XB85 no domínio de PBP1.
  20. 20. Discussão • Neste trabalho foram identificados MRSA isolados pertencentes a três STs. Esta resistência não parece ser mediada por hiperprodução de β-Lactamase. • Também foi identificada uma série de novas substituições nos domínios das transpeptidase das PBPs 1, 2, 3 que poder ser os mediadores dessa resistência. • Os domínios das transpeptidases, são o alvo dos antibióticos βLactâmicos e substituições nesses domínios reduzem a eficácia da acilação das PBP, proporcionando um certo grau de resistência.
  21. 21. Discussão • Dado o pequeno número de isolados nesse estudo, a busca alvo de mutações poderiam ter excluídos outros genes envolvidos na resistência. • Atualmente os MRSA mec-negativos não são amplamente divulgados. É importante caracterizar seu mecanismo de resistência, em especial para os laboratório clínicos, umas vez que o diagnóstico atual dos MRSA limita-se a detecção dos genes mecA/C ou da PBP2a.
  22. 22. Referências • Biologia molecular do Gene. 5º edição, James D. Watson [et al] • Microbiologia / Gerard Tortora, Berdell R. Funke. 8º edição.

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