UNIVERSIDADE DO SUL DE SANTA CATARINA                      UNISUL            CURSO DE QUÍMICA INDUSTRIAL VALIDAÇÃO ANALÍTI...
INTRODUÇÃO      Originada do Norte da África e do Mediterrâneo, a cinarina é citadadesde o século 4 a.C. como alimento e m...
JUSTIFICATIVA    O grande objetivo de uma indústria farmacêutica é produzir produtos deconfiança e qualidade já que este t...
OBJETIVOS OBJETIVO GERAL:    Desenvolver um método eficaz para análise de teor da Cinarina,avaliando-se a sensibilidade, ...
 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:  •   Realizar um levantamento bibliográfico com base na Resolução nº 899  da ANVISA e determinar ...
    OBJETIVOS ESPECÍFICOS:•   Demonstrar com a linearidade que os resultados encontrados sãodiretamente proporcionais às ...
CINARINA      Conhecida popularmente como Alcachofra, foi trazida para o Brasilpelos imigrantes europeus.      O extrato d...
CINARINAFigura 1. Estrutura química da cinarina. (1,5- dicafeoilquínico )Fonte: http:www.scielo.br
ESPECTROFOTÔMETRO UV-VIS    A espectrofotometria é uma das técnicas analíticas mais utilizadas devidoa robustez, custo bai...
METODOLOGIA VALIDADAQuadro 1. Classificação dos testes, segundo sua finalidade. Categoria                               Fi...
PLANO DE VALIDAÇÃOQuadro 2. Plano de validação segundo a classificação do analito.                                        ...
METODOLOGIAPREPARO DA SOLUÇÃO PADRÃO:     Pesar 2,5 mg de padrão referência de cinarina em uma balão de 25 mL, adicionar15...
PROCEDIMENTOQuadro 3. Preparo das amostras.                                TUBOS TESTE               TUBOS CONTROLE   REAG...
RESULTADOS E DISCUSSÕES SELETIVIDADE Quadro 4. Preparo das amostras para o ensaio de seletividade.                       ...
RESULTADOS E DISCUSSÕES SELETIVIDADEFigura 3. Varreduras das amostras.Fonte: Acervo próprio, 2012.
RESULTADOS E DISCUSSÕES LINEARIDADE  Quadro 5: Concentrações dos padrões de cinarina.                                    ...
RESULTADOS E DISCUSSÕES LINEARIDADE     Figura 4. Curva de Calibração      Fonte: Acervo próprio, 2012.
RESULTADOS E DISCUSSÕES PRECISÃO• REPETIBILIDADEQuadro 6. Resultados do ensaio de repetibilidade no período da manhã.    ...
RESULTADOS E DISCUSSÕES PRECISÃO• REPETIBILIDADEQuadro 7. Resultados para o ensaio de repetibilidade no período da tarde....
RESULTADOS E DISCUSSÕES PRECISÃOQuadro 8. Comparação dos resultados no período da manhã e tarde para oensaio de repetibil...
RESULTADOS E DISCUSSÕES PRECISÃO• INTERMEDIÁRIAQuadro 9. Resultados para o ensaio de precisão intermediária.    ANALISTA ...
RESULTADOS E DISCUSSÕES EXATIDÃO Quadro 10. Concentração das soluções para o ensaio de exatidão.                         ...
RESULTADOS E DISCUSSÕES     EXATIDÃOQuadro 11. Resultados obtidos no ensaio de exatidão.                                 ...
RESULTADOS E DISCUSSÕES EXATIDÃO   Quadro 12. : Recuperações obtidas no ensaio de exatidão para os 3 níveisavaliados.    ...
RESULTADOS E DISCUSSÕES ROBUSTEZ Quadro 13. Resultados obtidos no ensaio de robustez.                                    ...
RESULTADOS E DISCUSSÕES ADEQUABILIDADE DO SISTEMAQuadro 14. Resultados conforme o dia de análise.                        ...
CONCLUSÃO      Segundo a RE nº 899 da ANVISA uma validação analítica tem comoobjetivo demonstrar que o método é apropriado...
AGRADECIMENTOS       Primeiramente a Deus, por toda força e determinação para realizar estetrabalho.       Aos meus pais, ...
REFERÊNCIAS• ANVISA. Guia Para Validação de Métodos Analíticos e Bioanalíticos.  Resolução No 899 de 29 de maio de 2003.• ...
REFERÊNCIAS• PINTO, A.C.; SILVA, D.H.S.; BOLZANI, V.S. et al. Produtos naturais:  atualidade, desafios e perspectivas. Quí...
UNIVERSIDADE DO SUL DE SANTA CATARINA                      UNISUL            CURSO DE QUÍMICA INDUSTRIAL VALIDAÇÃO ANALÍTI...
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Validação analítica da cinarina

  1. 1. UNIVERSIDADE DO SUL DE SANTA CATARINA UNISUL CURSO DE QUÍMICA INDUSTRIAL VALIDAÇÃO ANALÍTICA DA CINARINAACADÊMICA: SILVIA DOS SANTOS NEVESORIENTADORA.:Dra MARIA ANA PIGNATEL MARCON MARTINS JUNHO, 2012
  2. 2. INTRODUÇÃO Originada do Norte da África e do Mediterrâneo, a cinarina é citadadesde o século 4 a.C. como alimento e medicamento. Foi muito apreciadapelos antigos romanos como um vegetal com efeitos benéficos para a digestão.(MARTIN BAUER GROUP). As folhas da alcachofra se caracterizam pela sua composição em ácidosfenólicos (até 2%), como ácido caféico, ácido clorogênico e cinarina;flavonoides (0,1 a 1%), e óleos voláteis. (CARVALHO, 2004).
  3. 3. JUSTIFICATIVA O grande objetivo de uma indústria farmacêutica é produzir produtos deconfiança e qualidade já que este tem o objetivo curativo ou preventivo dedoenças em seres humanos. A Cinarina, princípio-ativo do extrato Alcachofra, é usado no produtoAlcagest, produzido pela empresa Airela Indústria Farmacêutica Ltda., omesmo não possui método validado para determinação do teor. Sendo assim, viu-se a necessidade de desenvolver um método capaz dedeterminar o teor de Cinarina, tanto na matéria – prima como no produto final,um método eficiente e preciso, um método validado para o princípio-ativopresente na Alcachofra.
  4. 4. OBJETIVOS OBJETIVO GERAL: Desenvolver um método eficaz para análise de teor da Cinarina,avaliando-se a sensibilidade, através de um espectrofotômetro UV-VIS.
  5. 5.  OBJETIVOS ESPECÍFICOS: • Realizar um levantamento bibliográfico com base na Resolução nº 899 da ANVISA e determinar quais parâmetros deverão ser avaliados na validação do método analítico do princípio – ativo Cinarina. • Desenvolver o Protocolo e o Relatório de Validação do Teor de Cinarina, contendo todos os procedimentos detalhados a serem seguidos. • Certificar através da seletividade que o método é capaz de determinar o princípio ativo em presença de outros componentes. • Construir uma curva de calibração avaliando a relação CONCENTRAÇÃO X ABSORVÂNCIA.
  6. 6.  OBJETIVOS ESPECÍFICOS:• Demonstrar com a linearidade que os resultados encontrados sãodiretamente proporcionais às concentrações da substância ativa noextrato, dentro de um intervalo especificado.• Estimar a partir da precisão a concordância entre os resultados obtidos.• Demonstrar através da exatidão que os resultados encontrados com ométodo desenvolvido têm proximidade em relação ao valor verdadeiro.• Certificar com a robustez a confiabilidade do método em estudo.• Implantar o método validado para a determinação da cinarina, tanto paramatéria – prima como para o produto final.
  7. 7. CINARINA Conhecida popularmente como Alcachofra, foi trazida para o Brasilpelos imigrantes europeus. O extrato de alcachofra é utilizado para tratar problemas como:• Gastrite;• Meteorismo;• Flatulência;• Doença do trato biliar funcional.
  8. 8. CINARINAFigura 1. Estrutura química da cinarina. (1,5- dicafeoilquínico )Fonte: http:www.scielo.br
  9. 9. ESPECTROFOTÔMETRO UV-VIS A espectrofotometria é uma das técnicas analíticas mais utilizadas devidoa robustez, custo baixo e grande número de aplicações desenvolvidas. Figura 2. Esquema espectrofotômetro UV-VIS. Fonte: http:www.infoescola.com.br
  10. 10. METODOLOGIA VALIDADAQuadro 1. Classificação dos testes, segundo sua finalidade. Categoria Finalidade do teste Testes quantitativos para a determinação do princípio ativo em produtos I farmacêuticos ou matérias–primas Testes quantitativos ou ensaio limite para a determinação de impurezas II e produtos de degradação em produtos farmacêuticos e matérias-primas III Testes de performance (por exemplo: dissolução, liberação do ativo) IV Testes de identificaçãoFonte: Resolução nº 899, ANVISA.
  11. 11. PLANO DE VALIDAÇÃOQuadro 2. Plano de validação segundo a classificação do analito. CATEGORIA II CATEGORIA CATEGO CATEGORIA PARÂMETRO QUANTITATI ENSAIO I RIA III IV VO LIMITE Especificidade Sim Sim Sim * Sim Linearidade Sim Sim Não * Não Intervalo Sim Sim * * Não Repetibilid Sim Sim Não Sim Não ade Precisão Intermediár ** ** Não ** Não ia Limite de detecção Não Não Sim * NãoLimite de quantificação Não Sim Não * Não Exatidão Sim Sim * * Não Robustez Sim Sim Sim Não NãoFonte: Resolução nº 899, ANVISA.
  12. 12. METODOLOGIAPREPARO DA SOLUÇÃO PADRÃO: Pesar 2,5 mg de padrão referência de cinarina em uma balão de 25 mL, adicionar15 mL de uma solução 1:1 de metanol e água. Agitar a solução em ultrasson por 10minutos, completar o volume com o mesmo solvente e filtrar a solução por papel filtro.PREPARO DA SOLUÇÃO AMOSTRA: Pesar 500,0 mg do extrato de alcachofra em um balão de 25 mL, adicionar 15 mLde uma solução 1:1 de metanol e água. Agitar a solução em ultrasson por 10minutos, completar o volume com o mesmo solvente e filtrar a solução por papel filtro.
  13. 13. PROCEDIMENTOQuadro 3. Preparo das amostras. TUBOS TESTE TUBOS CONTROLE REAGENTE BRANCO 1 2 3 C1 C2 C3Solução amostra 0,9 1,0 1,1 0,9 1,0 1,1 -(mL)Água purificada 4,1 4,0 3,9 4,35 4,25 4,15 10,0(mL)Tampão Acetato 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,5(mL)NaNO2 40% 0,25 0,25 0,25 - - - 0,5(mL)* Deixar em repouso durante 3 minutos.NaOH 10% (mL)* 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,5Fonte: Acervo próprio.
  14. 14. RESULTADOS E DISCUSSÕES SELETIVIDADE Quadro 4. Preparo das amostras para o ensaio de seletividade. EXTRATO AMIDO PADRÃO CONCENTRAÇÃO AMOSTRAS ALCAHOFRA (mg) CINARINA (mg) CINARINA (mg/mL) (mg) Extrato - 500,30 - 0,0949 Extrato + Amido 50,20 501,07 - 0,0971 Branco - - - - Padrão Cinarina - - 2,7 0,1132 Fonte: Acervo próprio, 2012.
  15. 15. RESULTADOS E DISCUSSÕES SELETIVIDADEFigura 3. Varreduras das amostras.Fonte: Acervo próprio, 2012.
  16. 16. RESULTADOS E DISCUSSÕES LINEARIDADE Quadro 5: Concentrações dos padrões de cinarina. CONC. ABSORBÂNC ABSORBÂNCI ABSTUBON- CURVA AMOSTRA CONTROLE (mg/mL) IA A ABSCN Tubo 1 – 80% 0,0144 0,396 C1 0,067 0,329 Tubo 2 – 90% 0,0162 0,454 C2 0,065 0,389 1ª CURVA Tubo 3 – 100% 0,0179 0,514 C3 0,071 0,443 Tubo 4 – 110% 0,0197 0,569 C4 0,072 0,497 Tubo 5 – 120% 0,0215 0,628 C5 0,077 0,551 Tubo 1 – 80% 0,0144 0,399 C1 0,065 0,334 Tubo 2 – 90% 0,0162 0,463 C2 0,069 0,394 2ª CURVA Tubo 3 – 100% 0,0179 0,516 C3 0,071 0,445 Tubo 4 – 110% 0,0197 0,553 C4 0,076 0,477 Tubo 5 – 120% 0,0215 0,615 C5 0,08 0,535 Fonte: Acervo próprio, 2012.
  17. 17. RESULTADOS E DISCUSSÕES LINEARIDADE Figura 4. Curva de Calibração Fonte: Acervo próprio, 2012.
  18. 18. RESULTADOS E DISCUSSÕES PRECISÃO• REPETIBILIDADEQuadro 6. Resultados do ensaio de repetibilidade no período da manhã. CONC. NA ABSOR CONTRO ABSTUBON- QUANTIDADE TEORAMOSTRA ABSORBÂNCIA AMOSTRA BÂNCIA LE ABSCN (mg) (%) (mg/mL) Tubo 1 0,528 C1 0,119 0,409 0,0971 0,4856 0,486 Tubo 2 0,523 C2 0,121 0,402 0,0957 0,4786 0,479 Tubo 3 0,522 C3 0,121 0,401 0,0955 0,4776 0,478 Tubo 4 0,519 C4 0,121 0,398 0,0949 0,4746 0,475 Tubo 5 0,515 C5 0,120 0,395 0,0943 0,4716 0,472 Tubo 6 0,529 C6 0,120 0,409 0,0971 0,4856 0,489Fonte: Acervo próprio, 2012.
  19. 19. RESULTADOS E DISCUSSÕES PRECISÃO• REPETIBILIDADEQuadro 7. Resultados para o ensaio de repetibilidade no período da tarde. CONC. NA ABSOR CONTRO ABSTUBON- QUANTIDADE TEORAMOSTRA ABSORBÂNCIA AMOSTRA BÂNCIA LE ABSCN (mg) (%) (mg/mL) Tubo 1 0,520 C1 0,127 0,393 0,0939 2,3487 0,470 Tubo 2 0,522 C2 0,123 0,399 0,0951 2,3785 0,476 Tubo 3 0,527 C3 0,123 0,404 0,0961 2,4034 0,481 Tubo 4 0,521 C4 0,122 0,399 0,0951 2,3785 0,476 Tubo 5 0,517 C5 0,122 0,395 0,0943 2,3586 0,472 Tubo 6 0,523 C6 0,121 0,402 0,0957 2,3934 0,479Fonte: Acervo próprio, 2012.
  20. 20. RESULTADOS E DISCUSSÕES PRECISÃOQuadro 8. Comparação dos resultados no período da manhã e tarde para oensaio de repetibilidade. PERÍODO AMOSTRA TEOR (%) MÉDIA DPR Tubo 1 0,486 Tubo 2 0,479 Tubo 3 0,478 MANHÃ Tubo 4 0,475 Tubo 5 0,472 Tubo 6 0,489 0,477 1,023 Tubo 1 0,470 Tubo 2 0,476 Tubo 3 0,481 TARDE Tubo 4 0,476 Tubo 5 0,472 Tubo 6 0,479Fonte: Acervo próprio, 2012.
  21. 21. RESULTADOS E DISCUSSÕES PRECISÃO• INTERMEDIÁRIAQuadro 9. Resultados para o ensaio de precisão intermediária. ANALISTA AMOSTRA TEOR (%) MÉDIA DPR Tubo 1 0,486 Tubo 2 0,479 Tubo 3 0,478 ANALISTA 1 Tubo 4 0,475 Tubo 5 0,472 Tubo 6 0,486 0,483 2,069 Tubo 1 0,461 Tubo 2 0,491 Tubo 3 0,496 ANALISTA 2 Tubo 4 0,492 Tubo 5 0,494 Tubo 6 0,490Fonte: Acervo próprio, 2012.
  22. 22. RESULTADOS E DISCUSSÕES EXATIDÃO Quadro 10. Concentração das soluções para o ensaio de exatidão. CONCENTRAÇÃO PADRÃO CINARINA CINARINA (mg/mL) AMOSTRA CONC. PESADO PUREZA PESO SOL. MÃE 80% 100% 120% (mg) (%) CORRIGIDO (mg/mL) Sol. Mãe Padrão 2,75 99,49 2,74 0,10944 0,01523 0,01903 0,02284 de Cinarina Fonte: Acervo próprio, 2012.
  23. 23. RESULTADOS E DISCUSSÕES  EXATIDÃOQuadro 11. Resultados obtidos no ensaio de exatidão. MÉDIA ABSORBÂN CONTRO ABSTUBON- CONC. MÉDIAAMOSTRA ABSORBÂNCIA CORRIGIDA CIA LE ABSCN (mg/mL) (mg/mL) (mg/mL) Placebo- 1 0,006 C1 0,003 0,003 0,0028 Placebo - 2 0,006 C2 0,003 0,003 0,0028 0,0028 0,0001 Placebo - 3 0,006 C3 0,003 0,003 0,0028 80% - 1 0,41 C1 0,067 0,343 0,0146 80% - 2 0,42 C2 0,067 0,353 0,0150 0,0149 0,0148 80% - 3 0,426 C3 0,067 0,359 0,0152 100% - 1 0,506 C1 0,074 0,432 0,0177 100% - 2 0,52 C2 0,074 0,446 0,0182 0,0180 0,0179 100% - 3 0,518 C3 0,074 0,444 0,0181 120% - 1 0,63 C1 0,067 0,563 0,0222 120% - 2 0,622 C2 0,067 0,555 0,0219 0,0220 0,0219 120% - 3 0,622 C3 0,067 0,555 0,0219Fonte: Acervo próprio, 2012.
  24. 24. RESULTADOS E DISCUSSÕES EXATIDÃO Quadro 12. : Recuperações obtidas no ensaio de exatidão para os 3 níveisavaliados. CONC. TEÓRICA CONC. PRÁTICA RECUPERAÇÃO RECUPERAÇÃO AMOSTRA (mg/mL) (mg/mL) (%) MÉDIA (%) 80% - 1 0,01523 0,01450 95,26 80% - 2 0,01523 0,01485 97,53 97,23 80% - 3 0,01523 0,01506 98,89 100% - 1 0,01903 0,01758 92,65 94,23 100% - 2 0,01903 0,01801 95,20 100% - 3 0,01903 0,01800 94,84 120% - 1 0,02284 0,02212 100,50 99,66 120% - 2 0,02284 0,02184 99,24 120% - 3 0,02284 0,02184 99,24Fonte: Acervo próprio, 2012.
  25. 25. RESULTADOS E DISCUSSÕES ROBUSTEZ Quadro 13. Resultados obtidos no ensaio de robustez. MÉDIA ABS. MÉDIA ABS. PARÂMETRO MODIFICADO TEOR (%) DPR TESTE CONTROLE 8 0,518 0,124 0,52 0,00 Tempo de extração 10 0,512 0,119 0,52 - (min) 12 0,505 0,110 0,52 0,00 Tempo de reação do 2 0,505 0,115 0,52 1,30 nitrito de sódio 3 0,523 0,120 0,53 - (min) 4 0,532 0,121 0,54 1,30 Imediatamente 0,523 0,120 0,53 - Tempo de leitura no 5 0,56 0,121 0,57 5,10 uv-vis (min) 10 0,55 0,109 0,58 6,40 Marca do nitrito de Fmaia 0,523 0,120 0,53 - sódio Synth 0,524 0,126 0,52 1,30 Marca do hidróxido Vetec 0,523 0,120 0,53 - de sódio Synth 0,530 0,125 0,53 00 Temperatura das 23 0,512 0,119 0,52 - soluções (ºc) 15 0,520 0,120 0,53 1,30 Fonte: Acervo próprio, 2012.
  26. 26. RESULTADOS E DISCUSSÕES ADEQUABILIDADE DO SISTEMAQuadro 14. Resultados conforme o dia de análise. CONC. NA REAGEN CONTRO TEOR AMOSTRA ABSORBÂNCIA ABSORBÂNCIA AMOSTRA DPR TES LE (%) (mg/mL) Soluções Tubo 1 0,489 C1 0,116 0,0900preparadas Tubo 2 0,517 C2 0,122 0,0943 0,477 no dia Tubo 3 0,56 C3 0,127 0,1019 Tubo 1 0,485 C1 0,112 0,0900 0,562 Soluções Tubo 2 0,511 C2 0,118 0,0939 após 24 h 0,471do preparo Tubo 3 0,543 C3 0,124 0,0991Fonte: Acervo próprio, 2012.
  27. 27. CONCLUSÃO Segundo a RE nº 899 da ANVISA uma validação analítica tem comoobjetivo demonstrar que o método é apropriado para a finalidade pretendida,ou seja, a determinação qualitativa, semi-quantitativa e/ou quantitativa defármacos e outras substâncias em produtos farmacêuticos Com os resultados aqui demonstrados é possível afirmar que o métododesenvolvido utilizando espectrofotômetro UV-VIS, é confiável nadeterminação do teor. O método desenvolvido e validado mostrou resultadospositivos na seletividade, linearidade, precisão exatidão e robustez, que sãocritérios para que um método possa ser validado.
  28. 28. AGRADECIMENTOS Primeiramente a Deus, por toda força e determinação para realizar estetrabalho. Aos meus pais, pelo apoio e confiança à mim depositada durante todosestes anos. À orientadora de estágio, Professora Maria Ana Pignatel, pela dedicaçãodurante a realização deste trabalho. À supervisora de campo, Letícia Rechia, pela dedicação e ajuda durante operíodo de estágio. À empresa Airela Indústria Farmacêutica por me proporcionar a realizaçãodesta pesquisa e por fim, a elaboração deste método . À todos meus colegas, de trabalho e do próprio curso, que me apoiaram eme ajudaram nesta etapa.
  29. 29. REFERÊNCIAS• ANVISA. Guia Para Validação de Métodos Analíticos e Bioanalíticos. Resolução No 899 de 29 de maio de 2003.• CALIXTO; J.B. Medicamentos Fitoterápicos. In: YUNES, R. A. & CALIXTO, J. B. (Orgs.). Plantas medicinais sob a ótica da química medicinal moderna. Chapecó: Argos, 2001. p.297-315• CARVALHO, J.C.T.; GOSMANN, G.; SCHENKEL, E.P. Compostos fenólicos simples e heterosídicos. In: Farmacognosia: da planta ao medicamento. 5 ed. rev. ampl., primeira reimpressão. Porto Alegre/Florianópolis: Editora da UFRGS/Editora da UFSC, 2004. p. 371- 400.• MIGUEL, M.D.; MIGUEL, O.G. Desenvolvimento de fitoterápicos. Ribeirão Preto: Tecmedd, 2004. 115p.• NOLDIN, F.V.; CECHINEL, V. et al. Composição química e atividades biológicas das folhas de Cynara scolymus L. (alcachofra) cultivada no Brasil. Química Nova: vol.26 no.3 São Paulo May/June 2003. Disponível em:http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0100- 40422003000300008&script=sci_arttext. Acesso em: 11 jun, 2012.
  30. 30. REFERÊNCIAS• PINTO, A.C.; SILVA, D.H.S.; BOLZANI, V.S. et al. Produtos naturais: atualidade, desafios e perspectivas. Quím. Nova, São Paulo, v. 25, supl. 1, p.45-61, 2002.• VEIGA JUNIOR, V.F.; PINTO, A.C.; MACIEL, M.A.M. Plantas medicinais: cura segura ? Quím. Nova, São Paulo, v. 28, n. 3, p.519-528, 2005.• SIANI, A.C. (Coord.). Desenvolvimento tecnológico de fitoterápicos: plataforma metodológica. Rio de Janeiro: Scriptorio, 2003. 97p.• RIBEIRO, C.A.F. Justifica-se o uso de extractos de plantas medicinais na terapêutica da ansiedade e da depressão? Revista Saúde Mental, v. II, n.4, p. 9- 14, 2000.• MARTIN BAUER GROUP: Encarte de apresentação• MARTINEZ, Marina. Materiais de Laboratório. Espectrofotômetro. Publicado em: 21/07/2010. Disponível em:http://www.infoescola.com/materiais-delaboratorio/espectrofotometr Acesso em: 11 jun, 2012.
  31. 31. UNIVERSIDADE DO SUL DE SANTA CATARINA UNISUL CURSO DE QUÍMICA INDUSTRIAL VALIDAÇÃO ANALÍTICA DA CINARINAACADÊMICA: SILVIA DOS SANTOS NEVESORIENTADORA.:Dra MARIA ANA PIGNATEL MARCON MARTINS JUNHO, 2012

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