Protease alcalina

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Protease alcalina

  1. 1. PRODUÇÃO DE ENZIMAS DE ORIGEM ANIMAL Tropical fish alkaline proteases as a laundry detergent additive ESPÓSITO, T. S., 2006 Recife-Brasil Apresentação: Gleiciane Pinheiro e Mauren Silveira
  2. 2. ENZIMAS
  3. 3. ENZIMAS DE ORIGEM ANIMAL Produção de enzimas de origem animal Enzima Origem Extração Uso Pancreatina Pâncreas de porco Adição de Auxiliar digestivo etanol Renina Suco gástrico do Adição de Elaboração de quarto estômago ácido queijos italianos; do bezerro Preparação de pudins. Pepsina Mucosa do Ácido Auxiliar digestivo; estômago de clorídrico _ Produção de porco hidrolisados protéicos. Catalase Fígado e sangue Adição de Degradação do de (boi e porco). acetona peróxido de hidrogênio
  4. 4. PROCESSO GERAL DE EXTRAÇÃO ENZIMÁTICA • Extraídas em solução aquosa antes de serem processadas.• Tecidos são secos e triturados em partículas pequenas e finas • Tecidos ainda úmidos são desintegrados (moinhos ou homogeneizadores)• Materiais são então, extraídos com água ou solução tampão adequada• Resíduos insolúveis removidos por filtração ou centrifugação (terra diatomácea é adicionada como auxiliar de filtração do extrato ou da solução de enzima bruta).
  5. 5. PRINCIPAIS INDÚSTRIAS CONSUMIDORAS DE ENZIMAS
  6. 6. CLASSIFICAÇÃO DAS ENZIMAS
  7. 7. PROTEASES
  8. 8. SUBCLASSIFICAÇÃO DAS ENDOPEPTIDASES
  9. 9. MODO DE AÇÃO DAS PROTEASES
  10. 10. DETERGENTES EM PÓ Proteases: pH 9.0-12.0 - Mais utilizadas em detergentes - Removem manchas de ovo, sangue, suor, extratos vegetais,... - Detergentes sem enzimas: ineficiente para remover manchas de proteínas.Aplicação enzimática em - Proteases Alcalinas:detergentes no Brasil: Possuem pH ótimo alcalino e-Organon (1968) atuam em temperatura elevada- Biopresto (Unilever)- Henkel – Viva (1978-1984)- Gessy lever: Omo (1989) –líder de mercado
  11. 11. VANTAGEM DA PROTEASE ALCALINA ANIMAL • MANTÉM ESTÁVEL MESMO COM ALTAS CONCENTRAÇÕES DE H2O2 (10%) • A ESTABILIDADE DAS OUTRAS REQUER ENGENHARIA GENÉTICA QUE AUMENTA CUSTOS • H2O2 É O BRANQUEADOR
  12. 12. PROCESSO DE EXTRAÇÃO DA PROTEASE ALCALINA DE TAMBAQUI20 mg/ mL de EXTRATO CENTRÍFUGA Centrífuga vísceras BRUTO 10 MIN 4°C 10 min 10°C +0,9% NaCl 45°C-30 min SOBRENADANTE + 0,05 M tris HCl 300 mL pH 8.0 2hr + ETANOL 4°C 2X CENTRÍFUGAFRAÇÃO 1: + 75 mL de 15 min 4°C tris HCl 0,1 M ETANOL: pH 8.0 25°C FRAÇÃO 1: 0-30% FRAÇÃO 2: IDEM FRAÇÃO 2: 30-70%
  13. 13. PURIFICAÇÃO• Purificações baseadas no tamanho da molécula (centrifugação)• Purificações fundamentadas nas diferenças de solubilidade (sal e/ou solventes)• Purificações baseadas na carga elétrica ponto isoeletrico- não reage e precipita• Purificações fundamentadas na separação por adsorção seletiva (cromatografia de afinidade)
  14. 14. 1: SDS-PAGE de Proteínas padrões 2: SDS-PAGE de Proteínas do extrato bruto 3: SDS-PAGE de Proteínas precipitadas com 30-70% de etanol 4: Extrato bruto ( atividade proteolítica na azo-caseína) 5: Precipitado com etanol 30-70% (atividade proteolítica na azo-caseína)66 kDa –46 kDa –36 kDa –29 kDa –24 kDa –14 kDa – 1 2 3 4 5
  15. 15. ATIVIDADE PROTEOLÍTICA Atividade Proteína Atividade Rendimento TESTES Purificação Total Total (mg) Específica U/mg (%) Extrato Bruto 46,875 834 56.2 1.0 100.0 Extrato Bruto 44,574 623 71.6 1.3 95.1 aquecidoF1(0-30% etanol 6,971 448 15.6 0.3 14.9F2 (30-70%)etanol 35,114 481 73.0 1.3 74.9 Sobrenadante 1,921 97 19.8 0.4 4.1 final AZOCASEÍNA 1% + ESPECTROFOTOMETRIA PROTEASE 280-260 nm SULFOAMIDA ALARANJADA
  16. 16. MODO DE AÇÃO DAS PROTEASES
  17. 17. EFEITO DE INIBIDORES Atividade Enzimática Sustrato Benzamidina TLCK PMSF TPCK mU/mL BapNA 1.59 100% 98% 54%Suc-Phe-p- 0.04 96% 100% Nam
  18. 18. EFEITO DA TEMPERATURA Em pH 8.0Temperatura (a)Estabilidade Térmica (b)incubado 30 min 25°C e depois testada suaatividade proteolítica de 25°C-80°C
  19. 19. EFEITO DE pHProtease precipitada com Etanol Atividade Residual0.1 M FosfatoTris-HClNaOH/Glicina
  20. 20. EFEITO DE SURFACTANTES E OXIDANTES Atividade Residual %Surfactantes (1%) Depois 30 min Depois 60 min Saponina 117.5 118.4 Colato de Sódio 94.2 107.3 Tween 20 117.3 108.2 Tween 40 112.0 107.8 SDS 15.1 7.3
  21. 21. COMPATIBILIDADE Incubação 0,2 mg/mL de Protease 40°C Atividade Residual + 7 mg/mL de:Surf®Ala®Bem-te-vi®OmoMulti-Ação® Tempo/hr
  22. 22. INATIVAÇÃO EM H2O2Curva de Inativação em H2O2Enzima incubada a40°C com H2O2 em: Atividade Residual5%10%15% Tempo (min)
  23. 23. CONCLUSÕES Protocolos de extração de Proteases Alcalinas de Tambaqui com etanol são econômicos quando em escala industrial; São estáveis em surfactantes, com exceção do SDS; São estáveis na presença de altas concentrações de H2O2 sem gastos com manipulação genética ou preparações enzimáticas prévias; São compatíveis com vários tipos de detergentes em pó; Suportam altas temperaturas como as encontradas em máquinas de lavar com ciclo programado; São extraídos de resíduos da indústria alimentícia, não requerendo cuidados com meios e crescimento de biomassa; Retira da natureza um problema da indústria alimentícia.
  24. 24. OBRIGADA!

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