Nos últimos anos, várias técnicas moleculares(1) foram aplicados para a caracterização genética de leveduras,em particular, a Saccharomyces cerevisiae estirpes, espécies com grande importância em fermentações industriais. Marcadores moleculares, ideais devem ser numerosos, altamente polimórficos, fornecer resultados reprodutíveis e ser simples de ensaio (2)

1. Detection, distribution and selection of
microsatellites (SSRs) in the genome of the yeast
Saccharomyces cerevisiae as molecular markers
Elizabete Almeida
20170855
Biotecnologia vegetal II | Docente: António Ramos | Licenciatura: Biotecnologia Alimentar
Ano letivo:2018/2019 | 2º ano, 2º semestre

2. Introdução:
Nos últimos anos, várias técnicas moleculares(1) foram aplicados para a caracterização genética
de leveduras,em particular, a Saccharomyces cerevisiae estirpes, espécies com grande importância
em fermentações industriais.
Marcadores moleculares, ideais devem ser numerosos, altamente polimórficos,
fornecer resultados reprodutíveis e ser simples de ensaio (2)
Os microssatélites ou SSR (Repete uma sequência simples) são sequências de ADN
repetitivo em tandem de unidades curtas dispersos ao longo do genoma e co-dominante .
Locos de microssatélites de leveduras têm um alto grau de variabilidade(2) tem uma
aplicação muito importante como sequence-tagged site (STS) marcadores (Beckmann e
Soller 1990), dando origem a um desenvolvimento inovador na análise genética destes
organismos eucarióticos. Speci®cally o genoma de S. cerevisiae tem uma abundância de
microssatélites, que são genoma de S. cerevisiae tem uma abundância de microssatélites,
que são genoma de S. cerevisiae tem uma abundância de microssatélites, que são
distribuídos ao longo dos seus cromossomas 16, dando origem a numerosos alelos
polimórficos(3) e também estão presentes no ADN mitocondrial (4)

3. Microssatélites
Alguns microssatélites foram usados ​​com sucesso para caracterizar e
discriminação entre S. cerevisiae estirpe(5)
Por outro lado, o Saccharomyces Genoma de banco de dados (SGD) foi estabelecido, para
fornecer um meio conveniente para aceder ao conhecimento em rápida expansão disponível
para Sacchoromyces cerevisiae, através da internet teremos a oportunidade de investigar
novos microssatélites.(6)

4. Objetivo da
revisão:
Tendo em conta o conhecimento da sequência de ADN genómico em S.
cerevisiae, este trabalho desenvolve um painel de seis microssatélites
eficazes loci geneticamente para identificar o tipo e discriminar S.
cerevisiae estirpes.

5. Materiais e métodos
Cepas de leveduras Extração de ADN
51 estripes de levedura de vinho
S. cerevisiaie
Isolado durante a fermentação
espontânea de vinhos em diferentes
áreas de viticultura.
Após 72h foi adicionado 1,5 ml liquido N2 a uma cultura liofilizada de levedura e as células
foram rompidas mecanicamente com um moinho com broca elétrica. Em seguida os ácidos
nucleicos foram extraídos(5) fazendo uma adição de 1/100 do volume da Rnase e incubado a
37ªc durante 30m, Um volume de fenol-clorofórmio, foi adicionado, e após agitação e
centrifugação (13 600 g; 10 min), o sobrenadante foi transferido para um novo tubo. O ADN foi
precipitado durante 30 minutos a 20 ± ° C, com para um novo tubo. O ADN foi precipitado
durante 30 minutos a 20 ± ° C, com para um novo tubo. O ADN foi precipitado durante 30
minutos a 20 ± ° C, com 1/10 do volume de 3 mol L ± 1 acetato de sódio, pH 5,2, mais 2,5
volumes de etanol a 100%. Finalmente, o DNA foi sedimentado por centrifugação (13 600 g;
etanol a 100%. Finalmente, o DNA foi sedimentado por centrifugação (13 600 g; 10 min), lavou-
se com 70% de etanol, seco e suspenso em 100ml de tampão(10mmol/l)EDTA

6. Triagem e localização de sequencias de repetição no Saccharomyces cerevisiae, genoma do banco de
dados:
Foram pesquisados ​​para possíveis repetições perfeitas de trinucleotídeos em todo o DNA
genómico. No caso de repetições diméricos, apenas aqueles com mais de 10 unidades de
repetição foram selecionados, e para repeties triméricos, aqueles com maior do que sete
repetições foram selecionados. repetições de um único nucleotídeo não foram incluídos na
pesquisa.
A reprodutibilidade da técnica
foi avaliada por comparação
dos resultados obtidos por
análise SSR completa e
independente (com os seis
microssatélites selecionados)
do ADN a partir de duas
extrações diferentes de um
terço das estirpes em estudo,
que foram escolhidos
aleatoriamente.
Resultados:
No DNA,
existem 12
possíveis
repetições de
dinucleótido
60 repetições
de
trinucleotídeos

7. Existem apenas quatro tipos ou combinações de
diferentes dímeros, trímeros.
Assim, no caso de dinucleótidos, CA
repetição é a mesma como CA, e dá
origem a GT e TG repete na cadeia
complementar, e AAT repetição é a
mesma como ATA, TAA, e suas formas
complementares ATT TAT e TTA em
caso de trinucleotídeos
A pesquisa do banco de dados de DNA
genômico de S. cerevisiae do banco de
dados de DNA genômico de S. cerevisiae
realizadas neste trabalho fornecido um
total de 275 sequcias: 142 com pelo menos
10 repetições dinucleotídicas, e 133 com,
pelo menos, sete repetições
trinucleotídicas.
As repetições mais comuns foram AT, AAT e AAC com 124, 37 e 26 sequências,
respetivamente. Repete de GC GCG não foram encontrados. De acordo com o relatado
em outros estudos, observaram-se a maioria das sequências ricas em A e T,
especialmente em repetições dinucleotídicas. Isto é possivelmente uma consequência
do elevado teor de A + T de genomas de leveduras (62%), bem como uma série de
mecanismos que regulam positivamente ou negativamente a presença de um tipo de
repetição ou de uma outra(8)

8. Embora as sequências de repetição foram encontradas
ao longo dos 16 cromossomas de S. cerevisiae, o número
em cada varia amplamente. cromossomas de S.
cerevisiae, o número em cada varia amplamente.
cromossomas de S. cerevisiae, o número em cada varia
amplamente. Cromossomas IV, XVI e XIII mostraram o
maior número de repetições com 32, 27 e 26 sequências,
respectivamente. No cromossoma IV, a maioria das
repetições foram dinucleótidos, enquanto cromossomas
XVI e XIII mostrou uma maioria de repetições
trinucleotídicas. Cromossomas I, VI, XIV, mostrou o
menor número de sequências de repetição, com sete em
cada um dos dois ®rst, e nove no terceiro. Apesar de uma
ligeira tendência para certos tipos de repetição de ser
encontrado em cromossomas particulares (por exemplo,
cerca de um quarto de AAG e ATC repeties estavam
localizados em cromossomas XVI e XV, respectivamente),
diferentes tipos de dinucleotidicos e trinucleotídeos
repeties foram repartidos entre o cromossomos(9)

9. Dos 275 sequências
encontradas, foi
realizada uma selecção
inicial de aqueles com
duas ou três bases
pyrimidinic no caso de
trímeros (sequências
AAC, AAG, AAT, ACT e
ATC), e dois, no caso de
deros (sequência AT),
reduzindo o número de
231.
A partir destes, uma
segunda seleção foi feita
de aqueles com o maior
número de sequências
de repetição ± 12 ou
mais para trinucleótidos
e 18 ou mais para
dinucleidos, dado que
estes tinham uma
melhor oportunidade de
demonstrar uma maior
variabilidade
genética(10)
Um total de 19 sequências
foram obtidas e os
iniciadores foram
concebidos para speci®c o
ampli®cation de cada
Para este processo, os
seguintes critérios foram
levados em conta
Temperatura, hibridação dos
iniciadores, para tentar garantir
que a amplificação ocorreu em
condições restritivas, a fim de
garantir a boa reprodutibilidade.

10. Os microssatélites seleccionados
foram testados para ver se cada
proporcionou um ampli®cation
speci®c e se detectou qualquer
polimorfismo.
Aqueles que não atender a esses
critérios foram descartados e
substituídos por outros novos loci
preencham todas as condições exigidas
Um total de 10 loci foram eventualmente
testados até seis microssatélites
polimórficos foram encontrados que
proporcionou ampli®cations speci®c
Os testes de reprodutibilidade
mostrou pro®les idênticos para as
estirpes examinadas em duplicado

11. No entanto,
muito grande
variabilidade de
heterozigosidade
foi observada
em diferentes
loci
O tamanho
diferente dos
alelos ampli®ed
em cada locus, e a
possibilidade de
combinar
diferentes
¯uorochromes em
cada mistura de
reacção, fez a
ampli®cation
simultânea de
diferentes loci
possível.

12. Dois tipos de reação múltipla de PCR foram concebidos para isso, cada uma permitindo a amplificação
de três loci. Desta forma, uma análise completa do ADN com os seis microssatélites foi realizada
rapidamente, com apenas duas reações de amplificação. Esta possibilidade faz com que esta técnica já
bem desenvolvida seja ainda mais rápida. Este trabalho está em andamento para otimizar esta técnica
e para se tornar uma única reação múltipla, envolvendo todos os seis microssatélites ao mesmo
tempo. A frequência à qual os diferentes alelos em cada locus apareceu na população estudada de S.
cerevisiae foi muito variável.al os diferentes alelos em cada locus apareceu na população estudada de
S. cerevisiae foi muito
Dos seis microssatélites
seleccionados, loci e
ScAAT1 ScAAT3 foram os
mais informativos, 19 e 14
alelos, e 27 e 20 genótipos
por loco, respectivamente.
Eles são, portanto, de
interesse especial no
identi®cation, typi®cation e
diferenciação de genética
S. cerevisiae
A existência de pro®les genéticos compartilhados por
algumas isolados poderia ser devido à sua pertença a
uma mesma tensão, uma vez que procedem da mesma
área geográfica e adega, e também a sua
predominância durante a fermentação espontânea do
mosto, uma vez que eles vêm a amostra iguais nas
mesmas ou consecutivas fases de fermentação
No entanto, essas cepas precisaria de investigação com
mais marcadores para concluir a sua identidade
genética. O uso de microssatélites, tais como STS na
caracterização, identi®cation e diferenciação de
intraspeci®c

13. Conclusões:
S. cerevisiae estirpes é uma inovação importante
e uma grande avanço sobre S. cerevisiae estirpes
é uma inovação importante e uma grande avanço
sobre as outras técnicas de biologia molecular
presentemente disponíveis. A possibilidade de
informações acumulando obtido por múltiplos
ampli®cation de vários loci microssatélites
adequada torna a análise SSR uma ferramenta
poderosa e ágil para o estudo e análise de S.
cerevisiae genoma. A técnica poderosa e ágil para
o estudo e análise de S. cerevisiae genoma. A
técnica poderosa e ágil para o estudo e análise de
S. cerevisiae genoma. A técnica tem um alto
poder de discriminação, é rápido, e os resultados
são reprodutíveis e fácil de interpretar.
O presente trabalho descreve seis loci
microssatélites apropriados e as suas
condições ampli®cation. Estes
fornecem excelentes marcadores
moleculares para as estirpes de
digitação que possam ser usados ​​no
estudo de indígena S. as estirpes de
digitação que possam ser usados ​​no
estudo de indígena S. cerevisiae
populações. Eles também
proporcionam os meios de investigar a
sua cerevisiae populações. Eles
também proporcionam os meios de
investigar a sua diversidade genética,
algumas das suas características
ecológicas e suas dinâmicas durante a
fermentação, e pode ser utilizado como
ferramenta de biotecnologia de modo a
identificar, localizar e controlar estirpes
comercialmente seleccionados em
processos industriais.
Fim…..

14. Referências:
(1) Querol et al. 1992, Blondin e Vezinhet 1988, Degrea et al. 1989, Ness et al.1993; DeBarro Lopes et al. 1996; Gallego et al.1998
(2) Campo et al.1996, Kruglyak et al.2000
(3) Richard e Dujon 1996;Campo e Wills 1998; Gallego et al 1998;Richard et al. 1999;Jovem et al.2000
(4) Skelly e Clark-Walker, 1991
(5) Baleiras Couto et al. 1996; Campo e Wills 1998; Galeggo et al.1998; Hennequin et al. 2001
(6) Cereja et al. 1998
(7) Quesada e Cenis 1995
(8) Campo Wills 1998; Gallego et al. 1998; Richard et al. 1999; Kruglyak et al. 2000; Jove, et al. 2000
(9) Field and Wills 1998; Jovem et al. 2000
(10)Weber 1990;Pupko e Graur 1999
(11)Fiel and Wills 1998