Artigo que apresenta a atividade fibrinolitica de extratos de cogumelos

1. Recuperação e purificação parcial da protease fibrinolítica de Pleurotus ostreatus e
1
P. eryngii e atividade citotóxica e antioxidante de seus extratos
2
3
Romário da S. Santana1, Felipe de S. Mendes1, Bárbara J. Paula da Silva2, Emerson S.
4
Lima2, Thiago P. Nascimento3*
, Márcia N. Carneiro da Cunha4, Ana Lúcia F. Porto4,
5
Maria Francisca S. Teixeira5, Rosany P. Carvalho6, Waldireny R. Gomes2
6
7
1
Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Universidade Federal do Amazonas, Manaus, AM,
8
Brasil.
9
2
Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal do Amazonas (UFAM), Manaus, AM,
10
Brasil.
11
3
Campus Professora Cinobelina Elvas, Federal Universidade do Piauí, Bom Jesus, PI, Brazil.
12
4
Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife,
13
PE, Brasil.
14
5
Departamento de Parasitologia, Universidade Federal do Amazonas, Manaus, AM, Brasil.
15
6
Departamento de Ciências Fisiológicas, Universidade Federal do Amazonas, Manaus, AM, Brasil.
16
17
18
19
*Autor para correspondência:
20
Prof. Dr. Thiago Pajeú Nascimento
21
Campus Professora Cinobelina Elvas
22
Universidade Federal do Piauí, Piauí (PI) Brasil.
23
Correio electrónico: thiagopajeu@ufpi.edu.br
24
25
26

2. 27
28
Resumo
29
30
Os cogumelos são fonte de metabólitos primários e secundários. As enzimas fazem parte do seu
31
metabolismo, e produção pode ser induzida por processos fermentativos. Pouco trabalhos
32
avaliaram as condições mais adequadas para produção destas enzimas por fermentação
33
submersa. Este artigo tem como objetivo realizar ensaios antioxidantes e citotóxicos, além de
34
avaliar quantitativamente o teor de proteases com ação fibrinolítica nos extratos brutos de duas
35
espécies de cogumelos comestíveis produzidos em diferentes formulações, bem como avaliar a
36
capacidade de recuperação dessas enzimas por sistemas aquosos bifásicos (ATPS). Os
37
cogumelos Pleurotus ostreatus e Pleurotus eryngii, na concentração de 100 μg/mL,
38
apresentaram inibição dos radicais DPPH e ABTS abaixo de 50%. No ensaio de citotoxicidade,
39
as células apresentaram viabilidade celular superior a 80 %. Em relação à atividade fibrinolítica,
40
P. eryngii apresentou 226,47 ± 7,26 U/mL, sendo, portanto, mais eficiente que P. ostreatus
41
(71,5 ± 0,56 U/mL). Na recuperação do extrato de P. eryngii por ATPS, a protease fibrinolítica
42
revelou-se particionada na fase salina (30,25 U/mL). A massa molecular das proteases está entre
43
75 a 100 kDa. Estes resultados comprovam a baixa citotoxicidade dos extratos produzidos e
44
que, quando fermentados em caldo de malte suplementado, favoreceram a excreção de
45
proteases fibrinolíticas em relação aos demais meios avaliados.
46
47
Palavras-chave: Cogumelos, Fermentação submersa, Enzimas, Fibrinolítico, Trombose.
48
49
50
51

3. 1. Introdução
52
A Organização Mundial da Saúde (OMS) considera as doenças cardiovasculares como
53
a principal causa de morte no mundo, estimada em 38 milhões de mortes a cada ano [1,2]. A
54
Sociedade Brasileira de Cardiologia (SBC), estima que essas doenças que afetam o coração e o
55
aparelho circulatório são responsáveis por mais de 1.100 mortes por dia, sendo que 46 pessoas
56
perdem a vida por hora [3]. Em 2022, essas doenças causaram mais de 400.000 mortes no
57
Brasil, consideradas mais que o dobro das causadas por câncer, três vezes mais que as doenças
58
respiratórias e 2,3 vezes mais que violências ou acidentes [4].
59
Dentre as doenças cardiovasculares mais conhecidas, o Ministério da Saúde classifica o
60
Acidente Vascular Cerebral (AVC) como a causa mais frequente de morte e incapacidade
61
adquirida na população adulta. Cerca de 300 mil indivíduos por ano sofrem Infarto Agudo do
62
Miocárdio (IAM), com 30% dos casos levando à morte e estima-se que até 2040 haverá um
63
aumento de 250% desses eventos no país e no mundo [5,6].
64
Trombose, doença potencialmente grave causada pela formação de coágulos sanguíneos
65
e gera um processo inflamatório que induz o IAM [7]. A Sociedade Brasileira de Trombose e
66
Hemostasia compreende dois tipos clínicos principais para a formação de trombose venosa, que
67
pode ocorrer tanto em uma veia profunda (TVP) quanto quando um ou vários êmbolos são
68
liberados na circulação venosa e se alojam na vascularização pulmonar, dando origem a um
69
tromboembolismo pulmonar (TEP) [8,9].
70
Os fatores de risco para o desenvolvimento dessa doença podem ser muitos: os
71
principais são: predisposições genéticas, tabagismo, sedentarismo, dieta com alto teor de
72
carboidratos, açúcar e gordura, excesso de colesterol, hipertensão, obesidade, estresse,
73
depressão e diabetes [7]. Para prevenir essa condição, os especialistas recomendam o consumo
74
de alimentos ricos em fibras e proteínas associados à prática de exercícios físicos.
75
Os cogumelos são considerados uma fonte alimentar rica em nutrientes essenciais,
76

4. incluindo fibras alimentares, proteínas, aminoácidos, vitaminas e minerais e possuem
77
propriedades medicinais, e algumas espécies podem ser úteis principalmente no controle da
78
trombose, uma vez que produzem enzimas com ação fibrinolítica [10,11].
79
Enzimas fibrinolíticas são proteases capazes de degradar a tela de fibrina de coágulos
80
sanguíneos, e estudos recentes mostram que a obtenção dessas enzimas tem sido relatada em
81
muitas espécies de fungos e bactérias.
82
Dentre os fungos destacam-se os cogumelos [12], e dentre as espécies de bactérias como
83
Streptomyces parvulus e Paenibacillus graminis [13,14]. As espécies de cogumelos mais
84
relatadas como produtoras de enzimas fibrinolíticas foram Pleurotus sajor-caju, P. ferulae, P.
85
ostreatus, Lyophyllum shimeji, Auricularia polytricha, Hericium erinaceum, Coprinus comatus
86
, Cordyceps militaris. As enzimas purificadas foram caracterizadas como metaloproteases,
87
serinoproteases e serina metaproteases, variando de peso molecular de ~18 a 66 kDa em pH de
88
4,0 a 9,5 e temperatura ótima de 25 a 70 ºC [12].
89
Existem poucos estudos relatando a obtenção dessas enzimas por sistema bifásico
90
aquoso como método de purificação inicial de enzimas fibrinolíticas [15,16,17]. Este método
91
apresenta vantagens para aplicações na extração e/ou purificação de materiais biológicos, por
92
ser considerado ambientalmente correto [18,19].
93
Portanto, o objetivo desta pesquisa foi estudar os potenciais antioxidante e citotóxico
94
dessas duas espécies de cogumelos comestíveis e, no extrato que apresentar maior quantidade
95
de enzimas fibrinolíticas, serão avaliadas as melhores condições para sua separação por ATPS.
96
2. Materiais e métodos
97
2.1. Obtenção do cogumelo e preparação dos extractos
98
Os cogumelos Pleurotus ostreatus DPUA 1533 e P. eryngii DPUA 1816 foram obtidos
99
da coleção de culturas do Departamento de Parasitologia da Universidade Federal do Amazonas
100
(DPUA-UFAM), certificada em gestão documental com base na NBR ISO 9001:2015. As
101

5. culturas foram reativadas em meio de cultura sólido contendo batata-dextrose-ágar (PDA) e
102
extrato de levedura 0,5 % p/v [20] e incubadas a 25 ºC, na ausência de luz, por oito dias [21]
103
para obtenção de pureza e viabilidade da colônia para testes posteriores.
104
Os extratos foram preparados utilizando cinco discos miceliais (Ø = 5 mm) e inoculados
105
em frascos de 250 mL de Erlenmeyer contendo 50 mL de meio líquido: Yast Malt (YM); e
106
Sabouraud Dextrose + Extrato de Levedura (SB+YE), fermentados por sete dias, a 28 °C e 150
107
rpm [22,23]. Em seguida, os extratos brutos foram recuperados, separando-se os pellets por
108
filtração a vácuo utilizando papel filtro Whatman nº 1 e membrana polietersulfônica de 0,22
109
μm [24], em câmara de fluxo laminar, liofilizada e armazenada em refrigerador (4,6 ºC) para
110
posterior análise.
111
+
112
2.2. Dosagem de proteínas totais
113
A concentração proteica relativa dos extratos foi estimada de acordo com a metodologia
114
descrita por Bradford [25] utilizando Coomassie Brilliant Blue G-250 e Albumina de Soro
115
Bovino (BSA) como solução padrão. Os testes foram realizados em triplicatas, utilizando-se
116
100 μL do extrato adicionado a 2,5 mL de reagente de Bradford acondicionado em câmara
117
escura por 1 hora e a concentração proteica determinada com base em uma curva padrão de
118
BSA (Sigma-Aldrich).
119
120
2.3. Determinação da atividade proteolítica
121
A atividade proteolitica foi determinada por Leighton et al. [26] utilizando 250 μL de
122
azocaseína (1 % p/v) como substrato, preparados em tampão Tris-HCl (0,1M, pH 7,2) e 150 μL
123
de amostra líquida. Misturas de amostras e branco foram preparados em triplicata e incubados
124
em câmara escura a 37 °C por 1 hora. A reação foi interrompida com a adição de 1 mL de ácido
125
tricloroacético (TCA) a 10 %, centrifugado a 12.000 rpm por 15 minutos, e 0,8 mL do
126

6. sobrenadante foi pipetado em microtubos de 2 mL contendo 0,2 mL de NaOH a 1,8 N [27].
127
Uma unidade de atividade proteolítica é definida como a quantidade de enzima necessária para
128
produzir uma mudança de absorbância igual a 0,1 durante 60 minutos, e absorbâncias lidas a
129
440 nm.
130
131
2.4. Determinação da atividade fibrinolítica
132
Foi determinada de acordo com o método de Astrup e Mullertz [28], que se baseia na
133
formação de um trombo artificial. A capacidade de dissolver o coágulo pelas enzimas
134
fibrinolíticas presentes nos extratos foi quantificada em espectrofotometria a 275 nm [29]. Para
135
isso, 500 μL da solução de fibrinogênio foram adicionados a 100 μL da enzima trombina e
136
colocados em banho-maria a 37 ºC por 10 minutos. Em seguida, 100 μL da amostra foram
137
adicionados e colocados em banho-maria a 37 ºC por 1 hora. A reação foi interrompida pela
138
adição de 700 μL de TCA (0,2 M a 10 %) e centrifugada a 12.000 rpm por 20 minutos. 1 mL
139
do sobrenadante foi lido em espectrofotômetro ultravioleta-visível (UV-Vis) (275 nm).
140
141
2.5. Determinação da atividade antioxidante
142
Para detectar a presença de compostos antioxidantes nos extratos fúngicos, dois métodos
143
foram utilizados: pelo DPPH [30] e pelo ABTS [31]. Uma alíquota de 1 mg de DPPH foi
144
dissolvida em 12 mL de etanol absoluto e, para o teste, 30 μL do extrato foram adicionados a
145
270 μL da solução de DPPH e incubados por 30 minutos em câmara escura. Como controle
146
padrão e negativo, utilizou-se ácido gálico e DMSO. As leituras foram feitas a 517 nm por um
147
leitor de ensaio imunoenzimático (ELISA).
148
A solução ABTS foi preparada pela reação de 0,7 mM do radical dissolvido em água
149
deionizada com 2,4 mM de persulfato de potássio (K2S2O8). A mistura reacional foi incubada
150
à temperatura ambiente na ausência de luz por 16 horas e, para o teste, 30 μL do extrato foram
151

7. adicionados a 270 μL da solução ABTS, incubados no escuro por 30 minutos. Como controle
152
padrão e negativo, utilizou-se ácido gálico. As leituras foram feitas em 630 pelo leitor ELISA.
153
Para a obtenção dos resultados dos testes DPPH e ABTS, utilizou-se a seguinte equação:
154
% de atividade antioxidante = 100 – (Abs da Amostra/Controle Valor Médio) x 100
155
156
2.6. Determinação da atividade citotóxica
157
O ensaio de citotoxicidade em linhagens celulares de fibroblastos humanos (MRC-5)
158
foi realizado pelo método do azul de Alamar, utilizando-se sal sódico de resazurina (Sigma-
159
Aldrich, EUA) de acordo com o método descrito por AHMED et al (1994) [32]. As células
160
foram plaqueadas na concentração de 0,5 x104
células por poço em microplacas de 96 poços.
161
Após 24 horas de incubação e adesão celular, as células foram tratadas com os extratos na
162
concentração única de 100 μg/mL por um período de 24 horas. O experimento foi conduzido
163
em triplicata para cada período de tratamento. Após o período de tratamento, foram adicionados
164
10 μL de resazurina a 0,4 % (diluição 1:20). O período de incubação padronizado para a
165
linhagem celular utilizada foi de 3 h, que é o tempo necessário para a metabolização da
166
resazurina. Após 3 h de incubação, as microplacas foram analisadas pelo modo de fluorescência
167
(filtro de troca de 540 nm e filtro de emissão de 585 nm) em leitor de microplacas (DTX 800,
168
Beckman Coulter, CA, EUA).
169
2.7. Pré-purificação por sistemas bifásicos aquosos (ATPS)
170
Para este teste, em esquema fatorial, foram preparados 12 sistemas em tubos graduados
171
(15 mL), contendo: polietilenoglicol (PEG) em diferentes massas molares (4000, 6000 e 8000
172
g/mol); sulfato de sódio-NaSO4; água destilada; e 2,0 g de amostra, obtendo-se peso final de
173
10 g à temperatura ambiente. Após a mistura em cada sistema, o tubo foi agitado até a completa
174
dissolução do PEG e do Sal. Após a formação das fases, as alíquotas foram retiradas
175
separadamente; Cada fase foi avaliada quanto à concentração proteica, atividade proteásica e
176

8. ação fibrinolítica.
177
Para os parâmetros referentes às variáveis resposta, levou-se em consideração o método
178
proposto por Nascimento e colaboradores [33], onde foram determinados os seguintes
179
parâmetros: coeficiente de partição (K), fator de purificação (PF) e recuperação (Y). Para
180
permitir a estimação do erro experimental, foi realizado um planejamento fatorial para a seleção
181
preliminar da purificação, a fim de verificar a influência das variáveis resposta contra as
182
concentrações de PEG e Sal dos sistemas.
183
184
2.8. Caracterização da enzima no extrato bruto
185
2.8.1. Precipitação proteica
186
A precipitação do extrato bruto foi realizada de acordo com Wessel e Flügge [34],
187
utilizando-se uma solução de acetona e TCA a 10 %. A mistura foi incubada em gelo por duas
188
horas, seguida de centrifugação por 15 minutos a 10.000 g. Os sobrenadantes e o precipitado
189
foram removidos e submetidos à análise por eletroforese em gel.
190
191
2.8.2. Eletroforese em gel SDS–PAGE
192
Os extratos obtidos foram analisados de acordo com Ali et al. [35], utilizando SDS-
193
PAGE com gel de acrilamida composto por 12% de gel resolutivo e 4,5% de gel de
194
empilhamento. Os pellets obtidos das fermentações foram misturados em água ultrapura
195
contendo solução de Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8), mistura de acrilamida a 30 %, glicerol, SDS a
196
10 %, persulfato de amônio a 10 %, TEMED (N,N,N′,N′-Tetrametil-1,2-Diaminometano) e azul
197
de bromofenol.
198
199
2.8.3. Zymograma em gel SDS-PAGE
200
Cada amostra foi diluída (v/v) em tampão de amostra (Tris-HCl 500 mM, pH 6,8; SDS
201

9. 10 %; TEMED 120 mM; glicerol 10 %, azul de bromofenol 0,05 % e aplicada a um volume de
202
15 μL por pista). A eletroforese foi realizada aplicando-se as amostras em gel de acrilamida a
203
12%, copolimerizado com gelatina a 0,5%, sob corrente de 80 V [36]. Para visualização das
204
bandas de proteólise, os géis foram corados com azul de Comassie (solução F-250 de azul de
205
Comassie a 0,1%, metanol a 25%, ácido acético a 5%) por uma hora e descoloridos com solução
206
de ácido acético a 10%.
207
208
2.9. Análise estatística
209
Os resultados foram expressos como Média ± DP (Desvio Padrão da Média). Todos os
210
ensaios in vitro foram realizados em triplicata biológica e analisados estatisticamente utilizando
211
o software GraphPad Prism 6. Os ensaios foram analisados por meio do teste de comparações
212
múltiplas e análise de variância (ANOVA) para comparação entre os grupos. O nível de
213
significância adotado foi de p < 0,05.
214
215
3. Resultados e discussões
216
3.1. Pré-purificação do extrato por ATPS
217
Nas condições testadas, a protease específica e a atividade fibrinolítica dos extratos de
218
P. eryngii e P. ostreatus estão expressas na tabela 1. A espécie que apresentou maior atividade
219
proteolítica e fibrinolítica foi P. eryngii com 1552,8 ± 91,6 U/mL e 226,47 ± 7,26 U/mL,
220
respectivamente.
221
222
3.2. Semipurificação do extracto de P. eryngii
223
Assim, avaliou-se a capacidade do ATPS aquoso composto de PEG e sulfato de sódio
224
(Na2SO4) em recuperar a enzima do extrato das espécies que apresentaram maior nível de ação
225
fibrinolítica. O planejamento fatorial dos sistemas indicou que doze sistemas foram avaliados
226

10. (Tabela 2).
227
Todas as fases apresentaram ação fibrinolítica. Atividades fibrinolíticas foram obtidas
228
em todos os sistemas de planejamento fatorial. Esse efeito simultâneo pode ser observado no
229
gráfico da figura 1, revelando que o FPSALT aumentou linearmente de níveis mais baixos para
230
mais altos em relação ao CPEG com MPEG.
231
Parte das proteínas sintetizadas por P. eryngii também interagiu na fase PEG.
232
Entretanto, como condição ótima, o efeito simultâneo da protease fibrinolítica revelou maior
233
afinidade com a fase rica em sal. Todos os sistemas avaliados apresentaram recuperação acima
234
de 80 %, e apenas dois sistemas apresentaram valores de coeficiente de partição inferiores a 1.
235
Entretanto, a maior atividade fibrinolítica do fator de purificação foi de 30,25 U/mL, obtida na
236
fase de fundo do sistema 1, na concentração de 18 % de PEG e 10% de SALT.
237
Os resultados das variáveis independentes, estatisticamente, para a concentração de
238
NaSO4, as interações tiveram efeito positivo e significativo sobre o coeficiente de partição
239
(Figura 2). As variáveis independentes para a recupação e purificação da enzima, em fase e sal,
240
as interações tiveram efeitos significativos e negativos, entre as concentrações na massa de PEG
241
(Figura 3A e B).
242
Nessas análises, o efeito das variáveis independentes mostrou que quanto maior a
243
concentração, mais a enzima tem afinidade na fase rica em sal. Isso indica que os menores
244
valores presentes nas variáveis independentes, contribuíram para o aumento significativo na
245
recuperação do extrato enzimático, quando combinados os menores valores de MPEG e CPEG,
246
maiores são os valores de Y.
247
Para verificar a pureza da protease fibrinolítica produzida por P. eryngii, foi realizada
248
eletroforese em SDS-PAGE a 12 % para o extrato bruto e, para o extrato pré-purificado, o
249
zimograma de protease para as duas fases do sistema 1 (Figura 4).
250
Observa-se que a banda referente à protease do extrato bruto apresentou enzimas em
251

11. diferentes tamanhos. E como resultado do zimograma, a protease fibrinolítica, presente no
252
extrato bruto e nas fases SALT e PEG, ficou entre os marcadores de massa molecular de 75 a
253
100 kDa.
254
255
3.3. Ensaios antioxidantes e citotóxicos de extratos de duas espécies de cogumelos
256
O potencial antioxidante dos extratos obtidos por fermentação submersa para os
257
cogumelos P. ostreatus e P. eryngii, na concentração 0 de 100 μg/mL, apresentou inibição
258
inferior a 50 %, nos ensaios DPPH e ABTS.
259
Os valores obtidos para a capacidade antioxidante foram para P. ostreatus cultivado em
260
meio SB+YE, mostrando mais de 14 % de inibição do radical no ABTS e mais de 6 % do radical
261
no DPPH. Para P. eryngii cultivado em YM, a porcentagem de inibição do radical no ABTS foi
262
superior a 12% e mais de 6% do radical no DPPH (Tabela 3).
263
Dados de pesquisa, considerando extratos de cogumelos comestíveis do gênero
264
Pleurotus spp., comprovaram que os mesmos possuem diversos tipos de ácidos orgânicos
265
reativos em diferentes concentrações de antioxidantes [37-43].
266
Brugnari et al. [43] comprovaram a capacidade antioxidante do cogumelo P. ostreatus
267
cultivado em meio líquido, na concentração de 100 μg/mL, com mais de 80 % de inibição dos
268
radicais ABTS e DPPH. [44] demonstraram capacidade antioxidante em extratos obtidos de
269
corpos frutíferos de P. eryngii, utilizando solventes, com inibição do radical DPPH por 81,0 %
270
(etanol) e 88,4 % (acetato de etila) com inibição do radical DPPH. ABTS.
271
A atividade citotóxica foi avaliada nas células MRC-5. Expostos na concentração de
272
100 ug/mL das substâncias em estudo, no intervalo de tempo de tratamento de 24 horas (Figura
273
5). Os extratos de P. eryngii e P. ostreatus, em condições de cultivo, apresentaram viabilidade
274
celular superior a 80 %, não sendo considerados tóxicos para essas células. [45] mostraram
275
sobre o potencial dos fungos e suas aplicações para o mercado da indústria.
276

12. Nota-se que ao comparar esses dados com outras espécies, o gênero Pleurotus se destaca
277
na produção de extratos que não são considerados tóxicos. [46] relataram viabilidade celular
278
de P. ostreatus em linhagens de células cancerosas (CaSki, MCF-7 e A549), exceto em MRC-
279
5, onde apresentou 30% de citotoxicidade na concentração de 200 μg/mL, mostrando efeitos
280
colaterais deletérios em células normais, testados em 72 horas. [47] estudaram P. fabellatus e
281
mostraram fraca citotoxicidade em MRC-5, concentração testada de 40 mg/mL com viabilidade
282
celular em 60,53%.
283
284
4. Conclusão
285
Considerando as potenciais aplicações de proteases fibrinolíticas em uso terapêutico
286
para o tratamento de doenças trombolíticas, ambas as espécies de cogumelos, P. eryngii e P.
287
ostreatus, não apresentam citotoxicidade significativa em fibroblastos humanos. Os sistemas
288
de planejamento fatorial enzimático de P. eryngii, por ATPS, apresentaram recuperação acima
289
de 80 % nas fases PEG e SALT, e a maior atividade fibrinolítica do fator de purificação obtido
290
foi de 30,25 U/mL, na fase rica em SALT do sistema 1. Portanto, este estudo apresenta dados
291
promissores que contribuem para o conhecimento da capacidade de produção de proteases
292
dessas espécies de cogumelos.
293
294
Declaração de Interesse Concorrente
295
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
296
297
Confirmações
298
Os autores agradecem o apoio financeiro da Coordenação de Aperfeiçoamento de
299
Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela bolsa e também pelo apoio da Fundação de Amparo
300
à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM), pelo financiamento do projeto e bolsa através
301

13. dos recursos disponibilizados no EDITAL Nº 006/2019 e para a Universidade Federal do
302
Amazonas (UFAM), para suporte técnico e científico.
303
304
Referências
305
[1] F. Cesena. A Pandemia de COVID-19 e a Doença Cardiovascular no Brasil: Aprendendo
306
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480
481
482
Legendas de figuras
483
Gráfico 1. Efeito simultâneo do fator de purificação, sobre a concentração e massa molar de
484
PEG, do planejamento fatorial, da protease fibrinolítica de P. eryngii DPUA1816 por ATPS.
485
486
Gráfico 2. Gráfico de Pareto mostrando o efeito das variáveis sobre o coeficiente de partição
487
(K) por ATPS.
488
489
Gráfico 3. Gráfico de Pareto ilustrando os efeitos das variáveis independentes por ATPS. A)
490
recuperação enzimática (YSSALT); B) fator de purificação enzimática (PFSALT).
491
492
Gráfico 4. Representação da eletroforese em SDS-PAGE a 12% e do zimograma do extrato
493
de P. eryngii YM antes e após a purificação em ATPS. (A): 1-Marcador de massa molecular;
494
Extrato 2-bruto obtido por fermentação submersa em meio YM; (B): 3-Zimograma do extrato
495
bruto; 4-Estágio inferior do sistema 1; 5-Sistema 1 estágio superior PEG 4000.
496
497
Gráfico 5. Resultado da avaliação da citotoxicidade dos extratos de P. eryngii e P. ostreatus
498
expostos na concentração de 100 ug/mL, em 24 horas. Os dados foram expressos em
499
porcentagem de viabilidade celular com média ± desvio padrão (em relação ao controle de
500
DMSO) e analisados por ANOVA seguida do teste de Dunnett. *p<0,05.
501
502
503