Técnica de Patch-Clamp - eletrofisiologia

1. Danusa Menegaz, Ph.D
CCB/BQM/UFSC
Patch-Clamp Technique
Universidade Federal de Santa Catarina
Departamento de Bioquímica e Eletrofisiologia
NUBIOCEL (Núcleo de Bioeletricidade Celular)

2. 1660 (Jam Swammerdam) estímulo elétrico; fio de prata; contração muscular em
sapos;
1790 (Luigi Galvani) canais iônicos e impulso nervoso entre neurônio motor e
músculo em rãs;
1850 (Hermann Helmholtz) velocidade de propagação do impulso nervoso em
milisegundos;
1952 (Hodkin; Huxley), primeiro registro com eletrodos intracelulares - potencial de
ação em neurônio de lula gigante 0.5 mm; prêmio nobel em 1963;
1976 (Neher; Sakmann), descoberta patch-clamp, single-channel, prêmio nobel em
1991;
História da eletrofisiologia ao Patch-Clamp

3. Patch-Clamp
Voltage-clamp (mV) e Current-clamp (pA)
Permite a investigação de um único canal
iônico ou de múltiplos canais iônicos numa
célula individual;
Possibilita que a voltagem seja “fixada” para
registro das correntes (pA) e que a corrente
seja “fixada” para registro da voltagem (mV)
(potencial de ação);
O princípio do método é isolar uma parte da
membrana eletricamente do meio extracelular e
registrar o fluxo de correntes através dos canais
com o uso de um microeletrodo de alta
condutância;
Canais iônicos estão envolvidos em diversas
funções fisiológicas como sinais neuronais,
contração muscular, ritmo cardíaco, secreção
hormonal e regulação do volume celular;

4. Porque?
Para quê?
Como?
Onde?
Eletrofisiologia – Patch-Clamp

5. Transporte através da membrana plasmática

6. Tipos de canais Iônicos e fatores de ativação

7. Potencial de ação em células excitáveis

8. Pulso de corrente (current-clamp) para medição da
voltagem (potencial de ação)

9. Doenças envolvendo Canais iônicos

10. Dor física e emocional

11. Mudanças patológicas na frequência de
potenciais de ação elétricos em neurônios

12. http://www.thelancet.com/cms/attachment/2001010892/2003793423/gr3.jpg
Bloqueador de canais de Ca++ em neurônios pré-sinápticos

13. Role of Cannabinoids in Pain
Management

14. Kv
Atividade Elétrica da Célula β-pancreática do pâncreas e
DIABETES

15. Gradiente eletroquímico

16. Preparação de soluções fisiológicas para prática experimental
Meio extracelular Meio intracelular

17. Osmolaridade das soluções experimentais
OSMÔMETRO

18. Equipamentos para técnica de patch-clamp
 Plataforma:
 Mesas anti-vibratórias;
 Mecânica e Óptica:
 Microscópio;
 Micromanipuladores;
 Pipetas;
 Sistema de Perfusão;
 Eletrônica:
 Gaiolas de Faraday;
 Amplificadores;
 Digitalização e Aquisição de Dados;
 Ruído;

19. Patch-Clamp Set-Up
Células IsoladasFatias de Tecidos

20. Circuito Elétrico

21. Microeletrodo - Estirador de Pipetas

22. Passos para atingir a configuração cell-attached para medição de single-channel

23. Configurações da técnica de Patch-Clamp
 Modelos de
Single-channel
 Modelos de Whole-cell

24. Pulso de voltagem (Voltage-clamp) para medição das correntes
Canais de K+ e Cl-
Canais de Na+ e Ca++

25. Canais de Sódio e Potássio – soluções experimentais
para anular correntes interferentes
Canal de K+ Canal de Na+

26. Kv
Atividade Elétrica da Célula β-pancreática do pâncreas e
DIABETES

27. Gradiente eletroquímico

28. -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100
-200
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
TEA (4)
Control (1)
DTEBS (2)
Wash-out (3)
I(pA)
V (mV)
-80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100
-200
0
200
400
600
800
1000
1200
TEA (4)
Glucose (2)
Wash-out (3)
I(pA)
V (mV)
Control (1)
0
500
1000
1500
2000
***
***
## Control
16 mM glc
DTEBS 20 nM
TEA 20 mM
**@@@
V (80 mV)
I(pA)
(A)
(C)
(B) 100pA
25 ms
200pA
25 ms
Control (1) Wash-out (3)
Glucose (2)
TEA (4)
Control (1)
Wash-out (3)
TEA (4)
DTEBS (2)
Ilhotas pancreáticas

29. Células beta-pancreáticas – real-time videos

30. Células HEK293 transfectadas com canais BK
Configuração Whole-cell (voltage-clamp)
Guanosina 100 µM
-80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100
0
150
300
450
600
750
Controle canais BK
Guanosina 100 uM
Wash out
I(pA)
V (mV)
200pA
100 ms

31. ATP 1 mM
Control Wash out
TEA 20 mM
C
ontrol
A
TP
1m
M
W
ash-out
TEA
20
m
M
0
200
400
600
***
**
###
V (80 mV)
I(pA)
100pA
50 ms
-80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100
0
100
200
300
400
500
I(pA)
V (mV)
Control
ATP 1mM
Wash-out
TEA 20 mM
Efluxo de K+ estimulados por ATP em células de Sertoli

32. Eletroporação em células de Sertoli
Pulso de 1000 uA durante 20 ms

33. Muito Obrigada