Este documento apresenta o projeto de qualificação de Francisco Fambrini sobre o desenvolvimento de um sistema completo para aquisição e registro de sinais de neurônios cultivados em matriz de microeletrodos. O sistema inclui soquetes elétricos, gerador de sinais, amplificadores, circuitos de estimulação, filtros e placa de aquisição de dados para registrar sinais de uma matriz padrão de 60 eletrodos. O projeto visa dominar a tecnologia de interface neurônio-eletrodo utilizando matrizes de micro

1. Exame de Qualificação
“Projeto de um Sistema de Estimulação Elétrica,
Registro, Amplificação e Filtragem de Sinais de
Neurônios em Matriz de Microeletrodos”
Francisco Fambrini
FACCAMP
ffambrini@gmail.com
Dr. José Hiroki Saito
Orientador
saito@dc.ufscar.br

2. Sumário
1- Introdução
2 - Pesquisa bibliográfica sobre MEA,
Aspectos gerais;
3- Pesquisa bibliográfica sobre o
Hardware e Software de sistemas MEA ;
4- Proposta de trabalho;
5- Validação, resultados esperados e cronograma;
6- Resultados preliminares

3. Introdução
• Objetivo geral:
–
Desenvolvimento de um projeto completo para Aquisição e
Registro de dados a partir de MEA padrão de 60 eletrodos da
MultiChannel Systems, incluindo soquetes elétricos, gerador de
sinais de teste, amplificadores, circuitos para estimulação dos
neurônios, filtros e placa de aquisição de dados.
• Motivação:
– Ir de encontro ao domínio da tecnologia de interface neurônioeletrodo relativa à MEA e a outros dispositivos como EEG.

4. Pesquisa bibliográfica sobre
MEA, aspectos gerais.

5. Matriz de Microeletrodos
(Microelectrode Array – MEA, em inglês)
MEA é um dispositivo de nanotecnologia construído com a mesma
tecnologia dos circuitos integrados.
Serve para cultura de células neuronais in vitro, em tecidos ou
dissociadas.
Acima, uma MEA padrão da MultiChannel Systems com eletrodos de
30 µm de diâmetro e 200 µm de espaçamento entre si, com 60
microeletrodos (pontos escuros nas extremidades condutoras e raias
isoladas).

6. Neurônios e células da Glia
Neurônios são células básicas do cérebro e do sistema nervoso.
Células da glia tem funções de sustentação, nutrição e defesa dos
neurônios.
A maior parte dos tumores do SNC(Sistema Nervoso Central) são
tumores gliais.
Neuroblastomas são muito raros.

7. Medidas de Neurônios in vitro
usando MEA
• As medidas usando MEA podem ser em:
– Tecidos neuronais - fatias de células obtidas de uma
parte do cérebro;
– Neurônios dissociados - aqueles separados da fatia de
tecido do cérebro.
• Os neurônios podem ser cultivados por várias semanas e os
seus sinais eletrofisiológicos medidos ao longo do tempo.

8. Características dos Sinais em MEA
• Atividade elétrica
– Extracelular , espontânea ou evocada, de um grupo de
neurônios
• Amplitude do sinal extracelular entre 20 e 40 µV.
• Frequência de amostragem entre 5 e 48 kHz.
• Dados na ordem de Gbytes.
Padrões de atividade:
• Atividade basal : repouso
• Spike: pico do sinal; atividade elétrica de um ou mais neurônios
• Burst: sequência de spikes num intervalo pequeno de tempo

9. Detecção dos Spikes

Spike:



Impulsos nervosos ou potenciais de ação
Produzidos por um ou mais neurônios
É observado por um período de tempo relativamente longo
100-01-basale1-1-12
100-01-basale1-1-12
100
100
00
100-01-basale1-1-12
100-01-basale1-1-12
-50
-50
40
40
20
20
-100
-100
00
-150
-150
25.8
25.8
26
26
26.2
26.4
26.2
26.4
Time [sec]
Time [sec]
26.6
26.6
26.8
26.8
Amplitude [uV]
Amplitude [uV]
Amplitude [uV]
Amplitude [uV]
50
50
-20
-20
-40
-40
-60
-60
-80
-80
-100
-100
-120
-120
26.34 26.35 26.36 26.37 26.38 26.39 26.4 26.41 26.42 26.43
26.34 26.35 26.36 26.37 26.38 26.39 26.4 26.41 26.42 26.43
Time [sec]
Time [sec]

10. Sinal Eletrofisiológico
Por que estudar spikes?
A informação está contida nos spikes e no atraso
entre dois spikes consecutivos.

11. Detecção dos Spikes
• Desvio padrão é calculado sobre a atividade basal
• Limiar é calculado como um múltiplo do desvio padrão

12. Detecção dos Bursts
Burst:
 Sequência de spikes que ocorrem em um período pequeno de tempo
 Duração igual a soma de todos os ISI (intervalo entre spikes) contidos
num mesmo conjunto
Identificação de Bursts
Hipóteses:
 O Burst é caracterizado por um certo número de spikes
Definir número mínimo de spikes pertencentes a um burst
 Spikes de um mesmo Burst encontram–se muito próximos
Definir espaçamento temporal mínimo para considerar se o spike
é pertencente ao burst ou não
 Os Bursts encontram–se separados por no mínimo centenas de ms.

13. Detecção dos Bursts
Spikes dentro dos bursts são muito próximos (ISImáx de 100 ms)
Distância entre bursts de no mínimo 100 ms (IBImín de 100 ms)
Formado por um número determinado de spikes (5 a 10 spikes)

14. Tipos de MEA – MultiChannel Systems
MEA planar – para cultura in vitro.
MEA padrão
densidade
Thin MEA
MEA256 de alta
MEA padrão – com 60 eletrodos, considerada padrão da MultiChannel Systems
Thin MEA – espessura fina para possibilitar imagem invertida
MEA256 – com 256 eletrodos

15. Mea Flexível
Serve para medir sinais em implantes no
cérebro

16. Exemplo de aplicação em farmacologia
biosensor para testes in vitro de drogas
Registros elétricos feito em 6
eletrodos em fatia de hipotálamo
de rato. Cada ponto marcado com
A, B, C, D, E e F é um
microeletrodo onde foi aplicado
um hormonio que estimula o
hipotálamo (Ghrelin).
Os eletrodos que registraram
aumento no número de spikes
entre 24 e 40 s são das regiões B,
C, E e F, região onde foi aplicado
o hormônio.
As regiões A e D, mais distantes
do ponto de aplicação do
hormônio, tiveram significativa
redução do número de
spikes/segundo.

17. Hardware e Software de
sistemas MEA

18. Laboratório de Eletrofisiologia para estudos
de registros e estímulos de MEA

19. Soquete elétrico
Propiciar as conexões
elétricas com a MEA e a
sustentação mecânica

20. Amplificador para MEA
Muitos canais são necessários (60,
64, 128 ou 256 dependendo do
sistema) e um nível de ruído
elétrico baixíssimo é fundamental.
Níveis de ruído tão baixos quanto 5
µV/√Hz são necessários à entrada
do amplificador, a cada canal.
PGA (Programmable Gain Amplifier). Aspecto de um amplificador PGA headstage externo
para MEA. O operador pode alterar o ganho de cada canal simplesmente alterando um ajuste
no software de registro no computador.
- Ganho de Tensão: 1200 vezes;
- Banda passante: 1 Hz – 3 kHz;
- Contatos banhados a ouro substituíveis;
- Acesso direto a cada eletrodo para estimulação;
- Elemento de aquecimento interno, com sensor de temperatura.

21. Janela de controle do ganho do PGA no
software Neuro-Righter

22. Soquete, amplificador e placa de aquisição de
dados com conversor AD, fabricado por
MED64 Systems, Japão.

23. Softwares para fazer os registros dos sinais da
MEA
MeaBench
Neurorighter
McRack
MED64 Mobius

24. MEA Bench
•
•
Disponível grátis em: http://www.its.caltech.edu/~daw/meabench/
MEABench comunica-se com o hardware através de um driver escrito
por Thomas DeMarse ;
• Usa originalmente amplificadores de MultiChannel Systems.
Escrito em C, roda sob sistema operacional RT-Linux

25. Mea Bench
Interface gráfica

26. NeuroRigther
•
Disponivel grátis: https://sites.google.com/site/neurorighter/
NeuroRighter possibilita rejeição do ruído usado em estimulo on-line,
spike-detection, e pode gravar o pacote de dados com baixo período de
latencia. Cada um dos 64 canais é amostrado em frequencia de 25
kHz, com periodo de amostragem em torno de 9 milissegundos.
Usa placas de conversores A/D e D/A (16 bit) da National
Instruments (usadas com o Labview) que permite montar um sistema
barato de registro e estimulação de dados.

27. NeuroRigther
Interface gráfica

28. MC Rack
• É um dos softwares oficiais da MultiChannel Systems.
• Não é gratuito: http://www.multichannelsystems.com/software/mc-rack

29. MED64 Moebius
•
•
•
•
Não é gratuito, disponivel em:
http://www.med64.com/products/software.html
Faz registro de potenciais evocados e expontâneos e grava e analisa
spikes de cortes de cultura de células de neurônios.
Usa hardware proprietário de MED64 Systems.

30. Soquetes disponíveis
(MultiChannel Systems)
• Soquete montado dentro da blindagem para limitar
captação de ruídos

31. Gerador de Sinais
MEA-SG
Gera sinais elétricos variados nos pads de uma placa de circuito
impresso que tem o mesmo formato da MEA padrão;
Simula eletronicamente uma cultura de neurônios em MEA padrão
e permite testar todo o sistema: soquetes, amplificadores, conversor
AD e software de registro de dados.

32. Amplificador - headstage
• Wagenaar e Potter propõe a seguinte topologia:
• Amplificador não-inversor, seguido de um filtro passaaltas de 2ª ordem e de um filtro passa-baixas passivo de 1ª
ordem.

33. Conversor AD – Analógico Digital
• Multichannel Systems e MED64 possuem seus próprios
conversores A/D vendidos com o equipamento deles (16
bits);
• Potter e Wagenaar utilizam placas da National Instruments
(usadas com o Labview), ex: NI cDAQ 9138.
• Estrutura básica de um conversor A/D:

34. Multiplexador (MUX)
• Como são necessários registrar muitos canais, um
multiplexador é necessário na entrada do conversor A/D.
Esses muxs já fazem parte das placas de aquisição de
dados, juntamente com o conversor A/D.

35. Proposta de Trabalho

36. Proposta de Projeto
• Projeto completo para Aquisição e Registro de dados a
partir da MEA padrão de 60 eletrodos da MultiChannel
Systems, incluindo soquetes elétricos, gerador de sinais de
teste, amplificadores, circuitos para estimulação dos
neurônios, filtros e placa de aquisição de dados.
• Como os sinais eletrofisiológicos captados pelos
microeletrodos são da ordem de microvolts, esses
sinais devem ser ampliados cerca de 1200 vezes por
um sistema amplificador de duas fases, com técnicas
especiais que evitam a amplificação de ruídos.

37. Etapas do trabalho
1- Estudo dos circuitos eletrônicos envolvidos.
2- Simulação computacional do amplificador, estimulador, gerador de
sinais e placa de aquisição de dados (DAQ);
3- Construção dos protótipos: soquete, amplificador, estimulador,
gerador de sinais e DAQ
4- Levantamento das medidas elétricas concernentes aos circuitos tais
como: impedâncias, ganhos, níveis de ruído elétrico, sensibilidade, etc.
5- Comparação com as características elétricas descritas na literatura;
6- Validação de todo o sistema em condições reais de uso, aplicando-o
em MEA onde se cultiva o tecido nervoso ou neurônios dissociados.

38. Detalhes do hardware

39. Causas de Ruído em Amplificadores
Distorção e ruído estão presentes em qualquer sistema físico real e normalmente
contribuem para a deterioração das características deste sistema.
Um amplificador deveria fornecer idealmente em sua saída uma réplica do sinal de
entrada multiplicado por uma constante.
No entanto sua saída contém também sinais adicionais ausentes na sua entrada, que
são os ruídos e distorções gerados no processo de amplificação.
Ruído é um tipo de erro que não está presente no sinal original vi, mas aparece na
saída independentemente de haver ou não sinal de entrada.
Provém tanto dos circuitos internos como de fontes externas por acoplamento
eletromagnético.
O ruído tanto pode ser de natureza aleatória (randômico) como previsível
(determinístico).

40. Ruído extrínseco
• Tem causas externas, principalmente EMI (eletromagnetic
Interference) e RFI (rádio frequency interference).
• Blindagens metálicas tem por função minimizar os ruídos
extrínsecos.
• O principal que precisa ser filtrado é o de 60Hz, da rede
elétrica, e seus harmônicos (múltiplos inteiros).

41. O que é ruído intrínseco ?
Vin vs Time
1.5
R1 1k
Vin (mV)
1
R2 2k
0.5
0
-0.5
0
2
4
6
8
10
12
-1
-1.5
V1 2.5
-
Vout Ideal vs Time
VF1
+
4
U1 OPA335
3
+
+
Time (mS)
2
Vout (mV)
VG1
V2 2.5
1
0
-1 0
2
4
6
8
10
12
10
12
-2
-3
A principal fonte de ruído intrínseco
é o movimento aleatório de cargas
elétricas, que aumenta com o
aumento da temperatura;
-4
Time (mS)
Vout with Noise vs Time
5
4
Vout (mV)
3
2
1
0
-1 0
2
4
6
-2
-3
-4
Time (mS)
8

42. Tipos de ruído intrínseco em amplificadores
1) Ruído Branco (ou ruído térmico): tem densidade de potência
constante ao longo do espectro.
2) Ruído Rosa (ou ruído 1/f):a densidade espectral de potência é
inversamente proporcional à frequência do sinal.
3) Ruído de Pipoca: ocorre em semicondutores.
(1) e (2) tem distribuição estatística Normal ou Gaussiana e (3) tem distribuição multimodal
Obs: os nomes em inglês são:
1) White Noise or Broadband noise or Thermal noise
2) Pink noise or 1/f noise
3) Popcorn noise or Burst noise or Red noise

43. Equação de Johnson-Nyquist
(Equação do ruído térmico)
En = 4kTk R∆f
T
é a temperatura (kelvin)
R
é a resistência sobre a qual surge o ruído ( Ω ohms)
ΔF é o intervalo de frequência (hertz)
K
é a constante de Boltzmann ( 1.381 x 10^ -23 joule/kelvin)
En é a tensão média quadrática do ruído (valor RMS) em circuito aberto sobre um
resistor R.

44. Cálculo do ruído térmico de um estágio amplificador

45. Função dos filtros
• Reduzir a banda passante do amplificador e
consequentemente reduzir o ruído térmico;
• Filtros Passa-Altas e Passa-Baixas na saída do
amplificador headstage para limitar ruido.

46. Amplificador Headstage
• 3 topologias possíveis:
R1 10k
R3 10k
IOP1
R2 1k
-
R5 10k
IOP2
-
out
IOP3
-
out2
in2
+
R8 10k
R10 10k
I1
+
IOP5
+
R7 10k
in
R4 10k
-
R6 10k
+
IOP4
-
out3
R9 10k
Ref.
I2
+
Inversor
Não-inversor
R11 10k
Amplif. Instrumentação

47. Amplificador Não-Inversor
• Ganho é G= 1+(R2/R1) .... fora da saturação
Ganho de Tensão e de Potência em dB:
GVdB
Vout
= 20 log
Vin
Pout
GPdB = 10 log
Pin

48. Melhor escolha: AI - Amplificador de
Instrumentação
• Apresenta melhor CMMR (rejeição de ruído de modo
comum) do que o amp. não-inversor.
Fazendo todos os resistores iguais a R
Vout
 2R
= 1 +

Rg


(V1 − V2 )



49. Escolhido: Texas INA333
• Menor nível de ruído seria o INA118, porém custo muito
alto (R$ 72,00 cada peça). INA333 custa R$ 11,00.

50. Filtros passivos de 1ª ordem
• Passa-baixas e Passa-Altas RC
Filtros de 1ª ordem atenuam -6 dB por oitava ou -20db /década

51. Curvas para os filtros
• Passa-baixas
Passa-altas
1
Fc =
2πRC
Frequência de corte ou Frequência de meia-potência é a frequência abaixo da qual ou
acima da qual a potência na saída de um sistema é reduzida à metade da potência
aplicada na entrada do mesmo sistema que corresponde uma redução a 70,7% do
valor da amplitude de entrada.
Em decibéis  atenuação de -3 dB por oitava para filtros de 1ª ordem.

52. Filtros Ativos - com amplificador operacional
•
•
Filtro ativo passa-baixas de 2 ordem: possui 2 elementos que
armazenam energia - 2 capacitores - Filtro tipo Butterworth
Função de Transferência:
H ( jω ) =
•
1
ω 
1+  
ω 
 c
2
Frequência de corte:
Fcorte
1
=
2π R1C1 R2C2
2ª ordem: Atenuação de -40 dB por década ( ou -12 dB por oitava)

53. •
Filtro Ativo Passa-Altas com Amplificador
Operacional
Filtro Passa-Altas de 2ª ordem tipo Butterworth com amplificador
operacional - possui 2 capacitores.
Obs: Filtros de 2ª ordem possuem atenuação igual a -40 db por década
(ou -12 dB por oitava).
Função de Atenuação é o inverso da Função de Transferência:
A(s)=1/H(s)H(s)=1/A(s)

54. Filtros Passa-Altas são derivadores e alteram
a forma da onda !
Vo(t) : tensão na saída no instante t
Vi : tensão na entrada do filtro

55. Conversor Analógico/Digital
• Chip ADS 1299 – Conversor AD de 24 bits

56. Conversor A/D de 24 bits e multiplexador de
8 entradas num único chip
Resolução do ADC:

57. Validação e Resultados
esperados

58. Validação do protótipo
• A validação constará de 3 etapas:
a) Simulação dos Circuitos em Computador;
b) Testes Elétricos dos protótipos (modelo físico) ;
c) Testes em Campo.
(a) Simuladores como LT-Spice (Linear®), Tina (Texas®), Proteus (Labcenter®) e
Filterlab (Microchip®) serão utilizados;
(b) Construção dos protótipos em bancada e medidas de ruído do amplificador,
possivelmente no Centro Renato Archer (CTI-2) em Campinas-SP.
(c) Testes efetuados com MEA cultivada in vitro, na Universidade Federal de Uberlândia,
comparando o desempenho do sistema desenvolvido alvo dessa dissertação com o
Sistema de Aquisição e registro de dados adquirido da MCS – Multichannel Systems da
Alemanha.

59. Protocolo de testes a serem realizados na
UFU ( Univ. Federal de Uberlândia)
•
•
•
Uma cultura de células poderá ser preparada em laboratório de biologia da profa. Celina
Lotufo na UFU e cultivada em MEA para o Teste de Campo.
Na UFU está sendo providenciada a instalação do laboratório de MEA com equipamento
adquirido da MCS da Alemanha sob coordenação do prof. João Batista Destro Filho
(verba aprovada pela FAPEMIG).
Caso o equipamento de MCS já esteja instalado na UFU, um teste comparativo será
feito, com a finalidade de comparar o desempenho do protótipo descrito nesse trabalho
com o equipamento de MCS.
O teste comparativo deverá registrar a mesma cultura e os mesmos eletrodos em MEA, e
comparar os registros em três aspectos:
a) Nível de ruído elétrico introduzido pelo amplificador e placa DAQ;
b) Resolução temporal (analisando os gráficos na tela do computador)
c) Resolução do conversor A/D.

60. CRONOGRAMA

61. Cronograma
1. Revisão bibliográfica e embasamento teórico. Investigar trabalhos científicos de base teórica, dos domínios
envolvidos e trabalhos relacionados ao objetivo deste trabalho;
2. Construir os modelos computacionais;
3. Obtenção dos componentes eletrônicos;
4. Elaborar um artigo descrevendo o trabalho e submetê-lo a conferências internacionais e nacionais;
5. Preparo da Monografia para o Exame de Qualificação;
6. Construir os protótipos;
7. Efetuar as medidas elétricas com o protótipo;
8. Fazer a validação do sistema na UFU;
9. Redação do documento de Dissertação de Mestrado.
10. Entrega e defesa da Dissertação de Mestrado;

62. Apêndice
• Estágio atual do desenvolvimento do
trabalho

63. Efetuamos as medidas necessárias usando um Projetor de
Perfil

64. E desenhamos nosso primeiro protótipo

65. ...construímos artesanalmente nosso protótipo,
usando inicialmente papel, xérox...

66. E foi evoluindo...

67. Até chegar no primeiro protótipo
artesanalmente construído...

68. Mostrando toda a evolução do desenvolvimento do
soquete...

69. Produzimos então os arquivos .DFX e Gerber,
necessários à produção industrial do soquete

70. Como testar o soquete ?
•
Teste mais simples: usando solução salina ( NaCl a 3,5 % - mesma
concentração da água do mar, aplicado sobre a MEA)

71. Como testar o soquete ?
• Construindo um dispositivo de testes e simulação para o
soquete e todo o sistema, chamado MEA-SG (Signal
Generator) semelhante ao produzido por MultiChannel
Systems

72. Protótipo do MEA-SG
•
Usando um microcontrolador PIC12F683, usa o conceito de síntese
digital por software das formas de onda desejadas:

73. Usando o PWM (Pulse Width Modulator) do
microcontrolador PIC
•
Na saída do PWM, coloca-se um circuito integrador de 2 ordem,
usando 2 resistores e 2 capacitores;

74. Um integrador é...
um filtro passa-baixas operando em um frequência f muito maior que sua frequência de
corte, ou seja, f >>Fc. Levando-se em conta esse fato, escolheram-se valores adequados
para os resistores e capacitores do filtro, de modo a minimizar o ripple na senóide
produzida. Foi escolhido R1=1 Kohms, C1 = 470 nF, R2=1 Kohms e C2=100nF, de modo
que a frequência de corte ficou em 734 Hz, para um pwm trabalhando a 500 KHz.
Fcorte =
1
2π R1C1 R2C2

75. Circuito final da segunda versão do MEA SG

76. Aspecto final do protótipo, ainda em placa padrão e
circuito impresso

77. Desenhando a placa final do MEA SG

78. Circuito completo do amplificador- 1 canal

79. Equipamentos utilizados

80. Resultados Preliminares
1-Sinal medido na saída do amplificador com Osciloscópio Tektronix TDS1001-C;
2-Ganho total do amplificador ajustado para G=1000;
3-Amplificador alimentado com duas baterias de 12 volts associadas em série;
4-Sinal de entrada gerado pelo MEA-SG com amplitude calculada para 100 uV;
5-Temperatura ambiente em torno de 25º C
Obs: A rigor, o nível de ruído de um amplificador deveria ser medido com Analisador
de Espectro e a unidade usual de medida de ruído deve ser V/√Hz, a qual leva
em conta a frequência do sinal de entrada, mas dispunhamos apenas de um
osciloscópio.

81. Alguns resultados obtidos - I

82. Resultados - II

83. Resultados - III

84. Resultados - IV

85. Resultados
Nível de ruído em função do ganho de tensão para o
amplificador proposto

86. Artigo aprovado para publicação
• ISIE 2013 – 22nd IEEE International Symposium on Industrial
Electronics, Taipen (Taiwan) que acontecerá nos dias 28 a 31 de
Maio de 2013.
• Título do artigo:
– “Low noise headstage design of MEA microelectrode signal
amplification “

87. Obrigado!!