O documento discute o uso da técnica de patch-clamp e imagem de cálcio para estudar canais iônicos como alvos terapêuticos. Especificamente, aborda como canais de potássio podem ser alvos para tratamento de depressão e epilepsia e como canais de cloreto e potássio podem afetar a fertilidade masculina.

1. Danusa Menegaz, Ph.D
Patch-Clamp e Imagem de Cálcio:
Bioeletricidade como alvo terapêutico
Universidade Estadual Paulista
Departamento de Fisiologia

2. Eletrofisiologia
✓ É o estudo das propriedades elétricas das células biológicas.
✓ Envolve a medida do potencial de membrana das células
(voltagem) ou a medida das correntes iônicas que passam
através dos canais iônicos (corrente elétrica).
✓ Canais iônicos são importantes para inúmeras funções
fisiológicas:
✓ Sinais neuronais
✓ Contração muscular
✓ Ritmo cardíaco
✓ Secreção hormonal
✓ Regulação do volume celular

3. Transporte através da membrana plasmática
Meio extracelular Meio intracelular

4. Canais Iônicos

5. Patologias envolvendo
Canais iônicos
Depressão
Ansiedade
Esquizofrenia
Diabetes
Hipertensão
Câncer
Epilepsia
Dor
Enxaqueca
Infertilidade
Esclerose
Múltipla

6. K+
Ca++
Cl-
Na+
Ca++
K+
Na+
Cl-
Em = - 70 mV
(1.8 mM)(0.1 µM)
(5 mM)
(140 mM)
(137 mM)
(15 mM)
(134 mM)
(51 mM)
Gradiente eletroquímico
Gradiente elétrico
Gradiente químico
_
_ ____
+
+
+
++
+

7. Potencial de ação
K+
+
+
+
+ +
Na+ +
+
+
+ + ✓ Sinais neuronais (sinapses)
✓ Contração muscular
✓ Ritmo cardíaco
✓ Secreção hormonal

8. Lei de Ohm
V = -70 mV
_
_ ____
+
+
+
++
+
+
+
+
+ +
+
+
+
+ +
Na+ Ca+
Corrente
elétrica
Voltagem
Resistência

9. Patologias envolvendo
Canais iônicos
Depressão
Ansiedade
Esquizofrenia
Diabetes
Hipertensão
Câncer
Epilepsia
Dor
Enxaqueca
Osteoporose
Esclerose
Múltipla

10. Mudanças patológicas na frequência de
potenciais de ação elétricos em neurônios
Depressão,
desordens cognitivas
Ansiedade, esquizofrenia,
dor, epilepsia
Intervenção terapêutica
Inibidor de
canais de K+
Ativador de
canais de K+
Diminuição na frequência dos disparos
de potenciais de ação
Frequência dos disparos de
potenciais de ação normal
Aumento na frequência dos disparos
De potenciais de ação normal

11. Patologias envolvendo
Canais iônicos
Depressão
Ansiedade
Esquizofrenia
Diabetes
Hipertensão
Câncer
Epilepsia
Dor
Enxaqueca
Osteoporose
Esclerose
Múltipla

12. Atividade Elétrica da célula β-pancreática
KV
Ca++
Glicose
Ca++
K+
GLUT 2
K+
ATP
+
+
+
+ +
ATP
Insulina +
+
+
+ +

13. História da eletrofisiologia ao Patch-Clamp
1976
(Neher; Sakmann),
Patch-clamp
Prêmio Nobel em 1991
1952
(Hodkin; Huxley)
Registro intracelular, iniciação e propagação do
potencial de ação Prêmio Nobel em 1963
1850 (Hermann Helmholtz) velocidade de propagação do impulso nervoso em
milisegundos;
1790 (Luigi Galvani) Canais iônicos e impulso nervoso entre neurônio motor e
músculo em sapos;
1660 (Jam Swammerdam) Estímulo elétrico e contração muscular em sapos;

14. Set-up de eletrofisiologia
Células IsoladasFatias cerebrais

15. Voltage-clamp (mV) Current-clamp (pA)
Patch-Clamp
Canais de K+ e Cl-
Canais de Na+ e Ca++ Potencial de ação
Potencial de repouso

16. Preparação de soluções fisiológicas para prática experimental
Meio extracelular Meio intracelular

17. Osmolaridade das soluções experimentais
OSMÔMETRO

18. Configurações da técnica de Patch-Clamp
✓ Modelos de
Single-channel
✓ Modelos de Whole-cell

19. Passos para atingir a configuração cell-attached para medição de single-channel

20. Passos para atingir a configuração Whole-cell
Extra-suction
Voltage-clampCurrent-clamp

22. Patologias envolvendo
Canais iônicos
Depressão
Ansiedade
Esquizofrenia
Diabetes
Hipertensão
Câncer
Epilepsia
Dor
Enxaqueca
Infertilidade
Esclerose
Múltipla

23. K+
Ca++
Cl-
Na+
Ca++
K+
Na+
Cl-
Em = - 70 mV
(1.8 mM)(0.1 µM)
(5 mM)
(140 mM)
(137 mM)
(15 mM)
(134 mM)
(51 mM)
Gradiente eletroquímico
Gradiente elétrico
Gradiente químico
_
_ ____
+
+
+
++
+

24. 2007-2009 UCR
Doutorado sanduíche

25. K+
Ca++
Cl-
Na+
Ca++
K+
Na+
Cl-
Em = - 70 mV
(1.8 mM)(0.1 µM)
(5 mM)
(140 mM)
(137 mM)
(15 mM)
(134 mM)
(51 mM)
Gradiente eletroquímico
Gradiente elétrico
Gradiente químico
_
_ ____
+
+
+
++
+

26. Control (1)
rT3 (2)
Wash-out (3)
TEA (4)
100pA
25 ms
-80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100
-100
0
100
200
300
400
500
TEA (4)
Control (1)
rT3
(2)
I(pA)
V (mV)
Wash-out (3)
0
100
200
300
400
500 ***
###**
rT3 10-17
M
Control
TEA 20 mM
V (80 mV)
I(pA)
(A) (B)
(C)
Efluxo de K+ estimulados por T3r em células de Sertoli

27. -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100
-200
0
200
400
600
800
1000
1200
I(pA)
V (mV)
rT3
(2)
Control (1)
Wash-out (3)
TEA (4)
TEA (4)
Control (1)
rT3 (2)
Wash-out (3)
200pA
25
ms
0
500
1000
1500
***
***###
Control
rT3 10-17
M
TEA 20 mM
V (80 mV)
I(pA)
(A) (B)
(C)
Canais BK expressos em células
HEK293
Efeito rápido do T3r

28. ATP 1 mM
Despolarização causada pelo ATP em células de Sertoli
Wash-out
100 ms
10 mV
K+
+
+
+
+ +
Ca+ +
+
+
+ +
P2X7
ATP

29. 100 pA
25 ms
ATP 1 mM
Controle
Wash-out
TEA 20 mM
Efluxo de K+ estimulados por ATP em células de Sertoli
C
ontrol
A
TP
1m
M
W
ash-out
TEA
20
m
M
0
200
400
600
***
**
###
V (80 mV)
I(pA)

30. Patologias envolvendo
Canais iônicos
Depressão
Ansiedade
Esquizofrenia
Diabetes
Hipertensão
Câncer
Epilepsia
Dor
Enxaqueca
Osteoporose
Esclerose
Múltipla

31. Atividade Elétrica da célula β-pancreática
KV
Ca++
Glicose
Ca++
K+
GLUT 2
K+
ATP
+
+
+
+ +
ATP
Insulina +
+
+
+ +

33. Patologias envolvendo
Canais iônicos
Depressão
Ansiedade
Esquizofrenia
Diabetes
Hipertensão
Câncer
Epilepsia
Dor
Enxaqueca
Osteoporose
Esclerose
Múltipla

34. K+
Ca++
Cl-
Na+
Ca++
K+
Na+
Cl-
Em = - 70 mV
(1.8 mM)(0.1 µM)
(5 mM)
(140 mM)
(137 mM)
(15 mM)
(134 mM)
(51 mM)
Gradiente eletroquímico
Gradiente elétrico
Gradiente químico
_
_ ____
+
+
+
++
+

35. Canais de sódio dependentes da voltagem
GEV 50 nM
Células H460 carcinoma de pulmão humano

36. CONCLUSÂO
✓ Canais de potássio são alvos terapêuticos para o tratamento da
depressão e epilepsia.
✓ Canais de cloreto e canais de potássio podem ser importantes alvos
terapêuticos para ativar processos secretórios no controle da
espermatogênese importantes para fertilidade masculina.
✓ Canais de potássio são alvos terapêuticos para ação de novos agentes
que ativam a secreção de insulina no tratamento da diabetes.
✓ Canais de sódio são alvos terapêuticos para ação de novos agentes que
inibem metástase em células do câncer.

37. Fatia do tronco encefálico Neurônio do NTS
Patch-Clamp em fatias cerebrais

38. Patch-Clamp em fatias cerebrais

39. Fatia do tronco encefálico Neurônio do NTS
Patch-Clamp em fatias cerebrais
Maior aumento Menor aumento

40. Patologias envolvendo
Canais iônicos
Depressão
Ansiedade
Esquizofrenia
Diabetes
Hipertensão
Câncer
Epilepsia
Dor
Enxaqueca
Osteoporose
Esclerose
Múltipla

41. Angiotensina II
Na+ Principal soluto do fluido extracelular
Na+ Hipovolemia
Aldosterona
Reduzir a excreção de
sódio Aumentar o apetite ao sódio

42. Neurônios HSD2 (11 β-hidroxiesteróide desidrogenase tipo II) do NTS
conferem especificidade de ação apenas à aldosterona.
Geerling et al., 2006

43. Neurônios HSD2 do NTS
Whole-cell patch-clamp
Neurônio HSD2
Resch et al., 2017

44. Deficiência de sódio gera disparos tipo marcapasso
em neurônios HSD2 do NTS
Taxadedisparos(Hz)
Ração padrão
Furosemida +
Dieta com baixos níveis de sódio (24 hs)
Neurônio HSD2
A deficiência de
sódio ativa
neurônios HSD2
do NTS
Resch et al., 2017

45. Fatia do tronco encefálico Neurônio do NTS
Patch-Clamp em fatias cerebrais

46. Aldosterona induz despolarização e geração de
potencial de ação no NTS

47. -80 -60 -40 -20 0 20 40 60
0
200
400
600
800
Wash-out (3)
Control (1)
I(pA)
V (mV)
Aldosterone 1 uM (2)
Control (1)
Aldosterone 1 uM (2)
Wash-out (3)
200pA
50 ms
Aldosterona ativa o efluxo de potássio em neurônios do NTS
- 80 mV
- 80 mV
+ 50 mV
200 ms
+ 50 mV
K++
+
+
+ +
Na+ +
+
+
+ +
Aldo

48. 48
Neurônio HSD2 do NTS
Aldosterona
TEA
TTX
?
Kv
Nav
Nucleus
Depolarization
Na+
Na+
K+
K+
Repolarization
1
11
1
12
1
13
1
14

49. Imagem de cálcio na presença de fura-2
[Ca2+]i

50. K+
Ca++
Cl-
Na+
Ca++
K+
Na+
Cl-
(1.8 mM)(0.1 µM)
(5 mM)
(140 mM)
(137 mM)
(15 mM)
(134 mM)
(51 mM)
Gradiente eletroquímico
Gradiente elétrico
Gradiente químico
_
_ ____
+
+
+
++
+
+
+
+
+ +

51. Beta Alpha Delta
Ilhotas pancreáticas regulam o metabolismo de glicose

53. Detecção de GABA proveniente de ilhotas humanas
Na presença de
Ilhotas Humanas
Controle
biosensores
celulares

54. Secreção pulsátil de GABA em ilhotas pancreáticas de
humanos, macacos e camundongos
0.1(340/380)

55. A secreção de GABA é afetada em ilhotas humanas
com diabetes tipo 2
Ilhotas Humanas
com Diabetes
tipo 2

56. Gama-vinil recupera os pulsos de GABA em ilhotas
humanas com diabetes tipo 2
Ilhotas Humanas
com Diabetes
tipo 2
Gama-vinil
GABA