Introdução à técnica de Patch-Clamp

1. Danusa Menegaz, Ph.D
CCB/BQM/UFSC
Patch-Clamp:
Bioeletricidade como alvo terapêutico
Universidade Federal de Santa Catarina
Departamento de Bioquímica e Eletrofisiologia
NUBIOCEL (Núcleo de Bioeletricidade Celular)

2.  Eletrofisiologia, princípios básicos e aplicações;
 Membrana plasmática, canais iônicos, gradiente eletroquímico e o potencial de
ação;
 Técnica de patch-clamp: equipamentos, circuito elétrico, e configurações;
 Canais iônicos como alvos terapêuticos para desordens neurológicas,
musculares e metabólicas;
 Exemplos de registros laboratoriais em tempo-real (voltage e current-clamp);
Conteúdo Programático

3. 1660 (Jam Swammerdam) estímulo elétrico com fio de prata observou contração
muscular em sapos;
1790 (Luigi Galvani) descobriu os canais iônicos e observou o impulso nervoso
entre neurônio motor e músculo em rãs;
1850 (Hermann Helmholtz) velocidade de propagação do impulso nervoso em
milisegundos;
1952 (Hodkin; Huxley), primeiro registro com eletrodos intracelulares - potencial de
ação em neurônio de lula gigante 0.5 mm; prêmio nobel em 1963;
1976 (Neher; Sakmann), descoberta patch-clamp, single-channel, prêmio nobel em
1991;
História da eletrofisiologia ao Patch-Clamp

4. Patch-Clamp
Voltage-clamp (mV) e Current-clamp (pA)
Permite a investigação de um único canal
iônico ou de múltiplos canais iônicos numa
célula individual;
Possibilita que a voltagem seja “fixada” (mV)
para registro das correntes e que a corrente
seja “fixada” (pA) para registro da voltagem
(potencial de ação);
O princípio do método é isolar uma parte da
membrana eletricamente do meio extracelular e
registrar o fluxo de correntes através dos canais
com o uso de um microeletrodo de alta
condutância;
Canais iônicos estão envolvidos em diversas
funções fisiológicas como sinais neuronais,
contração muscular, ritmo cardíaco, secreção
hormonal e regulação do volume celular;

5. Transporte através da membrana plasmática

6. Tipos de canais Iônicos e fatores de ativação

7. Gradiente eletroquímico

8. Potencial de ação em células excitáveis

9. Preparação de soluções fisiológicas para prática experimental
Meio extracelular Meio intracelular

10. Osmolaridade das soluções experimentais
OSMÔMETRO

11. Equipamentos para técnica de patch-clamp
 Plataforma:
 Mesas anti-vibratórias;
 Mecânica e Óptica:
 Microscópio;
 Micromanipuladores;
 Pipetas;
 Sistema de Perfusão;
 Eletrônica:
 Gaiolas de Faraday;
 Amplificadores;
 Digitalização e Aquisição de Dados;
 Ruído;

12. Patch-Clamp Set-Up
Células IsoladasFatias de Tecidos

13. Circuito Elétrico

14. Microeletrodo - Estirador de Pipetas

15. Passos para atingir a configuração cell-attached para medição de single-channel

16. Configurações da técnica de Patch-Clamp
 Modelos de
Single-channel
 Modelos de Whole-cell

17. Pulso de voltagem (Voltage-clamp) para medição das correntes
Canais de K+ e Cl-
Canais de Na+ e Ca++

18. Canais de Sódio e Potássio – soluções experimentais
para anular correntes interferentes
Canal de K+ Canal de Na+

19. Pulso de corrente (current-clamp) para medição da
voltagem (potencial de ação)

20. Doenças envolvendo Canais iônicos

21. Mudanças patológicas na frequência de
potenciais de ação elétricos em neurônios

22. Kv
Atividade Elétrica da Célula β-pancreática do pâncreas

23. Configuração Whole-cell (current-clamp)

24. Biologia Molecular e Eletrofisiologia

25. Muito Obrigada