O documento descreve uma pesquisa sobre as propriedades antibacterianas e coagulantes da peçonha de espécimes juvenis da serpente Bothrops leucurus. Os resultados mostraram que a peçonha não teve atividade antibacteriana contra Escherichia coli e Staphylococcus aureus, mas apresentou forte atividade coagulante em sangue de cavalo em todas as concentrações testadas, com tempo de coagulação máximo de 3 minutos. Isso sugere que a composição química da peçonha pode variar com a idade do
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Veneno de serpente juvenil testado contra bactérias
1. REVISTA DE BIOLOGIA E CIÊNCIAS DA TERRA ISSN 1519-5228
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Volume 14 - Número 2 - 2º Semestre 2014
PROPRIEDADES ANTIBACTERIANA E COAGULANTE DA PEÇONHA DE
ESPÉCIMES JUVENIS DE Bothrops leucurus (WAGLER, 1824)
Jacqueline Ramos Machado Braga1; Diego dos Santos Pereira2
RESUMO
Serpentes da espécie Bothrops leucurus são responsáveis por cerca de 70% dos acidentes que ocorridos na Bahia, Brasil. A
peçonha é uma mistura biológica complexa de toxinas que podem provocar dor, necrose, hemorragia e, em casos graves, a
morte. No entanto, vários estudos descrevem que a peçonha pode apresentar uma forte ação antimicrobiana. Este estudo teve
como objetivo analisar o efeito antibacteriano da peçonha de B. leucurus juvenis, em cepas de bactérias Gram- positivas
(Escherichia coli ) e bactérias Gram- negativas ( Staphylococcus aureus) , bem como avaliar a sua ação coagulante em sangue
de cavalo. A susceptibilidade das cepas bacterianas foi avaliada usando o método de difusão de ágar para determinar o
potencial antimicrobiano em diferentes concentrações de um pool de peçonhas, enquanto que a coagulação foi medida em
minutos, através do método de Lee-White, nas mesmas concentrações da peçonha. Os resultados mostraram ausência de
atividade antimicrobiana para E. coli e S. aureus com todas as concentrações testadas (5 a 1000μg/mL). Apesar da peçonha
de algumas espécies de Bothrops ter sido descrita como tendo um elevado poder microbicida, supõe-se que a sazonalidade, a
idade da serpente, diferenças de sexo e/ou dietas podem levar a variações na composição química desta peçonha e consequente
diferenças nas respostas biológicas. No presente estudo, a peçonha de B. leucurus juvenis mostrou atividade coagulante em
todas as concentrações testadas, com tempo de coagulação máximo de cerca de 3 min, mesmo quando testado a uma
concentração dez vezes menor que a máxima, o que confirma a sua elevada atividade coagulante quando comparada com o
controle sem peçonha (16min) . Os resultados confirmam a atividade coagulante e mostram a ausência de atividade
antimicrobiana da peçonha de serpentes B. leucurus juvenis. Isso sugere que mudanças na composição química da peçonha
de B. leucurus podem estar relacionados à idade do animal, interferindo no seu potencial antibacteriano.
Palavras-chave: Veneno, serpente, Bothrops.
ANTIBACTERIAL AND COAGULANT PROPERTIES OF THE VENOM JUVENILES
SPECIMENS Bothrops leucurus (WAGLER, 1824)
ABSTRACT
Bothrops leucurus snakes are responsible for about 70 % of snakebites occurred in Bahia, Brazil. Its venom is a complex
biological mixture of toxins that can cause pain, necrosis, hemorrhage, and in severe cases, death. However, several
studies describe that the venom may have a strong antimicrobial action. This study aimed to evaluate the antibacterial
effect of the venom of B. juveniles leucurus , in strains of Gram - positive bacteria (Escherichia coli) and Gram - negative
bacteria (Staphylococcus aureus) and evaluate its coagulant action in horse blood . The susceptibility of the bacterial
strains was evaluated using the agar diffusion method to determine the antimicrobial activity at different concentrations
of pooled venoms, while coagulation was measured in minutes using the Lee -White method, the same concentration of
poison. The results showed no antimicrobial activity against E. coli and S. aureus in all concentrations tested (5 to
1000μg/mL). Despite the venom of some Bothrops species have been described as having a high microbicidal power, it
is assumed that seasonality , the age of the snake, sex differences and / or diets can lead to variations in the chemical
composition of the venom and the consequent differences in biological response . In the present study, the venom of B.
leucurus juveniles showed coagulant activity at all concentrations tested, with maximum clotting time of about 3 min,
even when tested at a concentration ten times less than the maximum, which confirms its high coagulation activity
compared with the control without venom (16min). The results confirm the coagulant activity and show the absence of
antimicrobial activity of the B. leucurus juveniles snakes venom. This suggests that changes in the chemical composition
of the venom of B. leucurus may be related to the age of the animal, interfering with their antibacterial potential.
Keywords: Venom, snake, Bothrops.
2. 11
INTRODUÇÃO
O Ofidismo é o estudo das serpentes e
seus diferentes tipos de peçonhas. Esta área
engloba não só aspectos relacionados à
composição, que pode variar até mesmo dentro
da própria espécie, mas questões relacionadas
aos parâmetros biológicos, avaliações
epidemiológicas e demais tópicos que envolvem
o animal e sua peculiar forma de defesa. No
Brasil, a maioria dos acidentes ofídicos,
envolvendo humanos e animais, são causados por
serpentes do gênero Bothrops, onde ocorrem no
Nordeste 12 das 24 espécies existentes no país,
sendo a Bahia um dos principais estados do
Nordeste que propiciam habitat adequado a
espécies tropicais (Lira-da-Silva et al., 2009).
Em 2001, foram registrados na Bahia
cerca de 655 casos de acidentes ofídicos somente
com espécies do gênero Bothrops (Mise et al.,
2007). No entanto, estima-se que os casos de
envenenamento por serpente ocorram muito mais
vezes do que apontam os registros, já que na
maioria dos acontecimentos o paciente tem
dificuldade em se dirigir até um posto de saúde
adequado ou faz o tratamento em casa através de
técnicas alternativas (Torres, 2010).
A B. leucurus é a serpente que apresenta
o maior índice de ocorrência de acidentes no
Recôncavo da Bahia, enquanto que a B. jararaca
e B. jararacussu têm maior ocorrência ao sul no
litoral da Bahia e em poucos municípios ao norte
do estado. Apesar do registro de algumas
ocorrências de B. jararacussu no município de
Cruz das Almas-Ba, não há números
significativos de acidentes com esta espécie, nem
ocorrência de outras espécies do gênero Bothrops
nesta região (Brazil, 2010).
Segundo Queiróz et al. (2008), as
peçonhas das serpentes brasileiras, sobretudo as
Bothrops, são misturas biológicas complexas de
toxinas, enzimas e outras substâncias ativas.
Essas substâncias apresentam ações
neurotóxicas, miotóxicas, proteolíticas e
hemorrágicas, porém muitos desses
componentes têm funções essenciais na
coagulação sanguínea, pressão arterial,
agregação plaquetária, transmissão do impulso
nervoso, funções analgésicas e anticancerígenas.
A peçonha de Bothrops pode causar, além de dor
local e mionecrose, atividade fibrinolítica,
proteolítica, hemorrágica, distúrbios como
cefaléia, vômitos, náuseas, oligúria, hemorragia,
hipotensão, visão turva, tremores e, em casos
mais graves, insuficiência renal aguda e
hemorragia sistêmica que evolui para um quadro
de choque cardiovascular (Brazil, 2010).
Estudos mostram que fosfolipases
encontradas na peçonha de serpentes do gênero
Bothrops, possuem grande potencial bactericida
para uma grande variedades de bactérias Gram-positivas
e Gram-negativas, além da peçonha
conter uma miotoxina com potencial
antiparasitário contra protozoários como
Leishmania ssp (Stabeli et al., 2006). Por esta
razão, as peçonhas caracterizam-se como
possíveis ferramentas de diagnóstico e fontes
para medicamentos. A L aminoácido oxidase I,
isolada da peçonha da serpente B. alternatus,
oferece uma potente atividade antibacteriana
contra Escherichia coli e Staphylococcus aureus
(Izidoro et al., 2006). Um estudo realizado com a
peçonha da B. jararaca demonstrou que a toxina
foi capaz de inibir formas promastigotas do
Tripanosoma cruzi, causando rompimento da
membrana e desordem mitocondrial, além de
promoverem ações contra o vírus da dengue
(Sant’ana et al., 2008).
Vários compostos de peçonhas animais
são utilizados como drogas antineoplásicas por
serem caracterizados como ricas fontes de
componentes farmacologicamente ativos. Os
peptídeos anticancer presentes nas peçonhas
contém também Proteínas Anticâncer de
Ocorrência Natural (NOAPs), encontrados em
serpentes de diversas famílias. Vários estudos
demonstraram que preparações com peçonha
bruta, bem como com seus componentes isolados
e purificados de B. jararaca inibem em
camundongos o crescimento de melanoma,
sarcoma, células de leucemia, hepatoma e câncer
de mama (Libério et al., 2013).
Segundo dados do Ministério da Saúde,
as doenças causadas por bactérias são
responsáveis por pelo menos 60% das
internações, porém menos de 5% evolui para
casos graves. A maior preocupação dos médicos
relaciona-se com as infecções hospitalares que
podem acometer pacientes debilitados, de modo
a piorar ainda mais seu quadro clinico. Em
3. 12
hospitais, as bactérias se encontram de forma
bastante disseminada, por isso existe o risco de
desenvolver rapidamente resistência a
determinados antibióticos. Por esta razão, é
necessária a busca constante por novas drogas
capazes de inibir o crescimento ou promover a
morte, principalmente daquelas que são
colonizadoras de tecidos vivos (Torres et al.,
2010).
A variação individual da peçonha de
serpentes juvenis ainda é pouco conhecida. Em
estudo recente, Dias et al. (2013) relatam que ao
analisar peçonhas de 21 espécimes juvenis de B.
jararaca, observaram que para alguns
componentes da peçonha, a atividade era
semelhante entre alguns espécimes, sendo
diferente para outros. O estudo mostrou também
que existia variação na atividade coagulante, mas
não na atividade de ativação da protombina. O
estudo concluiu que a variação observada nos
peçonhas de B. jararaca juvenis não é um
resultado de mudanças ontogenéticas ou dieta,
mas existe desde muito cedo na vida do animal.
Variações na composição das peçonhas
podem levar a diferentes atividades biológicas
sobre organismos teste, o que pode refletir
também em diferenças na resposta à soroterapia.
O presente trabalho teve como objetivo analisar
o efeito antibacteriano e coagulante da peçonha
de serpentes juvenis da espécie B. leucurus.
MATERIAIS E MÉTODOS
Peçonha
Um pool de peçonhas de serpentes
juvenis da espécie B. leucurus foi gentilmente
cedido pela Profa. Dra. Rejane Maria Lira-da-
Silva, do Núcleo de Ofiologia e Animais
Peçonhentos (NOAP) da Universidade Federal
da Bahia. Após extraída, ass peçonha foram
esterilizadas, secas a vácuo e estocadas (-20ºC)
até a sua utilização. Posteriormente, a peçonha
foi diluída para uma solução estoque
(1000μg/ml) em solução salina (tampão PBS, pH
7,4) que foi utilizada nos ensaios.
Microrganismos
As cepas bacterianas de Escherichia coli
e Staphylococcus aureus foram gentilmente
cedidas pela Profa. Dra. Norma Suely
Evangelista Barreto, do Laboratório de
Microbiologia de Alimentos e Ambiental
(NEPA) da Universidade Federal do Recôncavo
da Bahia. Com o auxílio de uma alça
bacteriológica estéril, foram colhidas colônias
bacterianas de E. coli e S.aureus isoladamente,
suspensas em 5 ml de solução salina (0,9%) e
homogeneizadas. A turbidez do inóculo foi
ajustada a 0,5 da escala de MacFarland (2x108
UFC/ml). Com auxílio do swab, foi feita a
semeadura dos microrganismos (17ml) na
superfície do meio de cultura ágar Mueller-
Hinton.
Atividade antibacteriana
A susceptibilidade das cepas bacterianas
foi analisada através do método de difusão em
ágar, para determinação do potencial
antibacteriano da peçonha. Com auxílio de uma
pipeta, a peçonha foi inoculada em discos de
difusão de papel esterilizados (3μl peçonha/PBS)
em diferentes concentrações (5, 10, 15, 25, 55,
75, 100, 200, 400, 600, 800 e 1000 μg/ml). Para
o controle negativo, foi utilizada solução salina
(0,9%) e antibiótico (Imipenem,) para o controle
positivo. As placas que receberam os discos
foram incubadas a 37oC/24h e a atividade
antibacteriana foi observada nas placas que
apresentaram qualquer halo de inibição em torno
do disco de difusão. As zonas de inibição foram
registradas em mm de diâmetro. Todos os
ensaios foram realizados em duplicata, sendo
considerada apenas a média dos diâmetros dos
respectivos halos de inibição.
Determinação do tempo de coagulação
(Teste de Lee-White)
Para o teste de atividade coagulante
foram coletados 10ml de sangue de cavalo em
tubos de vidro sem anticoagulante. A coleta foi
realizada por médicos veterinários e seguiu os
princípios éticos em pesquisa animal, adotados
pelo Comitê Brasileiro de Experimentação
Animal. Para comprovar a saúde do animal, foi
realizado hemograma com contagem de
plaquetas, assegurando a hemostasia normal do
animal.
O Teste de Lee-White foi realizado em
triplicata com aproximadamente 0,5ml de sangue
em tubos de vidro sem adição de peçonha
(controle) e em tubos contendo 0,5ml da peçonha
de B. leucurus nas diluições de 5, 10, 50, 80, 400,
600, 800 1000μg/ml que foram imediatamente
4. 13
colocados em banho-maria para aferir o tempo de
coagulação. Após 1 minuto, o primeiro tubo de
cada ensaio era inclinado até que o mesmo
pudesse ser inclinado 90°, sem que o sangue
escorresse. O procedimento foi repetido nos
tubos subsequentes a cada 30 segundos até
observar-se a formação do coágulo. O tempo
compreendido entre o momento da coleta e a
total coagulação do sangue, foi marcado como
sendo o tempo total de coagulação.
RESULTADOS E DISCUSSÕES
O pool de peçonhas de espécimes juvenis
de B. leucurus não apresentou atividade
antibacteriana sobre S. aureus (Gram+) ou sobre
E. coli (Gram-), em todas as concentrações
testadas (Figura 1). Em todos os testes, as cepas
bacterianas demonstraram crescimento normal
nas placas, com apresentação do halo de inibição
apenas no disco controle positivo que continha
antibiótico.
Figura 1 – Ensaio antibacteriano com peçonha de B.
leucurus. Em A- com cepa de S. aureus. Em B- com cepa
de E. coli. Halo de inibição visível apenas no controle
positivo (setas).
Este resultado não corrobora o estudo de
Torres et al., (2010), que encontrou atividade
antimicrobiana (S.aureus, C. albicans, P.
aeruginosa) e antiparasitária, (Leishmania ssp. e
T. cruzi), utilizando a peçonha de B. leucurus em
concentrações a partir de 250μg/ml. Entretanto,
tal estudo não revela a idade das serpentes
utilizadas nos ensaios.
Os dados do presente estudo podem ser
explicados pelos achados de Queiróz et al.,
(2008), que analisando a composição e ação de
peçonhas de serpentes do gênero Bothrops,
demostraram que existe uma grande variação na
composição e atividades das toxinas presentes na
peçonha. Em estudo in vitro, Campos et al.,
(2013) também demonstraram que existe
variação nos tipos de enzimas presentes nas
peçonhas de espécies de Bothrops. Tal variação
poderia levar a efeitos biológicos diferenciados.
Nossos achados estão de acordo com os
resultados do estudo de Núñez et al., (2009)
onde, através de avaliação proteômica e
transcriptômica da peçonha de serpentes do
gênero Bothrops, observaram que existem
diferenças significativas nas concentrações dos
componentes da peçonha, para diferentes idades.
Enquanto jovens, as serpentes deste estudo
apresentaram quase 50% da sua peçonha
composta por metaloproteases do tipo PI. Já
quando adultas, a mesma proporção é verificada
para metaloproteases do tipo PIII, estando as PI
em composições diminutas. Além destes
compostos, o estudo mostrou ainda que houve
grande variação na quantidade de fosfolipases do
tipo A2 (PLA2). Estas diferenças na composição
das peçonhas entre serpentes adultas e jovens da
mesma espécie, poderiam também induzir
alterações nos mecanismos de ação de cada uma
das peçonhas.
Diversos estudos demonstraram que a
composição da peçonha de serpente exibe
variações associadas com a origem geográfica,
habitat, variações sazonais, dieta, idade e sexo
(Furtado et al., 2006; Núñez et al., 2009; Alape-
Girón, 2008.).
Torres et al., (2010) observaram que a
fração da PLA2 e da L-Aminoácido Oxidase
(LAAO) da peçonha de B. leucurus não induziu
qualquer grau de inibição nas cepas bacterianas
testadas. Estes achados corroboram nossos
resultados, sugerindo que talvez as peçonhas que
contenham elevada concentração de
A
B
5. 14
determinados compostos podem não apresentar
atividade antimicrobiana. A ausência de
atividade antimicrobiana verificada no presente
estudo pode sugerir a presença de elevadas
concentrações de PLA2 e de LAAO, entretanto
estudos de proteômica e transcriptômica da
peçonha de B. leucurus da Bahia poderiam
confirmar tal hipótese.
Os resultados observados com o ensaio de
Lee-White mostraram que os tubos controle
apresentaram tempo de coagulação (TC) total de
16 min. Nos tubos teste, entretanto, houve
coagulação total nas concentrações de 100 a 1000
μg/ml em cerca de 2 min, apresentando variação
significativa do tempo somente quando testado
em concentrações 100 vezes menores que a
solução estoque (Figura 2) (Gráfico1).
Figura 2 – Efeito coagulante da peçonha de B. leucurus em
sangue de cavalo.
Gráfico 1 – Tempo total de coagulação (TC) do sangue de
cavalo com diferentes concentrações de peçonha de B.
leucurus, em comparação ao seu controle.
Segundo Brazil (2010), a peçonha de B.
leucurus promove uma forte ação hemorrágica
local, podendo evoluir de forma sistêmica. Os
componentes da peçonha penetram na circulação
sanguínea, consomem o fibrinogênio que se
deposita em microcoágulos principalmente nos
pulmões. Assim, o restante do sangue fica
incoagulável por falta do fibrinogênio, sem que
necessariamente haja hemorragia. Esta aparece
quando as paredes dos vasos sanguíneos menores
são lesadas pela ação proteolítica da peçonha.
O presente estudo encontrou uma forte
ação coagulante em todos os tubos testados,
resultando em Tempos de Coagulação (TC) entre
2 e 3min, mesmo em concentrações dez vezes
menores que a máxima. Segundo Ribeiro &
Jorge (1990) e Tokarnia & Peixoto (2006), a
coagulação e a hemorragia são mecanismos que
se sucedem quando se trata de envenenamento,
pois o forte efeito coagulante apresentado pela
peçonha de Bothrops induz ao consumo dos
fatores responsáveis pela coagulação. O
consumo exacerbado desses fatores leva à queda
dos níveis de fibrinogênio, ausência de
protrombina e deficiência parcial da
tromboplastina, sem a redução do número de
plaquetas, o que induz a desintegração dos
trombos, tornando o sangue mais fluido e
incoagulável, evoluindo fisiologicamente para
uma hemorragia.
CONCLUSÕES
Os resultados apresentados sugerem que
a peçonha de espécimes juvenis de B. leucurus
apresenta forte efeito coagulante, entretanto sem
atividade antibacteriana sobre cepas de S. aureus
e E.coli. Os achados da ação da peçonha obtidos
nesse trabalho abrem novas possibilidades para
os estudos referentes à variação protéica da
composição da peçonha de serpentes juvenis, da
espécie B. leucurus que habitam a Bahia,
sugerindo que o fator idade do animal pode
interferir na ação biológica da peçonha.
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18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0 5 10 50 80 400 600 800 1000
Concentração veneno (μg/ml)
Tempo de coagulação total (min)
6. 15
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______________________________________
1- Jacqueline Ramos Machado Braga
Universidade Federal do Recôncavo da Bahia (UFRB);
Centro de Ciências Agrárias, Ambientais e Biológicas
(CCAAB); Setor de Biologia - Laboratório de
Imunobiologia (IMUNOBIO); Rua Rui Barbosa, n.740,
Centro, Cruz das Almas- Bahia –Brasil - CEP:44380-000
jacquebraga@ufrb.edu.br e jacquebraga@globo.com
2- Diego dos Santos Pereira
Universidade Federal do Recôncavo da Bahia (UFRB);
Centro de Ciências Agrárias, Ambientais e Biológicas
(CCAAB); Setor de Biologia - Laboratório de
Imunobiologia (IMUNOBIO); Rua Rui Barbosa, n.740,
Centro, Cruz das Almas- Bahia –Brasil - CEP:44380-000
digopereira2006@hotmail.com