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  1. 1. REVISTA DE BIOLOGIA E CIÊNCIAS DA TERRA ISSN 1519-5228 10 Volume 14 - Número 2 - 2º Semestre 2014 PROPRIEDADES ANTIBACTERIANA E COAGULANTE DA PEÇONHA DE ESPÉCIMES JUVENIS DE Bothrops leucurus (WAGLER, 1824) Jacqueline Ramos Machado Braga1; Diego dos Santos Pereira2 RESUMO Serpentes da espécie Bothrops leucurus são responsáveis por cerca de 70% dos acidentes que ocorridos na Bahia, Brasil. A peçonha é uma mistura biológica complexa de toxinas que podem provocar dor, necrose, hemorragia e, em casos graves, a morte. No entanto, vários estudos descrevem que a peçonha pode apresentar uma forte ação antimicrobiana. Este estudo teve como objetivo analisar o efeito antibacteriano da peçonha de B. leucurus juvenis, em cepas de bactérias Gram- positivas (Escherichia coli ) e bactérias Gram- negativas ( Staphylococcus aureus) , bem como avaliar a sua ação coagulante em sangue de cavalo. A susceptibilidade das cepas bacterianas foi avaliada usando o método de difusão de ágar para determinar o potencial antimicrobiano em diferentes concentrações de um pool de peçonhas, enquanto que a coagulação foi medida em minutos, através do método de Lee-White, nas mesmas concentrações da peçonha. Os resultados mostraram ausência de atividade antimicrobiana para E. coli e S. aureus com todas as concentrações testadas (5 a 1000μg/mL). Apesar da peçonha de algumas espécies de Bothrops ter sido descrita como tendo um elevado poder microbicida, supõe-se que a sazonalidade, a idade da serpente, diferenças de sexo e/ou dietas podem levar a variações na composição química desta peçonha e consequente diferenças nas respostas biológicas. No presente estudo, a peçonha de B. leucurus juvenis mostrou atividade coagulante em todas as concentrações testadas, com tempo de coagulação máximo de cerca de 3 min, mesmo quando testado a uma concentração dez vezes menor que a máxima, o que confirma a sua elevada atividade coagulante quando comparada com o controle sem peçonha (16min) . Os resultados confirmam a atividade coagulante e mostram a ausência de atividade antimicrobiana da peçonha de serpentes B. leucurus juvenis. Isso sugere que mudanças na composição química da peçonha de B. leucurus podem estar relacionados à idade do animal, interferindo no seu potencial antibacteriano. Palavras-chave: Veneno, serpente, Bothrops. ANTIBACTERIAL AND COAGULANT PROPERTIES OF THE VENOM JUVENILES SPECIMENS Bothrops leucurus (WAGLER, 1824) ABSTRACT Bothrops leucurus snakes are responsible for about 70 % of snakebites occurred in Bahia, Brazil. Its venom is a complex biological mixture of toxins that can cause pain, necrosis, hemorrhage, and in severe cases, death. However, several studies describe that the venom may have a strong antimicrobial action. This study aimed to evaluate the antibacterial effect of the venom of B. juveniles leucurus , in strains of Gram - positive bacteria (Escherichia coli) and Gram - negative bacteria (Staphylococcus aureus) and evaluate its coagulant action in horse blood . The susceptibility of the bacterial strains was evaluated using the agar diffusion method to determine the antimicrobial activity at different concentrations of pooled venoms, while coagulation was measured in minutes using the Lee -White method, the same concentration of poison. The results showed no antimicrobial activity against E. coli and S. aureus in all concentrations tested (5 to 1000μg/mL). Despite the venom of some Bothrops species have been described as having a high microbicidal power, it is assumed that seasonality , the age of the snake, sex differences and / or diets can lead to variations in the chemical composition of the venom and the consequent differences in biological response . In the present study, the venom of B. leucurus juveniles showed coagulant activity at all concentrations tested, with maximum clotting time of about 3 min, even when tested at a concentration ten times less than the maximum, which confirms its high coagulation activity compared with the control without venom (16min). The results confirm the coagulant activity and show the absence of antimicrobial activity of the B. leucurus juveniles snakes venom. This suggests that changes in the chemical composition of the venom of B. leucurus may be related to the age of the animal, interfering with their antibacterial potential. Keywords: Venom, snake, Bothrops.
  2. 2. 11 INTRODUÇÃO O Ofidismo é o estudo das serpentes e seus diferentes tipos de peçonhas. Esta área engloba não só aspectos relacionados à composição, que pode variar até mesmo dentro da própria espécie, mas questões relacionadas aos parâmetros biológicos, avaliações epidemiológicas e demais tópicos que envolvem o animal e sua peculiar forma de defesa. No Brasil, a maioria dos acidentes ofídicos, envolvendo humanos e animais, são causados por serpentes do gênero Bothrops, onde ocorrem no Nordeste 12 das 24 espécies existentes no país, sendo a Bahia um dos principais estados do Nordeste que propiciam habitat adequado a espécies tropicais (Lira-da-Silva et al., 2009). Em 2001, foram registrados na Bahia cerca de 655 casos de acidentes ofídicos somente com espécies do gênero Bothrops (Mise et al., 2007). No entanto, estima-se que os casos de envenenamento por serpente ocorram muito mais vezes do que apontam os registros, já que na maioria dos acontecimentos o paciente tem dificuldade em se dirigir até um posto de saúde adequado ou faz o tratamento em casa através de técnicas alternativas (Torres, 2010). A B. leucurus é a serpente que apresenta o maior índice de ocorrência de acidentes no Recôncavo da Bahia, enquanto que a B. jararaca e B. jararacussu têm maior ocorrência ao sul no litoral da Bahia e em poucos municípios ao norte do estado. Apesar do registro de algumas ocorrências de B. jararacussu no município de Cruz das Almas-Ba, não há números significativos de acidentes com esta espécie, nem ocorrência de outras espécies do gênero Bothrops nesta região (Brazil, 2010). Segundo Queiróz et al. (2008), as peçonhas das serpentes brasileiras, sobretudo as Bothrops, são misturas biológicas complexas de toxinas, enzimas e outras substâncias ativas. Essas substâncias apresentam ações neurotóxicas, miotóxicas, proteolíticas e hemorrágicas, porém muitos desses componentes têm funções essenciais na coagulação sanguínea, pressão arterial, agregação plaquetária, transmissão do impulso nervoso, funções analgésicas e anticancerígenas. A peçonha de Bothrops pode causar, além de dor local e mionecrose, atividade fibrinolítica, proteolítica, hemorrágica, distúrbios como cefaléia, vômitos, náuseas, oligúria, hemorragia, hipotensão, visão turva, tremores e, em casos mais graves, insuficiência renal aguda e hemorragia sistêmica que evolui para um quadro de choque cardiovascular (Brazil, 2010). Estudos mostram que fosfolipases encontradas na peçonha de serpentes do gênero Bothrops, possuem grande potencial bactericida para uma grande variedades de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, além da peçonha conter uma miotoxina com potencial antiparasitário contra protozoários como Leishmania ssp (Stabeli et al., 2006). Por esta razão, as peçonhas caracterizam-se como possíveis ferramentas de diagnóstico e fontes para medicamentos. A L aminoácido oxidase I, isolada da peçonha da serpente B. alternatus, oferece uma potente atividade antibacteriana contra Escherichia coli e Staphylococcus aureus (Izidoro et al., 2006). Um estudo realizado com a peçonha da B. jararaca demonstrou que a toxina foi capaz de inibir formas promastigotas do Tripanosoma cruzi, causando rompimento da membrana e desordem mitocondrial, além de promoverem ações contra o vírus da dengue (Sant’ana et al., 2008). Vários compostos de peçonhas animais são utilizados como drogas antineoplásicas por serem caracterizados como ricas fontes de componentes farmacologicamente ativos. Os peptídeos anticancer presentes nas peçonhas contém também Proteínas Anticâncer de Ocorrência Natural (NOAPs), encontrados em serpentes de diversas famílias. Vários estudos demonstraram que preparações com peçonha bruta, bem como com seus componentes isolados e purificados de B. jararaca inibem em camundongos o crescimento de melanoma, sarcoma, células de leucemia, hepatoma e câncer de mama (Libério et al., 2013). Segundo dados do Ministério da Saúde, as doenças causadas por bactérias são responsáveis por pelo menos 60% das internações, porém menos de 5% evolui para casos graves. A maior preocupação dos médicos relaciona-se com as infecções hospitalares que podem acometer pacientes debilitados, de modo a piorar ainda mais seu quadro clinico. Em
  3. 3. 12 hospitais, as bactérias se encontram de forma bastante disseminada, por isso existe o risco de desenvolver rapidamente resistência a determinados antibióticos. Por esta razão, é necessária a busca constante por novas drogas capazes de inibir o crescimento ou promover a morte, principalmente daquelas que são colonizadoras de tecidos vivos (Torres et al., 2010). A variação individual da peçonha de serpentes juvenis ainda é pouco conhecida. Em estudo recente, Dias et al. (2013) relatam que ao analisar peçonhas de 21 espécimes juvenis de B. jararaca, observaram que para alguns componentes da peçonha, a atividade era semelhante entre alguns espécimes, sendo diferente para outros. O estudo mostrou também que existia variação na atividade coagulante, mas não na atividade de ativação da protombina. O estudo concluiu que a variação observada nos peçonhas de B. jararaca juvenis não é um resultado de mudanças ontogenéticas ou dieta, mas existe desde muito cedo na vida do animal. Variações na composição das peçonhas podem levar a diferentes atividades biológicas sobre organismos teste, o que pode refletir também em diferenças na resposta à soroterapia. O presente trabalho teve como objetivo analisar o efeito antibacteriano e coagulante da peçonha de serpentes juvenis da espécie B. leucurus. MATERIAIS E MÉTODOS Peçonha Um pool de peçonhas de serpentes juvenis da espécie B. leucurus foi gentilmente cedido pela Profa. Dra. Rejane Maria Lira-da- Silva, do Núcleo de Ofiologia e Animais Peçonhentos (NOAP) da Universidade Federal da Bahia. Após extraída, ass peçonha foram esterilizadas, secas a vácuo e estocadas (-20ºC) até a sua utilização. Posteriormente, a peçonha foi diluída para uma solução estoque (1000μg/ml) em solução salina (tampão PBS, pH 7,4) que foi utilizada nos ensaios. Microrganismos As cepas bacterianas de Escherichia coli e Staphylococcus aureus foram gentilmente cedidas pela Profa. Dra. Norma Suely Evangelista Barreto, do Laboratório de Microbiologia de Alimentos e Ambiental (NEPA) da Universidade Federal do Recôncavo da Bahia. Com o auxílio de uma alça bacteriológica estéril, foram colhidas colônias bacterianas de E. coli e S.aureus isoladamente, suspensas em 5 ml de solução salina (0,9%) e homogeneizadas. A turbidez do inóculo foi ajustada a 0,5 da escala de MacFarland (2x108 UFC/ml). Com auxílio do swab, foi feita a semeadura dos microrganismos (17ml) na superfície do meio de cultura ágar Mueller- Hinton. Atividade antibacteriana A susceptibilidade das cepas bacterianas foi analisada através do método de difusão em ágar, para determinação do potencial antibacteriano da peçonha. Com auxílio de uma pipeta, a peçonha foi inoculada em discos de difusão de papel esterilizados (3μl peçonha/PBS) em diferentes concentrações (5, 10, 15, 25, 55, 75, 100, 200, 400, 600, 800 e 1000 μg/ml). Para o controle negativo, foi utilizada solução salina (0,9%) e antibiótico (Imipenem,) para o controle positivo. As placas que receberam os discos foram incubadas a 37oC/24h e a atividade antibacteriana foi observada nas placas que apresentaram qualquer halo de inibição em torno do disco de difusão. As zonas de inibição foram registradas em mm de diâmetro. Todos os ensaios foram realizados em duplicata, sendo considerada apenas a média dos diâmetros dos respectivos halos de inibição. Determinação do tempo de coagulação (Teste de Lee-White) Para o teste de atividade coagulante foram coletados 10ml de sangue de cavalo em tubos de vidro sem anticoagulante. A coleta foi realizada por médicos veterinários e seguiu os princípios éticos em pesquisa animal, adotados pelo Comitê Brasileiro de Experimentação Animal. Para comprovar a saúde do animal, foi realizado hemograma com contagem de plaquetas, assegurando a hemostasia normal do animal. O Teste de Lee-White foi realizado em triplicata com aproximadamente 0,5ml de sangue em tubos de vidro sem adição de peçonha (controle) e em tubos contendo 0,5ml da peçonha de B. leucurus nas diluições de 5, 10, 50, 80, 400, 600, 800 1000μg/ml que foram imediatamente
  4. 4. 13 colocados em banho-maria para aferir o tempo de coagulação. Após 1 minuto, o primeiro tubo de cada ensaio era inclinado até que o mesmo pudesse ser inclinado 90°, sem que o sangue escorresse. O procedimento foi repetido nos tubos subsequentes a cada 30 segundos até observar-se a formação do coágulo. O tempo compreendido entre o momento da coleta e a total coagulação do sangue, foi marcado como sendo o tempo total de coagulação. RESULTADOS E DISCUSSÕES O pool de peçonhas de espécimes juvenis de B. leucurus não apresentou atividade antibacteriana sobre S. aureus (Gram+) ou sobre E. coli (Gram-), em todas as concentrações testadas (Figura 1). Em todos os testes, as cepas bacterianas demonstraram crescimento normal nas placas, com apresentação do halo de inibição apenas no disco controle positivo que continha antibiótico. Figura 1 – Ensaio antibacteriano com peçonha de B. leucurus. Em A- com cepa de S. aureus. Em B- com cepa de E. coli. Halo de inibição visível apenas no controle positivo (setas). Este resultado não corrobora o estudo de Torres et al., (2010), que encontrou atividade antimicrobiana (S.aureus, C. albicans, P. aeruginosa) e antiparasitária, (Leishmania ssp. e T. cruzi), utilizando a peçonha de B. leucurus em concentrações a partir de 250μg/ml. Entretanto, tal estudo não revela a idade das serpentes utilizadas nos ensaios. Os dados do presente estudo podem ser explicados pelos achados de Queiróz et al., (2008), que analisando a composição e ação de peçonhas de serpentes do gênero Bothrops, demostraram que existe uma grande variação na composição e atividades das toxinas presentes na peçonha. Em estudo in vitro, Campos et al., (2013) também demonstraram que existe variação nos tipos de enzimas presentes nas peçonhas de espécies de Bothrops. Tal variação poderia levar a efeitos biológicos diferenciados. Nossos achados estão de acordo com os resultados do estudo de Núñez et al., (2009) onde, através de avaliação proteômica e transcriptômica da peçonha de serpentes do gênero Bothrops, observaram que existem diferenças significativas nas concentrações dos componentes da peçonha, para diferentes idades. Enquanto jovens, as serpentes deste estudo apresentaram quase 50% da sua peçonha composta por metaloproteases do tipo PI. Já quando adultas, a mesma proporção é verificada para metaloproteases do tipo PIII, estando as PI em composições diminutas. Além destes compostos, o estudo mostrou ainda que houve grande variação na quantidade de fosfolipases do tipo A2 (PLA2). Estas diferenças na composição das peçonhas entre serpentes adultas e jovens da mesma espécie, poderiam também induzir alterações nos mecanismos de ação de cada uma das peçonhas. Diversos estudos demonstraram que a composição da peçonha de serpente exibe variações associadas com a origem geográfica, habitat, variações sazonais, dieta, idade e sexo (Furtado et al., 2006; Núñez et al., 2009; Alape- Girón, 2008.). Torres et al., (2010) observaram que a fração da PLA2 e da L-Aminoácido Oxidase (LAAO) da peçonha de B. leucurus não induziu qualquer grau de inibição nas cepas bacterianas testadas. Estes achados corroboram nossos resultados, sugerindo que talvez as peçonhas que contenham elevada concentração de A B
  5. 5. 14 determinados compostos podem não apresentar atividade antimicrobiana. A ausência de atividade antimicrobiana verificada no presente estudo pode sugerir a presença de elevadas concentrações de PLA2 e de LAAO, entretanto estudos de proteômica e transcriptômica da peçonha de B. leucurus da Bahia poderiam confirmar tal hipótese. Os resultados observados com o ensaio de Lee-White mostraram que os tubos controle apresentaram tempo de coagulação (TC) total de 16 min. Nos tubos teste, entretanto, houve coagulação total nas concentrações de 100 a 1000 μg/ml em cerca de 2 min, apresentando variação significativa do tempo somente quando testado em concentrações 100 vezes menores que a solução estoque (Figura 2) (Gráfico1). Figura 2 – Efeito coagulante da peçonha de B. leucurus em sangue de cavalo. Gráfico 1 – Tempo total de coagulação (TC) do sangue de cavalo com diferentes concentrações de peçonha de B. leucurus, em comparação ao seu controle. Segundo Brazil (2010), a peçonha de B. leucurus promove uma forte ação hemorrágica local, podendo evoluir de forma sistêmica. Os componentes da peçonha penetram na circulação sanguínea, consomem o fibrinogênio que se deposita em microcoágulos principalmente nos pulmões. Assim, o restante do sangue fica incoagulável por falta do fibrinogênio, sem que necessariamente haja hemorragia. Esta aparece quando as paredes dos vasos sanguíneos menores são lesadas pela ação proteolítica da peçonha. O presente estudo encontrou uma forte ação coagulante em todos os tubos testados, resultando em Tempos de Coagulação (TC) entre 2 e 3min, mesmo em concentrações dez vezes menores que a máxima. Segundo Ribeiro & Jorge (1990) e Tokarnia & Peixoto (2006), a coagulação e a hemorragia são mecanismos que se sucedem quando se trata de envenenamento, pois o forte efeito coagulante apresentado pela peçonha de Bothrops induz ao consumo dos fatores responsáveis pela coagulação. O consumo exacerbado desses fatores leva à queda dos níveis de fibrinogênio, ausência de protrombina e deficiência parcial da tromboplastina, sem a redução do número de plaquetas, o que induz a desintegração dos trombos, tornando o sangue mais fluido e incoagulável, evoluindo fisiologicamente para uma hemorragia. CONCLUSÕES Os resultados apresentados sugerem que a peçonha de espécimes juvenis de B. leucurus apresenta forte efeito coagulante, entretanto sem atividade antibacteriana sobre cepas de S. aureus e E.coli. Os achados da ação da peçonha obtidos nesse trabalho abrem novas possibilidades para os estudos referentes à variação protéica da composição da peçonha de serpentes juvenis, da espécie B. leucurus que habitam a Bahia, sugerindo que o fator idade do animal pode interferir na ação biológica da peçonha. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BRAZIL, T. K. 2010. Catálogo da fauna terrestre de importância médica da Bahia. Edufba, Salvador- BA: Edufba, 2010, 202p. 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 5 10 50 80 400 600 800 1000 Concentração veneno (μg/ml) Tempo de coagulação total (min)
  6. 6. 15 DIAS, G.S.; KITANO, E.S.; PAGOTTO, A.H; SANT’ANNA, S.S.; ROCHA, M.M.T.;, ZELANIS, A.; SERRANO, S.M.T. Individual variability in the venom proteome of juvenile Bothrops jararaca specimens. Jour. Proteom. Res., v. 12, n.10, p. 4585-4598, 2013. FURTADO, M.F.; TRAVAGLIA-CARDOSO, S.R.; ROCHA, M.M. Sexual dimorphism in venom of Bothrops jararaca (Serpentes: Viperidae). Toxicon, v. 48, n.4, p. 401–410, 2006. IZIDORO, L. F. M.; RIBEIRO, M. C.; SOUZA, G. R. L.; SANT’ANA, C. D.; HAMAGUCHI, A.; SAMPAIO, S. V.; SCARES, A. M.; RODRIGUES, V. M. Biochemical and functional characterization of an L-amino acid oxidase isolated from Bothops pirajai snake venom. Bioorg. Med. Chem., v.14, n.20, p. 7034– 7043, 2006. LIBÉRIO M.S.; JOANITTI G.A.; FONTES W.; CASTRO M.S. Anticancer peptides and proteins: a panoramic view. Prot. & Pept. Let., n.20, p.380-391, 2013. LIRA-DA-SILVA, M. R; MISE, Y. F; CASAIS-E- SILVA, L. L; ULLOA. J; BRENO HAMDAN, B; BRAZIL T. K. Morbimortalidade por ofidismo no Nordeste do Brasil (1999-2003). Gaz. Med. Ba., n. 79, p. 21-25, 2009. MISE, Y. F; LIRA-DA-SILVA, R. M; CARVALHO, F. M. Envenenamento por serpentes do gênero Bothrops no Estado da Bahia: aspectos epidemiológicos e clínicos. Rev. Soc. Bras. Med. Trop., v.40, n.5, p. 569-573, 2007. NÚÑEZ, V.; CID, P.; SANZ, L.; DE LA TORRE, P.; ANGULO, Y.; LOMONTE, B.; GUTIÉRREZ, J. M.; CALVETE, J. J. Snake venomics and antivenomics of Bothrops atrox venoms from Colombia and the Amazon regions of Brazil, Perú and Ecuador suggest the occurrence of geographic variation of venom phenotype by a trend towards paedomorphism. Jour. Proteom., n.73, p.57-78, 2009. QUEIROZ, G. P.; PESSOA, L. A.; PORTARO, F. C. V.; FURTADO, M. DE F. D.; TAMBOURGI, D. V. Interspecific variation in venom composition and toxicity of brazilian snakes from Bothrops venom. Toxicon, n.52, p. 842-851, 2009. RIBEIRO, L. A. & JORGE, M. T. Epidemiologia e quadro clínico dos acidentes por serpentes Bothrops jararaca adultas e filhotes. Ver. Inst. Med. Trop., v.32, n.6, p. 436-442, 1990. SANT’ANA, C.D.; MENALDO, D. L.; COSTA, T. R.; GODY, H.; MULLER, V. D. M.; AQUINO, V. H.; ALBUQUERQUE, S.; SAMPAIO, S. V.; MONTEIRO, M. C.; STÁBELI, R. G. SOARES, A. M. Antiviral and antiparasite properties of an L-Amino Acid Oxidase from the snake Bothrops jararaca: cloning and identification of a complete cDNA sequence. Biochem. Pharmacol., n.76, p. 279- 288, 2008. STÁBELI, R. G.; AMUI, S. F.; SANT’ANA, C. D.; PIRES, M. G.; NOMIZO, A.; MONTEIRO, M. C.; ROMÃO, P. R.; GUERRA-SÁ, R.; VIERA, C. A.; GIGLIO, J.R.; FONTES, M. R.; SOARES, A. M. Bothrops moojeni miotoxin-Ii, an Lys49 Phospholipase A2 homologue: an example of function versatility of snake venom proteins. Comp. Biochem. Physiol. Toxicol. Pharmacol., n. 142, p. 3-4, 2006. TOKARNIA, C. H. & PEIXOTO, P. V. A importância dos acidentes ofídicos como causa de mortes em bovinos no Brasil. Pesq. Vet. Bras., v.26, n.2, p. 55-68, 2006. ______________________________________ 1- Jacqueline Ramos Machado Braga Universidade Federal do Recôncavo da Bahia (UFRB); Centro de Ciências Agrárias, Ambientais e Biológicas (CCAAB); Setor de Biologia - Laboratório de Imunobiologia (IMUNOBIO); Rua Rui Barbosa, n.740, Centro, Cruz das Almas- Bahia –Brasil - CEP:44380-000 jacquebraga@ufrb.edu.br e jacquebraga@globo.com 2- Diego dos Santos Pereira Universidade Federal do Recôncavo da Bahia (UFRB); Centro de Ciências Agrárias, Ambientais e Biológicas (CCAAB); Setor de Biologia - Laboratório de Imunobiologia (IMUNOBIO); Rua Rui Barbosa, n.740, Centro, Cruz das Almas- Bahia –Brasil - CEP:44380-000 digopereira2006@hotmail.com

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