Produção de enzimas pectinases

1. Enzimas PECTINASES
Patrícia Poletto

2. Substâncias pécticas
Protopectina - insolúvel
Ácido péctico - sem grupos esterificados
Ácido pectínico - 0 a 75% de grupos esterificados
Pectina - mínimo de 75% de grupos esterificados
Representação da estrutura da parede celular de plantas .
Sharma et al. (2012). Rev. Environm. Sci. Biotechnol. 12: 45–60.
Jayani et al. (2005). Process Biochem. 40:2931–2944.
Pedrolli et al. (2009). Open Biotechnol. J. 3: 9-18.
INTRODUÇÃO

3. Enzimas Pectinolíticas
•Pectina Liase
•Exo - poligalacturonase
•Endo - poligalacturonase
Despolimerizantes
• Pectina esteraseDesmetoxilante
INTRODUÇÃO

4. Mecanismo de ação das principais enzimas encontradas nas preparações pectinolíticas.
Fonte:http://www.ncbe.reading.ac.uk/ncbe/protocols/ inajam/pdf/jam01.pdf
Enzimas Pectinolíticas
INTRODUÇÃO

5. Sucos de frutas
Maceração
Despectinização
Aumento na extração, liberação de
aromas e antioxidantes
Clarificação, redução de viscosidade e
aumento na estabilidade
Grassin, C.; Fauquembergue, P. (1996). Progress in Biotechnology, 14:453-462.
Sandri et al. (2011). LWT – Food Science and Technology, 44: 2217-2222.
Nur ‘Aliaa et al. (2011). Journal of Food Process Engineering, 34: 1523-1534.
INTRODUÇÃO
Aplicação das pectinases no processamento de sucos de frutas

6. Despectinização de suco de maçã: hidrólise da pectina gera agregação de partículas
Fonte: http://www.ncbe.reading.ac.uk/ncbe/protocols/inajam/pdf/jam01.pdf .
Pinelo et al. (2010). Food and Bioproducts Processing, 88:259-265.
Kashyap et al. (2001). Bioresource Technology, 77:215-227.
INTRODUÇÃO
Viscosidade
Turbidez
Clarificação

7. INTRODUÇÃO
Brasil
Aplicação das pectinases no processamento de sucos de frutas
Ibravin
Produção de suco
de uva - 2013
33 milhões de litros
Dosagem - 3 g de
enzima por 100 kg
de fruta
1 tonelada de
enzimas

8. Microrganismos produtores de pectinases
Anvisa: Aspergillus awamori , Aspergillus foetidus, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae,
Penicillium simplicissium, Rhizopus oryzae, Trichoderma reesei.
RESOLUÇÃO ANVISA Nº 26, DE 26 DE MAIO DE 2009
FDA – GRAS (generally recognized as safe)
INTRODUÇÃO
Enzima Microrganismo Empresa produtora
Pectinex Ultra SP-L Aspergillus aculeatus Novozymes
Pectinex Ultra Clear
Aspergillus aculeatus
Aspergillus niger
Novozymes
Pectinex Ultra Color
Aspergillus aculeatus
Aspergillus niger
Novozymes
Pectinex Ultra Mesh
Aspergillus aculeatus
Aspergillus niger
Novozymes
Novozym 33095
Aspergillus aculeatus
Aspergillus niger
Novozymes
Rohapect 10L Aspergillus niger Rŏhm Enzyme
Rapidase Vino super L Aspergillus niger DSM
Rapidase Adex-D Aspergillus sp DSM
Cultivo
Submerso
Novozymes. (2013). Enzymes at work. http://www.novozymes.com/en/about-us/brochures/Documents/Enzymes_at_work.pdf

9. Cultivo em estado sólido (CES) Cultivo submerso (CSm)
Meio apresenta ate 80% de umidade; as hifas são
expostas ao ar podendo ser ressecadas
Meio é geralmente solubilizado em água; as hifas se
mantêm hidratadas
Baixo risco de contaminação devido à baixa
atividade de água
O risco de contaminação é maior
Espessura do meio dentro do reator é pequena
(baixo volume de ocupação)
Geralmente o volume útil do reator é ocupado
Substrato sólido fornece nutrientes Os nutrientes estão dissolvidos no meio líquido
O2 é livremente disponível na superfície da partícula
A disponibilidade de O2 pode ser controlada
razoavelmente bem
Ocorrem gradientes de temperatura, pH e umidade
ao longo do cultivo (difícil controle)
Os parâmetros pH e temperatura são geralmente
controlados ao longo do cultivo
Movimento das partículas do substrato sólido pode
causar impacto e danos severos ao microrganismo
Agitação dos biorreatores, geralmente proporciona
ambiente de baixo cisalhamento
Problemas causados por inibição são baixos Inibição por substrato e produto são mais frequentes
INTRODUÇÃO
Prabhakar et al. (2005). Malaysian J. Microbiol. 12: 10-16.
Hölker & Lenz (2005). Curr. Opin. Microbiol. 8: 301-306.

10. INTRODUÇÃO
Biorreatores utilizados em cultivo em estado sólido
Mitchell et al. (2006). Solid-state fermentation bioreactors. Fundamentals of design and operation. Springer-Verlag Berlin

11. INTRODUÇÃO
pH
Umidade
Temperatura
Aeração
Espessura do
meio
Agitação
Produção de enzimas pectinolíticas por CES –
Efeito dos parâmetros operacionais

12. INTRODUÇÃO
pH
Umidade
Temperatura
Aeração
Espessura do
meio
Agitação
Não sofre controle durante o cultivo
Ajuste-se o valor no início do cultivo
Berovič & OstroveršniK (1997). J. Biotechnol. 53: 47-53.
Produção de enzimas pectinolíticas por CES –
Efeito dos parâmetros operacionais

13. INTRODUÇÃO
pH
Umidade
Temperatura
Aeração
Espessura do
meio
Agitação
T aumenta até 20oC acima da T de incubação
Gradientes de temperatura de 3 a 5oC
Diminuição do crescimento e formação de produto
Desnaturação do produto
Limita a espessura do meio
Thomas et al. (2013). Biochem. Eng. J. 81: 146-161.
Meien et al. (2004). Chem. Eng. Sci. 59: 4493-4504.
Chen et al. (2005). Biochem. Eng. J. 23: 117-122.
Produção de enzimas pectinolíticas por CES –
Efeito dos parâmetros operacionais

14. INTRODUÇÃO
pH
Umidade
Temperatura
Aeração
Espessura do
meio
Agitação
Limita o crescimento e o metabolismo
Altos níveis reduzem a porosidade do meio
Pandey, A. (2003). Biochem. Eng. J. 13: 81-84.
Demir & Tari, (2014). Ind. Crops Prod. 54: 302-309.
Produção de enzimas pectinolíticas por CES –
Efeito dos parâmetros operacionais

15. INTRODUÇÃO
pH
Umidade
Temperatura
Aeração
Espessura do
meio
Agitação
Fornecer O2 para o metabolismo
Remover CO2, calor e vapor de água
Otimização do fluxo de ar empregado
Rodríguez-Fernández et al. (2011). Bioresour. Technol. 102: 10657-10662.
Kalogeris, et al. (2003). Bioresour. Technol. 86: 207-213.
Produção de enzimas pectinolíticas por CES –
Efeito dos parâmetros operacionais

16. INTRODUÇÃO
pH
Umidade
Temperatura
Aeração
Espessura do
meio
Agitação
Fator limitante em grandes escalas devido ao
acúmulo de calor
Thomas et al. (2013). Biochem. Eng. J. 81: 146-161.
Mitchell et al. (2006). Solid-state fermentation bioreactors.
Fundamentals of design and operation. Springer-Verlag Berlin
Heidelberg.
Produção de enzimas pectinolíticas por CES –
Efeito dos parâmetros operacionais

17. INTRODUÇÃO
pH
Umidade
Temperatura
Aeração
Espessura do
meio
Agitação
Contínua ou intermitente
Agitações intensas podem causar danos ao micélio
Rodríguez-Jasso et al. (2013). Food Bioproduc. Process. 91: 587-594.
Gasiorek (2008). Chem. Pap. 62: 141-146.
Demir & Tari (2014). Ind. Crops Prod. 54: 302-309.
Produção de enzimas pectinolíticas por CES –
Efeito dos parâmetros operacionais

18. Recuperação, concentração e purificação de enzimas
Fluxograma das etapas do processo de recuperação das enzimas (downstream processing)
(Adaptado de Lima et al., (2001). Biotecnologia Industrial: Processos Fermentativos e Enzimáticos).
INTRODUÇÃO

19. Métodos de concentração de enzimas
Liofilização
Sais presentes na solução inicial são
concentrados. Enzima na forma de
pó é muito mais estável.
Membranas de
separação
Processo rápido e apresenta altos
níveis de recuperação.
Evaporação 30-40°C, alto consumo energético.
Precipitação
Precipitação por solvente ou por sais.
Pequena escala.
INTRODUÇÃO
Pessoa Jr, A. Kilikian, B.V. (2005). Purificação de produtos biotecnológicos. Manole. São Paulo.

20. Separação por membranas em biotecnologia
Caraterísticas dos processos de microfiltração e ultrafiltração.
Vantagens:
- Não requer altas temperaturas;
- sem adição de produtos químicos;
Desvantagem:
- necessidade de pré-tratamento.
Processos Força Motriz
Tamanho
de poro
Aplicações
Microfiltração Pressão (0,1 – 2 bar) 0,1–10 µm Remoção de microrganismos, clarificação
Ultrafiltração Pressão (1 - 7 bar) 1–100 nm Concentração de macromoléculas
Mulder, M. (1996). Basic Principles of Membrane Technology. 2.ed. Kluwer Academic Publishers, USA.
Habert, A.C. e t al (2006) Processos de Separação com Membranas. Rio de Janeiro: E-papers.
INTRODUÇÃO

21. Formulação das preparações enzimáticas
Extrato enzimático concentrado Aditivos
INTRODUÇÃO
Influência do glicerol na estrutura e na estabilidade das enzimas: hidratação preferencial em torno da
superfície da enzima promove compactação e aumenta a estabilidade da estrutura.
Kumar & Venkatesu, (2012) Chem. Rev. 112: 4283-4307.
Evitar crescimento microbiano e conservar a
atividade ao longo do período de estocagem