O documento descreve as etapas de purificação de produtos biotecnológicos, incluindo clarificação, rompimento celular, purificação e tratamentos finais. As técnicas de rompimento celular incluem métodos mecânicos, não mecânicos, químicos e enzimáticos. A separação de células e produtos é realizada por filtração, centrifugação e membranas.

1. Separação de purificação de produtos biotecnológicos
1. Introdução
As biomoléculas de interesse podem ser ácidos orgânicos, antibióticos,
polissacarídeos, hormônios, aminoácidos, peptídeos e proteínas.
Etapas:
1) Clarificação: separação das células e seus fragmentos do meio de cultivo. A
remoção de sólidos suspensos, constituídos de células integras e seus
fragmentos, reduz a turbines do meio. Pode ser feita: Centrifugação, Filtração,
Filtração tangencial, Floculação.
2) Rompimento celular: quando o produto está dentro da célula. A molécula alvo
é liberada com todas as moléculas intracelulares. Homogeinização, Ultra- som,
Moinho de bolas, rompimento químico ou enzimático
3) Purificação de baixa resolução: separação da molécula alvo de moléculas com
características muito diferentes (água, íon, ácidos nucléicos, lipídeos).
Purificação de alta resolução compreende a separação de classes de moléculas
com características físico- químicas semelhantes (como outras proteínas).
4) Tratamentos finais: Há produtos cuja aplicação não requer elevado grau de
pureza, de modo que operações cromatográficas não são necessárias, e a
simples concentração do meio é suficiente.
O aumento no numero de etapas do processo de purificação, assim como o
rendimento de cada etapa, influencia no rendimento do produto final
2. Rompimento celular
Com os avanços das técnicas de recombinação de DNA, varias moléculas
intracelulares tem sido sintetizada a partir de procariotos e eucariotos. Considerações:
tamanho da célula, tolerância a tensões de cisalhamento, necessidade de controle de
temperatura, custo e rendimento do processo.
Células envolvidas só por membranas celulares, como células de animais, são
frágeis e rompidas facilmente sob baixas tensões. Além de poderem ser rompidas por
variação da pressão osmótica do meio, adição de detergentes ou aplicação de ultra
som. Por outro lado, há células com parede celular robusta, caso das microbianas e o
rompimento é mais difícil. As bactérias gram positivas possuem parede mais rígida que
as gram negativas. Leveduras possuem paredes celulares ainda mais rígidas.
Os métodos de rompimento podem ser mecânicos (Homogeinizador de alta
pressão, moinho de bolas, prensa francesa e ultra- som) , não mecânimos (choque
osmótico, congelamento e descongelamento, aquecimento, secagem) , químicos (
álcalis, solventes, detergentes, ácidos) e enzimáticos (lise enzimática, inibição da

2. síntese da parede celular). A parede celular pode ser completamente rompida ou o
suficiente para liberar a molécula alvo. Após o rompimento os compostos indesejados
(biomoléculas e fragmentos celulares) devem ser removidos por processos de filtração,
centrifugação, precipitação ou extração liquido- liquido.
2.1 Rompimento mecânico (Prensa Francesa)
2.1.1 Homogenizador a alta pressão (Prensa Francesa)
Homogeinizador a alta pressão: constituído de pistões projetados para aplicações a
altas pressões, forçando a passagem da suspensão celular por um orifício estreito
seguida da colisão com uma superfície rígida e imóvel em uma câmera a alta pressão.
A redução instantânea da pressão e o impacto provocam o rompimento celular sem
danificar células. Esses equipamentos são indicados para romper bactérias e leveduras,
e não para fungos filamentosos (bloqueiam a válvula de descarga). Porém esse tipo de
rompimento causa o aumento da temperatura do meio e por isso, o equipamento
deve ter um sistema de refrigeração, principalmente quando a molécula é
termosensível. A quantidade de células rompidas é proporcional a pressão de
alimentação (5000 a 20000 psi). Para aumentar a eficiência pode- se recircular o
material (aumenta o custo, gera fragmentos bem menores, pode- se degradar a
molécula).
As condições de crescimento influenciam a eficiência. Células E. Coli cultivadas em
meio sintético são rompidas em condições mais brandas do que as cultivadas em meio
complexo (pode oferecer nutrientes essenciais para a síntese da parede celular).
Crescimento rápido (µ alto) gera células com paredes celulares menos robustas.
2.1.2 Moinho de bolas
É constituído por uma câmera cilíndrica fechada, horizontal ou vertical, um sistema
de refrigeração e um eixo que gira em alta rotação. Nessa câmera são adicionados
esferas de vidro e células em suspensão. Ocorre atrito entre esferas e as células o que
causa o rompimento celular. As condições de rompimento são facilmente controláveis
e a eficiência depende:
i) da geometria da câmera: câmeras horizontais proporcionam maior
eficiência;
ii) da velocidade: quanto maior a velocidade mais rápido é o rompimento;
iii) do tipo de agitador: o que transfere mais energia é o mais eficiente;
iv) do tamanho das esferas: bactérias requerem 0,1mm e leveduras 0,5mm.
Quanto menor o diâmetro melhor a eficiência;
v) da carga das esferas: as esferas devem ocupar de 80 a 85% do volume da
câmera horizontal e 50 a 60% do volume da câmera vertical. Carga muito

3. pequena não proporciona colisão e carga muito grande faz que esferas
colidam com esferas;
vi) da concentração celular: 30 a 50% do volume da câmera;
vii) da velocidade de alimentação: a fração de células rompidas diminui com o
fluxo de alimentação, pois diminui o tempo de residência no rompedor;
viii) da temperatura: recomenda- se o rompimento entre 5 e 15 graus, para os
moinhos de bolas devem possuir mantas de resfriamento
2.1.3 Ultra- som
O rompimento por ultra- som ocorre quando ondas sonoras são convertidas em
vibrações em um meio liquido, gerando bolhas pequenas, as quais entram em colapso
com o passar do tempo, gerando impacto e rompimento celular. Método muito
utilizado em escala de laboratório e inviável em grande escala. A energia ultra- sônica é
gerada por um aparelho chamado sonicador e transmitida por uma sonda. O aumento
da temperatura deve ser controlado.
2.2 Rompimento não mecânico
Choque osmótico, congelamento/ descongelamento, termólise
2.2.1 Choque osmótico
Para o rompimento celular em meio com alta pressão osmótica, as células devem
ser mantidas por 30 min em meio cuja concentração de sacarose seja de 20%,
separadas por centrifugação e ressuspendidas em água destilada a 4 graus. O choque
não rompe a célula integralmente mas propicia uma permeabilidade seletiva, onde
algumas proteínas podem ser liberadas para fora da célula. Essa técnica reduz a
quantidade de contaminantes para ser retirado em técnicas posteriores. Muito
indicado para gram- negativas (parede celular mais sensível).
2.2.2 Congelamento/ descongelamento
A célula passa por repetidos ciclos de congelamento e descongelamento, com isso,
há formação de grandes cristais de gelo que perfuram a célula e liberam a molécula
alvo. Indicado para rompimento de patógenos. Não indicado para a obtenção de
biomoléculas sensíveis. Estoca- se células a -27 graus por 7 dias (demorado).
2.2.3 Termólise
A suspensão celular pode ser aquecida em banho termostatizado, com injeção de
vapor direto. Processo amplamente utilizado em larga escala, para o rompimento de
algas, fungos filamentosos, leveduras e bactérias.
2.3 Rompimento químico

4. 2.3.1 Álcalis
Rompimento celular com adição de álcalis (Amonia e hidróxido de sódio) é
recomendado quando a biomolécula alvo é estável a pH básico. Geram poluentes.
Ajusta- se o pH básico e depois de um tempo reduz o pH para ácido e centrifuga o
homogeinizado.
2.3.2 Detergentes
Os detergentes dissociam proteínas e lipoproteínas das paredes celulares,
provocando poros ( ou rompendo toda a camada) por onde a molécula alvo é liberada.
Ex: SDS. Desvantagem: podem formar espumas que desnaturam proteínas.
2.3.3 Solventes
Solventes podem ser utilizados como desidratantes químicos das células. Podem
ser etanol, metanol, acetona. A proteína sai junto com a água de dentro da célula?
2.3.4 Lise enzimática
As enzimas são capazes de hidrolisar as paredes de células microbianas (substrato
das enzimas). Esse método de rompimento é utilizado quando a molécula alvo é
sensível a temperatura, tensão de cisalhamento, pressão gerada pelos métodos
mecânicos. Fatores que devem ser considerados: se há presença de inibidores, se há
possibilidade de fazer reciclo da enzima e a resistência da enzima ao tratamento
macanico (caso em que a lise enzimática se associada com rompimento mecânico).
Variáveis como pH, temp, concentração celular etc devem ser observados. Grande
vantagem: alta especificidade para degradação da parede celular e associação com
métodos mecânicos. Enzimas específicas podem ser usadas para liberar moléculas de
interesse. Uma desvantagem pode ser o custo da enzima, além da variação do estado
fisiológico do microrganismo que interfere na eficiência do rompimento.
2.4 Preservação da biomolécula alvo
A molécula alvo deve ficar ativa, portanto deve- se adicionar inibidores de
proteases para impedir a degradação da molécula alvo. Além disso, a liberação de
ácido nucléicos e proteínas estruturais aumentam a viscosidade do meio, por isso,
adição de nucleases e proteases e alteração no pH podem melhorar as características
do meio, desde que não destruam a molécula de interesse.
3. Filtração e Centrifugação
A clarificação, processo de separação das células e seus fragmentos do meio de
cultivo, pode ser realizada por filtração convencional, a centrifugação e separação por
membranas.

5. 3.1 Filtração
A filtração convencional aplica-se a grandes volumes de suspensões diluídas de
células. Bolores são separados normalmente por filtração, pois possuem baixa
densidade o que impede a “descida” na centrifugação. O processo de filtração é
descrito pela Lei de Darcy:
V= kΔP/ µl, onde v é velocidade superficial, k é permeabilidade do leito, ΔP
diferença de pressão, µ é viscosidade do liquido e l é espessura do leito.
Auxiliares de filtração atuam reduzindo a compressibilidade e a compactação da
torta de filtro, aumentando a permeabilidade do leito. Normalmente usa- se perlita ou
terra diatomácea (plantas aquáticas sedimentadas), que podem ser adicionadas à
suspensão inicial ou depositada como uma fina camada no meio filtrante. Esses
auxiliares reduzem o entupimento do filtro devido a penetração de células e de
fragmentos de células nos poros. Os poros tem diâmetro de 10 a 1000µm, e o
diâmetro de bactérias e fungos é de menos de 10µm, ou seja, não é necessário adição
de auxiliares de filtração para esses organismos. Não podem ser adicionados quando
se deseja obter um produto intracelular. Pq?
Desvantagens: a molécula alvo pode se ligar irreversivelmente ao auxiliar, o tempo
de filtração aumenta (pois a viscosidade aumenta).
Ex: Filtro rotativo a vácuo
3.2 Centrifugação
No processo de centrifugação células em suspensão em um meio líquido
sedimentam por ação da gravidade. Muito utilizada para bactérias e leveduras (na
filtração podem causar entupimento). Para se fazer ampliação de escala deve- se
manter o produto Fc*t (força * tempo).
Auxiliares de centrifugação podem ajudar na agregação das células microbianas
com base nas características iônicas da superfície, aumentando a densidade dos
sólidos suspensos, o que resulta em uma maior velocidade de centrifugação. Esse
processo pode ser obtido por ajuste de pH (reduz a carga superficial das células
resultando em partículas maiores e mais densas) ou adição de eletrólitos (reduz a
repulsão eletrostática entre as células favorecendo a reunião delas) à suspensão.
4. Separação por membranas
Os produtos obtidos e desejáveis dos mostos fermentados muitas vezes se
encontram em baixas concentrações. Além disso, os mostos apresentam diversas

6. moléculas como sólidos suspensos ou coloidais, fragmentos de microrganismos e de
células, solutos extracelulares (proteínas, Ac. nucléicos, etc) e produtos do
metabolismo da célula (ácidos orgânicos, antibiotiocos) além dos diferentes nutrientes
presentes no meio (sais, açucares). As dimensões dessas substancias variam de
nanômetros para milímetros. Portanto, processos de separação por membranas tende
separar os produtos biotecnológicos.
A aplicação mais imediata de membranas em processos biotecnológicos é o
processo do mosto fermentado, tanto para recuperar células quanto para obtenção de
mosto clarificado. Assim, quando o produto de interesse é a célula ou um produto
intracelular, como uma proteína, a separação das células do meio de fermentação
pode corresponder à primeira etapa de recuperação do produto, seguida de uma
lavagem e purificação da proteína. Os processos de microfiltração, ultrafiltração ,
nanofiltração e a osmose reversa são soluções para esse tipo de separação, uma vez
que são processos de baixo consumo energético e eliminam custos de armazenamento
e do tratamento do auxiliar de filtração (serio problema enfrentado por industrias que
ainda usam filtros rotativos).
A grande vantagem dos processos de separação por membranas vem sido
adotadas com o objetivo de melhorar a eficiência dos processos bioquímicos, seja pela
esterilização continua do meio de cultura e do ar na alimentação, seja pela remoção
continua dos produtos, nos chamados biorreatores à membrana , ou seja, a reação e a
separação ocorrem simultaneamente. Outras vantagens são: economia de energia,
especificidade, separação de termolábeis (sempre a T ambiente), facilidade de
operação e de amplificação de escala.
Existem membrana sintéticas e inorgânicas, podendo ser densas ou porosas. Os
parâmetros das membranas porosas são distribuição de tamanho dos poros,
porosidade superficial e espessura. Os parâmetros para as membranas densas são as
características físico-químicas do polímero usado e a espessura do filme polimérico.
Ambas levam em consideração a permeabilidade a gases e líquido e a capacidade
seletiva. A força que move as moléculas através da membrana são:
µ = diferença de potencial químico, diferença de concentração (c) e diferença de
pressão(p, pi)
E = diferença de potencial elétrico
Nos processos que envolvem membranas porosas a capacidade seletiva está
relacionada ao tamanho do poro e das especies presentes. Ex: microfiltração,
ultrafiltração, nanofiltração e diálise. Nos processos que envolvem membranas densas
a capacidade seletiva depende da afinidade das diferentes espécies com o material da
membrana e da difusão destas pelo filme polimérico. EX: osmose inversa,
pervaporação, permeação de gases.

7. 4.1 Filtração tangencial
Na filtração tangencial , a solução de alimentação escoa em paralelo à superfície da
membrana, enquanto o permeado é transportado transversalmente a esta. A
polarização é menor do que na filtração convencional, e o seu efeito é ainda
dimunuido com o aumento da velocidade de escoalmente da alimentação.
O coeficiente de rejeição R mede a capacidade seletiva da membrana:
R=1-Cp/Co onde Cp é a concentração da espécie no permeado e Co é a
concentração da espécie na alimentação.
Se R = 0, Cp= Co, a membrana não apresenta nenhuma capacidade seletiva para a
espécie, toda a espécie está passando.
Se R=1, Cp=0, a espécie não está presente no permeado, a membrana é seletiva
para a espécie.
4.2 Microfiltração
i) Poros 0,05 e 5µm;
ii) Filtra partículas em suspensão ar/ aquoso;
iii) Permeável aos compostos solúvel;
iv) Filtração estéril de ar e líquidos.
4.3 Ultrafiltração
i) Poros 1 a 500nm;
ii) Retém macromoléculas em solução;
iii) Caracterizada por massa molar limite (o limite de retenção de uma
membrana de filtração é definido como o valor da massa molar de uma
macromolécula rejeitada pela membrana);
4.4 Nanofiltração
i) 300 e 2000 Da
ii) Obtenção de água potável
iii) Concentração de antibióticos a partir de mostos fermentados
4.5 Osmose inversa
i) Membrana é permeável apenas ao solvente ( anisotrópica densa)
ii) Dessalinização de águas marinhas e salobras
iii) Concentração de suco de frutas e antibióticos

8. 4.6 Diafiltração
É um modo alternativo de operar sistemas de micro, ultra e nanofiltração e mesmo
osmose inversa. Um processo de purificação a volume constante. A operação consiste
em adicionar, continuamente, solvente puro ou solução tampão, em vazão equivalente
a vazão do permeado que sai do sistema. Dessa forma se elimina componentes de
menor tamanho ou de menor massa molar.
4.7 Fluxo do permeado, polarização de concentração e fouling
O fluxo do permeado depende da permeabilidade da membrana, a medida que o
tempo passa vai ocorrendo o fenômeno de polarização de concentração, em que a
membrana se torna cada vez mais impermeável. A limpeza da membrana cessa esse
fenômeno. O processo de fouling é quando ocorre possíveis alterações nas membranas
provocadas pelas espécies químicas presentes na solução. Essas alterações podem ser
parcialmente ou totalmente irreversíveis: adsorção, entupimento de poros por
moléculas ou partículas em suspensão e depósito na superfície da membrana de
espécies presentes (macromoléculas ou sais). O fluxo é dado por:
J=∆P/ Rt Rt=Rm+Ra+Rb+ Rg+Rpc
Onde: Rm=resistência da membrana, Ra = adsorção, Rb = bloqueio dos poros, Rg =
camada de gel, Rpc=polarização da concentração.
5. Precipitação
Precipitados de proteínas são agregados de proteínas insolúveis grandes o
suficiente para serem observados a olho nu e sedimentam sob valor de força
centrífuga relativamente baixa. Em alguns casos a precipitação pode atuar como etapa
única de purificação dependendo do grau de pureza desejado. Precipitação é
facilmente adaptada para larga escala, pode- se realizar o processo de maneira
continua e a disposição de precipitantes é muito grande, sendo que muitos deles são
de baixo custo. Uma das maneiras de se precipitar proteínas é reduzir a sua
solubilidade da proteína por alterações no solvente, por exemplo, pela adição de sais
como sulfato de amônio, solventes orgânicos (etanol, éter, acetona). Outra maneira é
diminuir a solubilidade da proteína por alteração na própria proteína, como a mudança
de carga por adição de ácidos, bases, precipitantes catiônicos ou aniônicos.
5.1 Principios de solubilidade
A solubilidade de uma proteína é favorecida quando as interações entre as
moléculas de soluto são repulsivas e as interações do soluto com as moléculas do
solvente são atrativas. Com isso, uma molécula pode se tornar insolúvel por qualquer
perturbação que resulte em diminuição das forças atrativas com o solvente, ou então,

9. em um aumento com as interações atrativas entre as moléculas de soluto. De modo
geral o solvente é sempre aquoso e as propriedades do meio podem ser alteradas por
mudanças na força iônica, no pH, na adição de solventes orgânicos combinados com
variação na temperatura, que causam alteração na solubilidade da proteína. A
solubilidade de proteínas é influenciada pela temperatura. Todas as formas de
interações não covalentes, com exceção das hidrofóbicas são inversamente
proporcionais a temperatura. As forças das interações hidrofóbicas aumentam com a
temperatura.
A desnaturação de uma proteína compreende a perda da estrutura terciária e a
formação de cadeias polipeptídicas ao acaso. Em solução essas cadeias polipeptídicas
se misturam e formam agregados reunidos físico ou ainda, quimicamente, por ligações
dissulfeto. A solubilidade é reduzida em virtude da exposição de resíduos hidrofóbicos
internos. A simples remoção do desnaturante não garante a reconformação adequada
da molécula. Porém a aplicação da precipitação só é viável quando a conformação
adequada da proteína é recuperada após o processo, uma vez que sua função deve ser
mantida
A precipitação de produtos microbianos é um dos métodos mais tradicionais de
concentração e purificação. Porém, não proporciona elevada capacidade de
purificação quando a operação é conduzida em apenas uma etapa. Dessa forma, a
precipitação é normalmente empregada nas etapas iniciais do processo. Além disso, a
solubilização de proteína precipitadas pode ser dimensionada de modo a reduzir o
volume inicial, e portanto, aumentar a concentração. Portanto, a precipitação pode
preceder processos de alta resolução como a cromatografia.
Em solução aquosa a precipitação pode ocorrer com o aumento (salting out) ou
diminuição (salting in) da concentração de sais, com adição de solventes orgânicos,
polieletrólitos, polímeros não iônicos, calor e ajuste de pH.
5.2 Precipitação por sais
A precipitação por sais ocorre por neutralização das cargas superficiais da proteína
e redução da camada de hidratação, favorecendo a agregação de resíduos
hidrofóbicos. A adição de concentrações de sal (salting out) resulta em aprisionamento
da moléculas de água pela solvatação dos íons , dessa forma, as regiões hidrofóbicas
da proteína ficam expostas e elas interagem e agregam entre si. Imagine uma solução
aquosa de proteína à qual foi adicionada uma certa quantidade de sal neutro. A água,
que apresenta um grande poder de solvatação, passa a interagir com as duas espécies:
as proteínas e os íons provenientes da dissociação do sal. Porém, as moléculas de água
apresentam maior tendência de solvatação de partículas menores (nesse caso, os
íons). As moléculas de água, ocupadas em sua interação com os íons, "abandonam" a
estrutura protéica. Como conseqüência, temos: maior interação proteína-proteína,

10. diminuição da solubilidade em meio aquoso e, conseqüentemente, precipitação da
proteína. O aumento ta temperatura favorece a precipitação de proteínas por salting
out, mas o processo é conduzido normalmente a 4 graus para evitar a desnaturação.
Quando adicionamos pequenas quantidades de sal a uma solução contendo
proteínas, as cargas provenientes da dissociação do sal passam a interagir com as
moléculas protéicas, diminuindo a interação entre elas. Conseqüentemente, temos um
aumento da solubilidade da proteína no meio aquoso. A esse fenômeno dá-se o nome
de "salting-in". Em baixas concentrações de sais (baixa força iônica), a solubilidade em
geral aumenta, pois os íons salinos tendem a se associar às proteínas contribuindo
para uma hidratação e/ou repulsão entre as moléculas, aumentando a solubilidade
“salting in”.
5.3 Precipitação por solventes orgânicos
A solubilidade de proteínas em solventes orgânicos varia de acordo com as
distribuições dos resíduos hidrofóbicos e hidrofílicos na superfície da molécula. Esses
grupamentos interagem com íons, outras proteínas e moléculas de solventes de forma
a controlar a transferência da proteína alvo para a fase sólida (precipitado) ou para a
fase liquida (sobrenadante).
Alcoóis, acetona, ésteres são utilizados para precipitar proteínas desde 1907,
porém desconhecia- se o efeito desnaturante desses solventes. Normalmente deve- se
realizar o processo a baixas temperaturas para evitar esse efeito desnaturante. Umas
das vantagens do uso de solventes é sua volatilidade que permite pronta recuperação
e reciclagem ao processo, além de possuir propriedades bactericidas. Os solventes
podem ser removidos facilmente do precipitado, por secagem a vácuo em baixa
temperatura.
O solvente usado deve ser totalmente solúvel em água, não reagir de modo direto
com a proteína e ter um forte efeito precipitante. Quanto maior a cadeia alifática
maior a desnaturação. A adição de solventes orgânicos causa geração de calor e por
isso, deve ser lenta e sob resfriamento. A precipitação de proteínas de caráter ácido
pode ser melhorada pela adição de íons metálicos bivalentes , como o cálcio e o
magnésio que formam complexos com a proteína reduzindo a carga global e
favorecendo a agregação. Cátios como Zn e Ca formam complexos com as proteínas,
recurso usado para precipitar proteínas muito solúveis em solventes orgânicos. O pH
em torno do PI pode favorecer a precipitação, reduzindo a concentração de solvente
necessária. Em valores de pH maiores ou menores que o PI os parâmetros polares das
proteínas ficam maiores e então essas biomoléculas tendem a ficar mais solúveis,
mesmo que relativamente desidratadas, devido as forças de repulsão.
5.4 Precipitação por polímeros

11. 5.4.1 Polietileno glicol
Polietireno glicol (PEG) é um polímero de alta massa molar, neutro e miscível com
água, disponível em altos graus de polimerização. As precipitações são conduzidas em
baixas concentrações de PEG, faixa na qual as soluções não são muito viscosas e
muitas proteínas precipitam. A operação é realizada sem resfriamento. O mecanismo
de precipitação é entendido como de exclusão da proteína do meio aquoso. A
concentração de PEG necessária depende do tamanho da proteína e da massa molar
do polímero e é inversamente proporcional a concentração de proteína. O PEG pode
ser removido por métodos de ultrafiltração, adição de etanol.
5.4.2 Polieletrolitos
Os polieletrólitos são polímeros iônicos solúveis em água que tem sido utilizado
devido a seu baixo custo e a redução de resíduos, uma vez que a precipitação ocorre
em baixas concentrações. Os mais usados são o PEI e PAA. O uso de polieletrólitos é
restrito pois a proteína e o polímero devem ter cargas opostas. Por isso, deve- se
operar longe do PI da proteína.
5.5 Precipitação pela temperatura
A variação da temperatura causa precipitação da proteína de duas formas: 1) sua
diminuição provoca redução na solubilidade de proteínas e sais; 2) seu aumento causa
desnaturação de proteínas (perdendo sua estrutura terciaria e expondo os grupos
hidrofóbicos para formar grupos insolúveis).
5.6 Precipitação isoelétrica
A precipitação isoelétrica resulta na atração eletrostática das proteínas quando
estas se encontram próximas do ponto isoelétrico, pois a repulsão eletrostática entre
as moléculas é mínima. É um dos métodos mais simples executado simplesmente pelo
ajuste do pH próximos ao PI. Quando os valores de pH do meio estão acima do PI da
proteína, a superfície está com carga negativa, ocorrendo repulsão eletrostática; o
mesmo ocorre quando o pH do meio está abaixo do PI da proteína, a superfície está
com carga positiva, ocorrendo repulsão entre as moléculas.
A precipitação isoelétrica é mais expressiva para proteínas com baixa constante de
hidratação ou com alta superfície hidrofóbica, como globulina e caseína, que formam
agregados grandes. Proteínas hidrofílicas têm solubilidade grande no seu ponto
isoelétrico, e dificilmente precipitam pelo ajuste do pH.
Para ajustar o pH são utilizados ácidos relativamente baratos, mas que podem
desnaturar irreversivelmente proteínas. Isso pode ser evitado pelo uso de ácidos com
íons estabilizantes, como acetato ou sulfato.

12. 5.7 Precipitação por afinidade
Métodos de afinidades são definidos como procedimentos que fazem usos de uma
interação especifica e seletiva com um ligante, geralmente um substrato ou um
inibidor se a proteína é um enzima. A precipitação por afinidade por ocorrer de duas
formas: na primeira pela ligação cruzada de proteínas com ligantes, geralmente
corantes, com formação de um reticulo tridimensional; na segunda pela diminuição da
solubilidade de um polímero que possui um ligante de afinidade, reversivelmente
solúvel –insoluvel, por variação no pH, temperatura, concentração de sal ou adição de
íons metálicos.
5.8 Precipitação por íons metálicos
Alguns íons monovalentes podem ser suficientes para a precipitação de proteínas,
e são divididos em três grupos: 1) Mn, Fe, Co, Cu, Zn, Cd (todos 2+), se ligam
fortemente aos ácidos carboxílicos ou a compostos nitrogenador. 2) Ca, Ba, Mg, Pb
(todos 2+), se ligam apenas a ácidos carboxílicos e 3) Ag e Hg que se ligam fortemente
ao grupo suforil.
6. Extração líquido- líquido (SDFA)
Esse método se baseia na extração de biomoléculas em sistemas de duas fases
líquidas imiscíveis, constituídas de uma fase aquosa e um solvente orgânico. A
extração em SDFA é aplicada a purificação de produtos obtidos em células animais,
vegetais e microbianas, extração de vírus, organelas e ácidos nucléicos e enzimas. Para
produtos que exigem alto grau de pureza a extração em SDFA não é suficiente e nesses
casos deve ser sucedida por uma ou mais etapas cromatográficas.
A separação entre a molécula a ser purificada e os contaminantes decorre das
diferentes solubilidades apresentadas por esses solutos em cada uma das fases
aquosas. Esses sistemas são formados pela reunião de determinados polímeros,
polieletrólitos, ou ainda, polímeros em combinação com solutos de baixa massa molar,
em uma mesma solução formando quatro grupos. Em um primeiro grupo podem ser
considerados os sistemas formados por dois polímeros não iônicos (PEG/dextrana). Em
um segundo grupo tem-se um polieletrólito e um polímero não iônico (sulfato
dextrana de sódio/polipropileno glicol). O terceiro grupo constitui 2 polieletrólitos
(sulfato dextrana de sódio/carboximetilextrana de sódio). O quarto grupo contitui um
polímero não iônico e um composto de baixa massa molar (PPG/fosfato de sódio). Os
sistemas mais usados são os que possuem dextrana em uma das fases a qual fica no
fundo, enquanto o outro polímero se concentra no topo. Quando do emprego de sais
estes se concentram no fundo enquanto o polímero se apresenta no topo. Ambas as
fases, no entanto, apresentam os dois componentes, uma vez que se estabelece o
equilíbrio entre elas.

13. 6.1 Curva de equilíbrio
O eixo y representa a composição em massa da molécula que apresenta maior
concentração na fase de topo e o eixo x representa a composição da molécula de
maior concentração na fase de fundo. Composições representadas por pontos acima
da curva levam a formação de duas fases e, abaixo da curva, de uma fase só. A
formação do SDFA depende, portanto, da concentração dos componentes do sistema.
Os principais fatores que influenciam a posição do equilíbrio em um SDFA são a
massa molar, o tipo de sal e a concentração dos componentes.
O coeficiente de partição K é uma grandeza adimensional que representa a relação
entre as concentrações da molécula de interesse na fase de topo e na fase de fundo,
no equilíbrio:
K= Cti/Cfi onde Cti é a concentração do soluto i na fase e topo e Cfi é a
concentração do soluto i na fase de fundo.
6.2 Montagem do sistema
Coeficientes de partição significativamente distintos para a molécula de interesse e
para as demais moléculas indicam ocorrência de purificação. Quanto maior a
solubilidade dos solutos nas fases maior a concentração nessas fases. Dessa forma,
características físico- químicas das proteínas (hidrofobicidade, carga superficial e
massa molar) e da solulção (pH e força iônica) serão determinantes para o valor de K.
De modo geral, o valor de K diminui com o aumento da massa molar da proteína. As
características hidrofóbicas acentuarão o grau de separação e o aumento da pureza.
A diversidade de variáveis que influem no coeficiente de partição das biomoléculas
e rendimento da extração sugere a adequação do emprego das técnicas de
planejamento estatístico do experimento. Assim, por um moderado numero de
experimentos podem ser testados diferentes sistemas quanto ao tipo de componentes
formadores de fases, a massa molar do polímero, e o pH. Os experimentos são
preparados a partir de soluções estoque, normalmente 50% (em massa) para a solução
de PEG, 40% para os sais e 20 a 30% para a dextrana. Essas soluções são pesadas na
quantidade necessária para se obter a concentração desejada no sistema. A ordem de
adição dos componentes devido as suas densidades é: solução de Dx ou solução de
PEG, solução de sal e água. Como a temperatura afeta a formação do sistema de fases
é necessário que as soluções estoque já estejam na temperatura de trabalho antes do
preparo do sistema. Depois de preparado o sistema, ele deve ser agitado e em seguida
deixado em repouso para atingir o equilíbrio. A separação das fases pode ser acelerada
por centrifugação (3 a 5 min).
6.3 Extração repetida e clarificação

14. A aplicação repetida é importante para a purificação da proteína. Na primeira
aplicação, caso a proteína migre para a fase de topo e alguns contaminantes para a
fase de fundo, adiciona- se uma solução à fase da molécula alvo tal que se forma uma
nova fase inferior, que resulte em aumento da pureza adicional em relação a primeira
etapa. Essa estratégia é muito utilizada para purificação de meios complexos.
6.4 Reciclagem de polimeros e sais
A reciclagem é necessária para a redução do custo do processo e dos danos
causados do descarte dos sais empregados. Quando a fase de topo contem a molécula
alvo é possível recuperar o polímero pela indução de formação de uma nova fase de
fundo, na qual a molécula apresente maior solubilidade. Haverá, todavia, perda da
molécula de interesse, dado que existe uma distribuição entre as fases. Pode – se
também separar o polímero em relação aos demais solutos, por meio de cromatografia
de exclusão molecular ou ultrafiltração, ou ainda, pela precipitação da molécula alvo
ou com condições salinas desde que o polímero não precipite. A reciclagem do sal
também possível por precipitação; pode- se resfriar a fase salina até que o sal
precipite.
6.5 Extração baseada em afinidade
Para se aumentar o valor de K pode- se utilizar interações por afinidade. O ligante é
acoplado por ligação covalente ao polímero. O aumento da partição pela introdução
de um ligante acoplado ao polímero é descrito pelo parâmetro Kf:
Kf= K(peg ligante)/K (peg sem ligante) em que Kf= (KL)n
, onde KL é o coeficiente de
partição do ligante livre e N é o número de sítios de ligação disponíveis no ligante
O rendimento teórico de uma molécula alvo extraída na fase superior (Vs) ou na
fase inferior (Vl) e em uma única etapa pode ser calculado por:
R (%)= 100/(1+ Vl(VVs* K))
O ligante pode ser uma substancia natutal (caros e desnaturam rapidamente) ou
uma substancia sintetizada. Ex: ligantes hidrofóbicos, tiofilicos, metais, corantes,
ácidos graxos, inibidores, anticorpos monoclonais,entre outros. A escolha do ligante
deve levar em consideração:
i) A constante de dissociação produto-ligante deve ser menor que 10-3M;
ii) Ligante deve ser estável e especifico para a molécula alvo;
iii) Ligante não pode ser tóxico, deve ser barato e disponível em grandes
quantidades.
Para a recuperação do polímero depois da extração é necessário inicialmente
desfazer a interação entre o ligante e a molécula. Em geral são utilizados moléculas

15. que competem com o produto pelo ligante ou com o ligante pelo produto. Muitas
interações especificas podem ser rompidas por alteração de pH, porém deve- se estar
atento à eventuais mudanças no produto biológico. A seguir deve- se reciclar o
polímero para posterior utilização. Há várias técnicas. O PEG pode ser reciclado por
extração com solventes orgânicos (etanol, clorofórmio), terminar!
7. Introdução à Cromatografia
As operações cromatográficas tem como objetivo isolar e purificar o metabólito de
interesse em relação aos demais, levando- o a pureza adequada a seu uso. A redução
do volume do meio original é relevante para a economia do processo, pois os métodos
cromatográficos, são na maioria, baseados em fenômenos adsortivos e assim, lentos e
dependentes de investimentos em materiais adsorventes.
A cromatrografia pode ser liquida ou gasosa. Na cromatografia liquida, ao solutos
são retidos em um leito de material poroso, por meio de fenômenos de adsorção
(química ou física), partição ou exclusão molecular. A fase estacionaria pode ser
constituída por sílica porosa, polímeros orgânicos sintéticos, polímeros de
carboidratos. Esses últimos se apresentam em partículas esféricas pequenas
embebidas no solvente, o qual constitui maior parte da fase estacionaria, denominada
gel. A posterior remoção gradual dos diferentes solutos se da por ação de uma fase
liquida eluente, a qual resulta na separação dos diferentes componentes do meio. A
ordem de grandeza da pressão aplicada interfere na resolução da separação dos
solutos. Assim, a pressão baixa, média e alta associa- se a denominação baixa
eficiência, media eficiência e alta eficiência (HPLC). Um sistema cromatográfico deve
conter também um detector o qual registra a presença de solutos no fluxo de saída.
Esse detector deve ser sensível a molécula alvo. Assim, proteínas, aminoácidos,
policetideos, lipídeos e outros são detectados por medidas da absorbância (UV) em
comprimento de onda definidos (ligações peptidicas são detectadas em 215nm
enquanto aminoácidos em 280nm). Um aumento na eficiência de detecção pode ser
alcançado pelo uso de detectores na absorção baseados na absorção por
fluorescência.
Existem diferentes tipos de cromatografias, dentre eles cromatografia de exclusão
molecular, baseada na separação de moléculas em função da massa molar e/ou do
volume efetivo da solução; cromatografias de troca iônica, interação hidrofóbica,
afinidade e imunoafinidade, nas quais ocorrem adsorção de diferentes moléculas
sobre a matriz e em seguida, desorção para a separação das moléculas.
Um cromatograma é um gráfico que indica a presença dos diferentes solutos
presentes no eluente que sai da coluna (eixo y), em função do tempo e do volume de
eluente que passou pela coluna (eixo x). A presença de solutos é detectada por
medidas de absorbância ou por indica de refração. O volume que passa pela coluna até

16. o instante de saída de uma certa molécula é o volume de retenção especifico daquela
molécula (Vr). Alternativamente, emprega- se o tempo de retenção, tr. O ponto mais
alto das curvas correponde ao instante de máxima concentração da molécula no
eluente, o qual caracteriza o tr e o Vr. A eficiência da purificação pode ser avaliada de
acordo com o grau de separação das moléculas, denominado Rs. Na separação de duas
moléculas A e B, Rs é determinado por:
Rs= (trb- tra)/ (1/2) * (WbA + WbB), onde WbB é a distancia do pico b.
Para Rs<1 as moléculas são incompletamente separadas, para Rs=1 as curvas se
tocam nas bases e para Rs>1 as moléculas se encontram separadas. Todavia, pode
haver sobreposição de duas moléculas em um mesmo pico, nesse caso embora Rs seja
elevado , a molécula alvo não terá sido purificada.
8. Cromatografia de Exclusão molecular
Uma das características das proteínas é seu tamanho elevado, o que proporciona
um método eficaz para a separação de proteínas de acordo com sua massa molar, por
cromatografia de exclusão molecular, também conhecida como cromatografia em gel.
Assim, uma mistura de proteínas dissolvidas em solução tamponante flui por gravidade
ou com auxilio de bombas, por uma coluna preenchida por esferas microscópicas de
material polimérico poroso , previamente equilibrado e lavado apenas com tampão.
Assim em uma coluna cromatográfica, as moléculas menores são as ultimas a saírem
da coluna. De maneira geral, quanto maior a coluna melhor a resolução, entretanto
isso implica em longo tempo de separação e grande diluição da amostra.
A fase estacionaria utilizada normalmente consiste de géis hidrofílicos reticulados
embebidos para amostras solúveis em solução aquosa, e de matrizes a base de
poliestireno para amostras não aquosas. Diversos fatores devem ser considerados
para a seleção da matriz de gel mais adequado, destacando- se as características da
matriz, como tamanho do poro, diâmetro médio e distribuição de tamanho de
partículas, densidade de empacotamento do gel na coluna, volume da amostra, vazão
do eluente, viscosidade da amostra e do tampão. Matrizes uniformes, com baixa
distribuição de tamanho de partículas, facilitam eluição de moléculas em picos
estreitos. Deve- se também levar em conta , na seleção da fase estacionaria, a
estabilidade da matriz no solvente requerido como fase móvel e as condições de pH,
temperatura e salinidade empregada durante a separação, que devem ser compatíveis
com as propriedades da proteína de interesse. Os materiais empregados nas
cromatografias em gel devem ser inertes em relação a molécula de interesse.
Na cromatografia em gel um outro fator além do tamanho intefere na eluição.
Proteínas delgadas e longas são eluidas antes de proteínas globulares de mesma massa
molar.

17. A alta resolução na cromatografia em gel depende da aplicação de um pequeno
volume de amostra, pois quanto maior esse volume, maior o volume no qual esta será
eluida. Tipicamente, o volume da amostra deve ser de 0,5 a 5 % do volume total do
leito. Volumes menores que 0.5% não se obtem um espalhamento apreciável para o
processo e volumes acima de 5% as moléculas devem ter grande diferença no
tamanho para serem separadas.
A amostra a ser injetada na coluna deve ser previamente clarificada por
centrifugação ou filtração para evitar o deposito de partículas na coluna.
8.1 Curvas de cromatografia em gel
Vt = volume total da coluna (eluição de moléculas menores que os poros)
V0= volume intersticial no meio poroso (eluição de grandes moléculas)
Vs= volume de solvente que cabe dentro fase estacionaria do gel (elui
moleculas intermediarias)
Vs= Vt – V0
8.2 Aplicações de cromatografias de exclusão molecular
- Dessalinização
- Fracionamento de proteinas: Requer uso de gel com propriedades otimas, isto é,
alto volume de poros, poros com estreita distribuição de tamanhos e diâmetros
adequados. Amostras com poucos componentes ou que tenham sido parcialmente
purificadas afim de eliminar componentes do mesmo tamanho apresentam
melhores resultados. A fração eluida no volume vazio apresentara menor fator de
diluição do que as frações finais, que apresentam maior tempo de retenção na
coluna. Deve- se portanto, buscar o menor fator de diluição e o menor tempo
possível.
-Determinaçao de massas molares
-Determinação de tamanho de poros
- Separação empregando princípios mistos
9. Cromatografia de troca-iônica
Trata- se de um método simples, fácil ampliação de escala, alta resolução, alta
capacidade de adsorção e versátil. Na troca iônica há uma etapa de adsorção reversível
de moléculas de solutos eletricamente carregados a grupos com cargas opostas,
imobilizados em matriz sólida. Os solutos adsorvidos são subsequentemente eluidos
após serem trocados por outros íons, com o mesmo tipo de carga, porém com uma
maior afinidade pela fase estacionaria. Portanto, são os diferentes tipos de grau de

18. afinidade eletrostática entre a fase estacionaria e os íons na fase móvel que regem
esse tipo de cromatografia.
Matrizes de troca iônica que conte grupos positivamente carregados são aniônicas,
matrizes catiônicas são negativamente carregadas. Os contra-íons são íons de baixa
massa molar que se ligam a fase estacionaria ou as proteínas solúveis na fase móvel.
Para que a proteína se ligue a fase estacionaria, os contra íons devem ser
eletrolicamente dissociados. Cátions H+ e Na+ são comumento encontrados em
trocados catiônicos e anios Cl- e OH- são os mais utilizados em trocadores aniônicos.
9.1 Escolha da matriz
Alguns critérios importantes devem ser considerados para a escolha da matriz:
i) Alta estabilidade mecânica
ii) Boa estabilidade química: resistente a esterilização e à sanitização
iii) Alta capacidade de adsorção
iv) Tamanho do poro: deve permiti o acesso da biomolécula alvo ao sitio de
adsorção
v) Supericie da matriz: deve minimizar adsorções não especificas que podem
entupir a matriz
vi) Tamanho da partícula
9.1.1 Celulose
Matriz muito hidrofílica, porém instável na presença de ácidos minerais, álcalis e
agentes oxidantes . Operam em faixa de pH e 3 a 10. Sua capacidade de se ligar a
proteínas é alta, porém não é propicia a interações hidrofóbicas ou não- iônicas.
9.1.2 Agarose
É um polissacarídeo natural, complexo, obtido da purificação do Agar. A matriz é
altamente porosa e com mínima adsorção não especifica.
Terminar
Ex de matrizes: celulose, agarose, dextrana e policrilamida.
Os grupos funcionais usados em trocadores podem ser fortes ou fracos,
dependendo dos valores de pKa dos grupos carregados. Os grupos fortes operam em
uma faixa maior de pH do que os grupos fracos. Portanto, na escolha do grupo
funcional o pH é uma variável importante. A fase móvel pode ser constituída por
soluções acidas, básicas ou tampões e adicionadas de sais neutros ou solventes
orgânicos com a finalidade de aumentar a seletividade.