Produção microbiana de óleos e gorduras

Produção
Microbiana
de Óleos e
Gorduras
JéssicadosSantosTavares 71689
JéssicaBeatrizAnastácioJacinto 71865
Margarida Isabel PenedoRodrigues 71808

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INTRODUÇÃO
Perante o tema proposto, “Produção Microbiana de Óleos e Gorduras”, concordámos em
explorá-lo sobre três directrizes orientadoras. Numa fase inicial, concentramo-nos em
entender a razão pela qual surgiu um mercado que prefere usar certos microorganismos
produtores de óleos e gorduras em detrimento dos óleos vegetais. Salientando que, este
mercado ganhou amplitude desde os últimos vinte anos, com a preferência por fungos e
microalgas oleaginosas.
No seguimento desta ideia, surge a necessidade de perceber o metabolismo e a
especificidade bioquímica que justifica a acumulação lipídica em taxas anormais. Por fim,
investigámososmeandrosindustriaissubjacentesaoprocesso. Ou seja, o conjunto de fatores
que permite o aproveitamento deste comportamento a um nível comercial.
Apelamos a uma visão sustentável da exploração microbiana, como alternativa às plantas
transgénicas produtoras de óleos que dominam o mercado.

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Óleos
vegetais
Obtenção de plantas
geneticamente
modificadas para
produção de ácidos
gordos e lípidos com
composição alterada
Óleos a
partir de
sementes
Modificações no
processo de
extração,usando
enzimas
Obtenção de óleos e
gorduras
modificados
geneticamente
Óleos e gorduras
por via microbiana
utilização de:
- enzimas isoladas a partir
de microrganismos (ex:
lipases);
- utilização da célula
microbiana total
Obtenção óleos e
gorduras com
elevado valor
comercial
1.Óleos e Gorduras –Ponto DeVista Químico
Antes de iniciar o desenvolvimento do tema do trabalho, é necessário definir alguns
conceitos chave relativamente aos óleos e gorduras:
 Pertencem ao grupo dos lípidos;
 É um grupo de biomoléculas hidrofóbicas, que serve diferentes propósitos:
componentes estruturais, reservas energéticas, entre outros;
 As gorduras diferem dos óleos num aspeto: os primeiros são sólidos à temperatura
ambiente, enquanto os óleos são líquidos. Partilham a seguinte estrutura molecular:
 Contêm três grupos funcionais éster;
 O grupo maiscomumsão os triacilgliceróis que provêmdareaçãoentre uma molécula
de glicerol e três cadeias de ácidos gordos;
 Nas cadeiasde ácidosgordosa maior parte das ligaçõesentre os carbonossãosimples
mas tambémse encontramligaçõesduplas.Formando,respetivamente,ácidosgordos
saturadose ácidosgordosinsaturados.
2.MICROORGANISMOS UTILIZADOS PARA A PRODUÇÃO DE ÓLEOS EGORDURAS
A Biotecnologia dos lípidos abrange várias áreas, como a modificação genética dos lípidos
presentesemsementese espéciesvegetais,a partir das quais se obtêm óleos e gorduras com
as propriedades desejadas ou, em alternativa, a utilização de microorganismos - leveduras
(fungosunicelulares), fungos (multicelulares), bactérias e microalgas. Podem usar-se células
microbianas na sua totalidade para produção de óleos e gorduras e a sua posterior
transformação, ou apenas enzimas microbianas.
Fig.2 – Várias abordagens à Biotecnologia dos lípidos,com destaque
para o uso de microorganismos para a produção de óleos e
gorduras com elevado valor comercial;
Fig.1. Estrutura molecular genérica dos óleos
e gorduras

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Comofonte natural de óleose gorduras para utilizaçãonaindústria alimentar podem usar-
se plantas (óleo de palma, a partir da espécie Elaeis guineensis; óleo de canola, a partir da
espécie Brassica napus, entre outros) e várias sementes. No entanto, sabe-se que alguns
microorganismos são capazes de produzir lípidos que se assemelham aos óleos de origem
vegetal.
Surge-nos, então, a definição de espécies oleaginosas, que são todas as espécies de
microorganismosemque ototal de lípidospresentesnasuabiomassaexcede os20%.O termo
“single cell oils”-SCO-refere-se aosóleosobtidosapartirdestesmicrorganismos.Actualmente,
os SCO têm várias aplicações biotecnológicas, não só na indústria alimentar, mas também
noutrasáreas (comoé o caso da produção de biodísel). Este conceito, criado em 1974, refere-
se especificamente a óleos e gorduras com cariz industrial.
Existe umaenorme diversidadede microorganismoscomumelevadoteorlipídicooque,do
ponto de vista tecnológico, constitui uma vantagem, podendo-se optar pelo produto mais
adequadoaofimindustrial pretendido.Porexemplo,enquantoleveduras,fungose microalgas
têma capacidade de sintetizartriacilgliceróis,que se assemelhamaoslípidosque compõemos
óleos vegetais, as bactérias produzem lípidos específicos.
Tabela 1. Diversos microorganismos oleaginosos e a percentagem da sua biomassa em conteúdo lipídico;
Organismo % biomassa em conteúdo lipídico
Botryococcus braunii (microalga oleaginosa) 53-70
Rhodosporidium toruloides (levedura oleaginosa) 66
Rhodotorula glutinis(levedura oleaginosa) 72
Aspergilllus terreius (fungo oleaginoso) 57
Navicula pelliculosa (microalga oleaginosa) 22-32
Microrganismo Teor em lípidos (% w/w) Fonte vegetal Teor em lípidos (%

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Tabela 2. Comparação entre o teor em lípidos na biomassa de microorganismos oleaginosos e fontes
vegetais de óleos e gorduras usadas na indústria alimentar;
Na tabela1, realça-se aexistênciade váriosmicroorganismoslipo-acumuladores e verifica-
se que estesapresentampercentagenssignificativasde lípidosnasua biomassa. Desta mesma
tabela,pode concluir-seque estaspercentagensvariamde espécieparaespécie e consoante a
categoria taxonómica. Na tabela 2,por comparação do teor em lípidos de alguns
microrganismosversusalgumasfontesvegetaisusadasnaindústriaalimentar,concluímos que
os primeiros apresentam, em alguns casos, maior percentagem em lípidos que as fontes
vegetais. Este facto enfatiza a possibilidade de utilizar os microorganismos como via
alternativaàproduçãode óleose gorduras.No entanto, para além da percentagem de lípidos
produzida e capacidade de a armazenar, existem outros critérios para avaliar se um
microrganismo tem as características necessárias para ser usado para a produção de óleos
microbianos. Entre estas características encontram-se a qualidade dos óleos e gorduras
produzidos, sendo que a composição química varia com a espécie e com a capacidade de
produção a partir de substratos económicos.
Uma vez que se produzem óleos a partir de outras fontes que não microrganismos será
legítimoperguntaroporquê de existireste ramonaBiotecnologia,quaisasrazões que tornam
a produção de óleos e gorduras por via microbiana uma hipótese a considerar. Como os
microrganismos em geral reúnem um conjunto de características que os tornam uma boa
opção para fazerbiotecnologia,nomeadamente,apresentarem grande variedade metabólica,
reproduçãorápida,produçãode metabolitosque têmaplicabilidade e aindaapossibilidade de
serem alterados por via da engenharia genética.
Algumas das vantagens dos microrganismos oleaginosos em relação ao uso de uma fonte
vegetal:
 são unicelulares e se forem pluricelulares são pouco diferenciados: mais vantajosos
que as plantas, pois são de mais fácil manipulação e crescimento (por exemplo em
bioreatores);
 apresentam metabolismo e absorção de nutrientes mais rápido: torna os processos
mais económicos.
Como exemplo concreto a levedura oleaginosa, Candida Curvatta, produz lípidos que se
assemelhamaóleosobtidosatravésde plantase sementes,aonível dacomposição dos ácidos
w/w)
Lipomyces starkeyi (levedura) 63 amendoim 50
Schizochytrium linacinum
(microalga)
50-77 Sementes de
girassol
45
Mortierella isabellina (fungo) 50 Grãos de soja 20
Rhodotorula glutinis (levedura) 72 côco 50

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gordos e da estrutura do triglicerídeo. Esta espécie até apresenta a vantagem adicional de
crescer num leque variado de meios com diferentes substratos que contenham açúcares
(comoglucose,frutose) e adapta-se bemacrescer em soro de leite coalhado, um subproduto
resultante daindústriadoqueijo.Quandose desenvolve neste meio, pode produzir um lípido
substitutodamanteigade cacau. De um pontode vistabiotecnológico,pode sermaiseficiente
usar uma levedura para produzir um óleo, pois esta tem uma taxa de crescimento rápida.
Neste caso específico, até pode ser utilizado como meio para o seu crescimento um
subproduto doutra indústria, o que traz vantagens em termos ecológicos e económicos.
Tambémcom interesse comercial existem espécies de microalgas e fungos que produzem
grandes quantidades de ácidos gordos das séries ω-3 e ω-6, com importante uso na indústria
alimentar. A produção de ácidos gordos destas séries a partir de microorganismos pode
substituirosde origemvegetal. Porexemplo,asespécies Mucor javanicus (fungo oleaginoso)
e Mortierella isabellina (fungo oleaginoso) são exploradas para a produção de óleos que
contenham ácido γ-linolénico e podem substituir outros óleos com custos mais elevados.
Para alémdestes aspetos,existeaindaadiversidade metabólica dos microorganismos que
possibilita a obtenção de alguns produtos raros e sem a possibilidade de se obter por outras
fontes. É o caso dos fungos oleaginosos e outras espécies que produzem ácidos gordos
poliinsaturados específicos, como a Claviceps purpurea (na produção de ácido ricinoléico) e
algumas espécies de Mucor (na produção de ácido γ-linolénico).
Sobre os vários microrganismos usados:
 Leveduras: as leveduras utilizadas para a produção de óleos e gorduras têm a
característica de acumularemlípidosnasua biomassa,numa quantidade superior a 40%. Nem
todas as espécies de leveduras acumulam lípidos (apenas 25 a 30 espécies). Por exemplo, a
espécie como a Sachharomyces cerevisiae não acumula mais que 10% de lípidos, enquanto
que, outros géneros como a Rhodotorula ou Lipomyces o fazem e com taxas que podem ser
superiores a 70%. Outra vantagem na utilização de leveduras é o seu rápido crescimento e o
facto da síntese de lípidos ocorrer quando um dos nutrientes fica em condições limitantes,
sendoque o microrganismocontinuaaproduzirlípidose aarmazená-losnasua biomassa.Esta
capacidade pode ser uma vantagem do ponto de vista económico, porque a síntese dos
produtosque se pretende continuaaocorrermesmoquandoa concentraçãodum reagente se
torna escassa, o que significa que há produção com pouco gasto de matérias-primas iniciais.
Outra vantagem destes microorgasmos, é a possibilidade de utilizar diferentes fontes de
carbono para a síntese de lípidos e inclusive alguns desperdícios orgânicos de outras
indústrias.
Fungos: as espécies de fungos oleaginosos são principalmente explorados pela sua
capacidade de síntese de lípidos especiais tais como os ácidos docosahexanoicos (DHA), os
ácidos γ-linoleicos (GLA), ácidos eicosapentaenóicos (EPA) e os ácidos araquidónicos (ARA).
Estes inserem-se num grupo designado por PUFAS (polyinsaturated fatty acids. São
especialmenteimportantes nos fosfolípidos que constituem as membranas dos seres vivos e
influenciamaspropriedadesdestas.Oácidoaraquidónico (ARA) é umdos mais abundantes na
composição dos fosfolípidos, como tal influencia muito as propriedades relacionadas com a
rigidezdasmembranase tambémestáenvolvidonoprocessode apoptose celular.Este ácidoé
frequentemente encontrado na composição de fungos oleaginosos e muito raramente em
plantas,o que aumentaointeresse emexplorar a produção deste por via microbiana. Um dos
A produção por via microbiana pode ser otimizada para reduzir a produção de óleos e
gordurasatravésde plantase animaisoucomo alternativaà alteração genética de sementes
e espécies vegetais.

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fungos explorados para esse fim é o fungo Mortierella alpina, através dum processo de
fermentação. Os ácidos DHA e EPA, ambos pertencentes ao grupo ω-3, têm benefícios no
funcionamentodostecidosanimais,porexemplo,aonível das sinapses (existem estudos que
exploramaaplicaçãodesteslípidosno tratamento de doenças neurológicas) e são raramente
encontrados em plantas.
 Poderá ser vantajoso a produção de óleos da série ω-3 por fungos, pois é mais fácil
manipular e controlar o seu crescimento.
Por outro lado, os ácidos gordos insaturados são mais saudáveis e preferíveis aos ácidos
saturados.Porexemplo,amanteigade cacautem umelevadoteorde ácidossaturadose pode
ser substituída por lípidos produzidos por fungos que tenham maior composição em ácidos
insaturados.
 Microalgas: na sua maioria são fototróficas, ou seja, obtêm carbono a partir do CO2.
Contudo, algumas espécies são heterotróficas porque conseguem obter carbono a partir dos
compostos orgânicos. O custo de produção de óleos por via de microalgas pode ser
dispendioso(noentantoapresentam a vantagem do seu crescimento ser fácil e regulável em
fermentadores) pois requerem fontes de carbono orgânicas (no caso de culturas
heterotróficas). Devido a este fator, a sua exploração só é feita para a produção de lípidos
específicos que não sejam encontrados noutras espécies.
 Bactérias: as bactérias apresentam taxas de crescimento elevadas em condições de
culturapouco elaboradase poucodispendiosas.Noentanto,existe um número mais reduzido
de espécies capazes de acumular lípidos. Os lípidos produzidos por bactérias são
essencialmene polihidroxialcanoides e a sua acumulação ocorre principalmente na fase
estacionáriadocrescimentobacteriano. Oconhecimentodamaquinariabacterianarepresenta
uma vantagemadicional.Portanto, sãoboascandidatasaseremmodificadasporprocessos de
engenharia genética para aumentar a acumulação de lípidos.
Para além das vantagens já referidas, a produção de óleos e gorduras por via microbiana
não está dependente das condições climatéricas como no caso das plantas. No entanto, esta
via de produção não traz só benefícios. Em alguns casos, os custos de produção ainda são
elevados, comparados com fontes vegetais limitando, assim, a sua utilização.
3.QUAIS OS ÓLEOS MICROBIANOS MAIS PRODUZIDOS COMERCIALMENTE?
Um dos microrganismospioneiros usados na produção de óleos microbianos foi a espécie
Mucor circinelloides, um fungo filamentoso. O óleo produzido por esta via microbiana é uma
alternativa ao outro óleo produzido por uma espécie vegetal (óleo da prímula), o qual é um
processomaisdispendioso.Oóleoproduzidopelomicrorganismoalémde ser uma alternativa
com custosde produçãomenores,apresenta ummaior teor em ácido γ-linoleico que o óleo a
partir das sementes da prímula. No entanto, esta primeira abordagem à produção por via
microbiananãofoi totalmente bem-sucedida.Poissurgiuumóleoobtidoapartirde uma fonte
vegetal (Borago officinalis) capaz de competir com este, porque tinha menores custos de
produção, maior teor do ácido γ-linoleico. Com efeito, substituiu o ácido obtido por via
microbiana.
4.MICROORGANISMOS OLEAGINOSOS – METABOLISMO
A acumulação lipídica em organismos oleaginosos é ativada por um desequilíbrio de
nutrientes no meio de cultura. Há uma redução significativa de um nutriente essencial,
geralmente o azoto, comparativamente com o excesso de carbono. Por isso, deve existir
primeiro um período de crescimento ativo em condições com concentrações de nutrientes

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propícias(para gerar biomassa) e sódepoisdestafase,nalimitaçãode umnutriente essencial,
há acumulação.
A necessidade de entender o mecanismo dos organismos oleaginosos é imperativa, ora
pela sua especificidade bioquímica, ora pela aplicação industrial. Apesar do mecanismo de
acumulaçãolipídicanãoser completamente entendido, uma grande parte foi já desvendada.
Por diversosestudoscomparativosentreespécies oleaginosas e não oleaginosas, foi possível
entender quais os fatores que implicavam que uma espécie, ou até diferentes estirpes da
mesma espécie, fossem capaz de acumular lípidos e outras não.
Inicialmente, estudaram-se diversas hipóteses possíveis de serem a resposta ao enigma dos
oleaginosos:
4.1.TRANSPORTE DE GLUCOSE
A tabelafoi retiradadoseguinte artigo:‘’A biochemical explanation for Lipid Accumulation
inCandida 107 and OtherOleaginous Micro-organisms’’ondese pretendeuestudarahipótese
do transporte da glucose como mecanismo que leva à acumulação lipídica nas espécies de
leveduras,sendoumaoleaginosae outranão oleaginosa, respetivamente, a Candida utilis e a
Candida 107.
É visível que não há variação entre a estirpe oleaginosa e a não oleaginosa,
comparativamente àincorporaçãode glucose do meio, pois, ambas apresentam uma elevada
Fig.3 Representação esquemática da acumulação lipídica, em cultura descontínua, de organismos oleaginosos. Mostra
que a acumulação de lípidos só começa até que o azoto se esgote do meio.
Fig.4.

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taxa de incorporaçãoquandoo carbono é o nutriente limitante, parasuprimiras necessidades
das leveduras em relação ao substrato.
 Não há uma variação proporcional entre a captação de glucose da Candida 107 e a
taxa de acumulação lipídica, pelo que não é um fator preponderante para o mecanismo em
estudo.
4.2.PAPEL DAACETIL-COACARBOXILASE
(Osdadostem por base o mesmoartigousadoanteriormente)
A enzima em estudo catalisa uma reação indispensável na lipogénese, e vai ser estudada
mais à frente.
4.3.PAPEL DE NUCLEÓTIDOS DE ADENINA
É possível observar uma queda da concentração de AMP (adenina mono fosfato) durante a
fase
de acumulação lipídica nos organismos oleaginosos. Nos organismos não oleaginosos esta
quedanão se verifica.Naverdade,quandoonutrientelimitanteé oazoto,o conteúdode AMP
nas estirpesoleaginosasé menosde 5% do seuvalornummeioemque o nutriente limitante é
o carbono.As limitaçõesde azoto desencadeiam uma cascata de eventos bioquímicos nestes
organismos.
A diminuição das concentrações de AMP está relacionada com a presença da enzima -AMP
desaminase. A sua ativação catalisa a seguinte reação:
Esta enzima, apesar dos mecanismos serem ainda desconhecidos, aumenta a sua atividade
nos organismos oleaginosos, a partir do momento que há supressão de azoto no meio.
Todavia, numa avaliação mais cuidada, a ativação da enzima vai de encontro à supressão de
Candida 107 ()
Candida utilis ()
Observa-se uma maior atividade da enzima, para a
estirpe oleaginosa(Candida 107),sendoque o citrato
em concentrações baixas tem um efeito
estimulatório na atividade enzimática até 40%.
O papel deste metabolito na estirpe não oleaginosa
não é relevante.
Nestes dois estudos é possível concluir que o citrato, no caso das estirpes oleaginosas, tem
um papel estimuladornaatividade daAcetil-CoA carboxilase. Mas a captação de glicose, não
influencia as taxas de acumulação lipídicas.
Fig.5. Atividadeda enzima acetilCoAcarboxilaseem função do citrato adicionado

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azoto do meio. Ou seja, ao transformar AMP em inosina monofosfatada (IMP) e amónia
colmata a inexistência de azoto no meio( com o input de NH4) .
O decréscimo de AMP nos organismos oleaginosos afeta profundamente a atividade da
isocritrato desidrogenase (NAD+ dependente).
Tal que, a sua supressão condiciona a reação que catalisa no ciclo de Krebs:
Nos organismos não oleaginosos a dependência da enzima pelo AMP não se verifica.
Apesar de os mecanismos não serem completamente desconhecidos, este processo
regulatórioé típicode levedurasoleaginosas.Existemboloresoleaginosos,que respondem de
mododiferente.A atividade daisocinasedesidrogenase persiste depois da exaustão de azoto
do meio,atrasandooprocessode acumulaçãolipídica.Porexemploaespécie Cunninghamella
echinulata atrasa a lipogénese aproximadamente 150 horas depois da supressão do azoto.
Passadoeste período,aconcentração da isocitrase desidrogenase decai e inicia o processo de
acumulação. Este caso, e outros, revelam que as propriedades regulatórias desta enzima
diferem entre os microorganismos oleaginosos em causa.
Então, a diminuição da concentração de AMP, afeta – inibindo - a atividade da isocinase
desidrogenase. Logo, há uma acumulação do isocritrato.
O isocitrato origina citrato, numa reação reversível catalisada pela enzima aconitase.
Ocorre a passagemdocitrato mitocondrial paraocitoplasma,porintermédiode uma proteína
transportadora: tricarboxilato translocase.
O citrato carrega indiretamente as unidades de acetil-CoA da mitocôndria para o citoplasma.
Aqui são carboxiladas pela acetil-CoA carboxilase formando a molécula precursora da
lipossíntese - Malonil-CoA. [ reação (2) ]
A enzima citrato liase catalisa a formação de acetil-CoA e oxaloacetato a partir do citrato.
[ reação (1) ]
É na verdade uma das enzimas mais importantes no processo, pois contribui com o
fornecimento de unidades de acetil-CoA no citosol.
Está presente na maior parte das células animais, e foi encontrada em abundância em
leveduras oleaginosas.
Salientando que, há uma relação entre a capacidade oleaginosa de leveduras, fungos
filamentosos e outros microorganismos e a presença desta enzima. Não é encontrada em
leveduras não oleaginosas como Candida utilis e Saccharomyces cerevisiae.
Apesardisto, estaenzima foi encontrada em microorganismos que não acumulam lípidos.
Pelo que, a sua presença não indica necessariamente que o organismo é uma espécie
oleaginosa. Mas tem um papel fulcral na regulação da acumulação lipídica.
Citrato Oxaloacetato + Acetil -CoA
Citrato liase
(1)

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A reação (2) é, então, catalisada pela enzima acetil co-A carboxylase, num passo
irreversível. O produto formado é o primeiro intermediário no citosol para a síntese lipídica.
Abordou-se opapel regulatórioda isocitrato desidrogenase, contudo há mais uma enzima
com um papel muito importante no metabolismo e regulação do fenómeno em estudo.
4.4.ENZIMA MÁLICA (MALIC ENZYME-ME)
Pensa-se que aME( NADP+dependente) limitaacapacidade de biossíntese dosorganismos
oleaginosos. As taxas de acumulação lipídica podem variar de espécie para espécie e até
dentroda mesmaespécie,entrediferentes estirpes. Os mecanismos de regulação génica são
ainda desconhecidos, mas a barreira que dita as taxas máximas acumuladas é pré-
determinada geneticamente. Esta enzima catalisa a carboxilação irreversível do malato para
piruvato com formação de NADPH. Nenhuma outra enzima parece ser capaz de alimentar o
poder redutor da lipogénese.
Em conclusão, a queda dos valores de AMP inicia uma cascata de reações que potenciam a
acumulação lipídica.

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Quando a atividade da ME cessa a acumulação lipídica pára. Uma possível explicação ao
facto de diferentesorganismosacumularemdiferentestaxaslipídicaspoderáestarrelacionada
com o controlo e expressão génica da ME.
 Foi de facto feito um estudo publicado, sobre a relação da ME e a produção lipídica.
Com base no artigo: ‘’Malic enzyme: the controlling activity for lipid production?
Overexpression of malic enzyme in Mucor circinelloides leads to a 2.5-fold increase in lipid
accumulation.’’
Foram isolados os genes que codificavam para a isoforma da enzima málica envolvida na
síntese de ácidosgordos,de duas espéciesde fungos, malEMte malEMc –respetivamente com
origem nas espécies Mucor circinelloides e Mortierella alpina. Recorrendo a técnicas de
manipulação genética, os genes de cada espécie foram clonados numa estirpe de Mucor
circinelloides R7B. A super expressão dos genes malEMt e malEMc foi conseguida pela
regulação de um promotor constitutivo gdp1.
Foi possível, com a ‘’overexpression’’ da atividade enzimática num vetor controlado,
aumentar o conteúdo lipídico de 12% a 30%.
Há uma relação clara entre a atividade enzimática e a enzima málica.
A ME, ao realizar a descarboxilação oxidativa do malato para piruvato, fornece NADPH
(poder redutor) que é essencial para o mecanismo em estudo. Apesar de existirem outras
enzimas capazes de gerar o mesmo produto (NADPH) - glucose-6-fosfato desidrogenase,
isocitrato desidrogenase, 6-fosfogluconato desidrogenase- no caso dos microorganismos
oleaginosos,estaenzimaé a responsável por suprir NADPH à biossíntese lipídica. O aumento
de atividade da mesma (ME) conduz a um aumento da biossíntese lipídica.
 De salientar que o gráfico a)
representa a concentração de glucose no
meio. Pelo que a captação de glucose do
meio (a) nas espécies transformadas é
superior à estirpe selvagem, logo veem o
seu peso aumentar mais rapidamente, ou
seja, as espécies transformadas acumulam
uma maior taxa lipídica.
Fig.6.

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Por uma avaliação do gráfico c) e d)
percebe-se que a atividade da ME
diminui.
 Acontece após a exaustão de
azoto no meio. É necessário que o azoto
(ou outro nutriente essencial para além
de carbono) se esgote do meio para
haver acumulação de lípidos, e que haja
um contínuo suprimento de carbono.
Assim, limita-se a proliferação mas a
assimilação de carbono continua
 Uma possível explicação para a
diminuiçãodaatividade daME pode ser a
existência de enzimas que a degradam
especificamente (pois sabe-se que o gene
continua a ser transcrito para mRNA).
Contudo,apesarda diminuiçãodaenzima
málica o conteúdo lipídico continua a
aumentar.
De certa formaà um contra censocom o que foi dito anteriormente, mas permite concluir
que o fenómeno da acumulação lipídica vai para além do controlo enzimático e está
estritamente relacionado com outros fatores. Ou seja, é também uma consequência da
contínua captação de carbono sem existir multiplicação (em indústria o objetivo é criar
microorganismos obesos).
5.CONDIÇÕES GERAIS DECULTURAE PRODUÇÃO DOS MICROORGANISMOS A NÍVEL INDUSTRIAL
Todosos organismosnecessitamde ummeiode culturaparase conseguirem desenvolver,
sendoque a sua composiçãoótimavai dependerdomicroorganismo,doprodutopretendidoe
da escalado processo.Paraalém da água, o meio tem de possuir nutrientes que forneçam os
elementos químicos essenciais tais como carbono, azoto, fósforo, enxofre, magnésio, entre
outros. As fontes de carbono industrialmente mais usadas são a glucose, o amido, entre
outros.Relativamente àsfontesde azoto inorgânico utilizam-se os sais de amónio ou nitrato,
entre outros. A presença de oxigénio é indispensável para alguns microorganismos, mais ou
menos suportada por outros e absolutamente intolerada por poucos.
Em qualquer processo de biotecnologia microbiana, o meio de cultura, o biorreator e o ar
fornecido devem ser previamente esterilizados (através do calor ou filtração), sendo que
durante o processo devem ser mantidas as condições de assepsia por forma a não afetar a
qualidade do produto final.
Quandose desejaimplementarumprocessofermentativoaté àescalaindustrial,têmde se
realizar estudos exaustivos relacionados com o aumento da escala (scale-up) desde o
laboratório até ao fermentador. Existem três tipos de fermentadores industriais os quais
funcionam em cultura contínua, semi-contínua (ou feed-batch) ou descontínua (ou batch),
sendo escolhido o tipo de cultura em fermentador mais adequada consoante o
microorganismoautilizar,osseusmecanismos de regulação metabólica e o tipo de matérias-
primas usadas como substrato.

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6. CONDIÇÕES GERAIS DECULTURAE PRODUÇÃO DOS MICROORGANISMOS OLEAGINOSOS A NÍVEL
INDUSTRIAL
A fim de se desenvolverem processos de produção industrial em biorreatores
economicamenteviáveisparaculturade microorganismosoleaginosos, é fundamental que os
óleos e gorduras sejam produzidos a uma taxa elevada e que tenham um valor económico
suficientemente alto.
Portanto,para uma eficiente produçãolipídica é importante umacorretaseleçãodo
microorganismo pordiversasrazões:
 O facto doteor emlípidosna biomassavariarde acordo com a espécie,oque
influenciaataxa de produçãolipídicaobtidanumprocessoindustrial;
 A rapideze a facilidade comque se reproduz;
 Deve sergeneticamente estável.Pois,pode existirointeresse em
modificarumaestirpe paraa adequarmelhora produziroóleopretendido(porexemplo);
 Preferencialmenteosmicroorganismosdevemterumataxade acumulação
lipídicaelevadae,noentanto,devem conseguirmantê-laquandocultivadaemlargaescala.
Por análise da figura anterior, verifica-se que o armazenamento de lípidos nos
microorganismos oleaginosos em culturas descontínuas e semi-contínuas ocorre sempre
quando a fonte de carbono existe em excesso relativamente à fonte de azoto. A única
diferença importante entre os dois tipos de cultura é que na descontínua não há adição de
substrato durante todo o processo para além do colocado inicialmente e, na cultura semi-
contínua ossubstratospodemse adicionados durante oprocesso.Isto implica que a produção
e acumulaçãode lípidospossamserdiferentesentre osdoisprocessos.Nasculturascontínuas,
a concentração dos substratos de azoto e carbono no interior do biorreator são constantes e,
por isso,a acumulação de lípidos só depende da taxa de diluição (D) – quanto menor é a taxa
de diluição, maior é a produção de lípidos.
7.MICROORGANISMOS OLEAGINOSOS: PROCESSOS DE CULTIVO EM CONDIÇÕES ÓTIMAS
7.1. MICROORGANISMOS OLEAGINOSOS: MICROALGAS
As microalgas, de acordo com a fonte de carbono que utilizam são direcionadas para um
processo industrial específico. É o caso das espécies Crypthcodinium cohnii e Schizochytrium
spp. que por realizaremfermentaçãoheterotrófica,sãocultivadasnumfermentador em que a
fonte de carbono é um composto orgânico.
Fig.7. Modelação e previsão do tempo decorrido de uma fermentação em batch (à esquerda) e a taxa de diluição
numa cultura contínua

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As microalgas são muito dependentes do ambiente envolvente e como tal a síntese de
lípidos (mais especificamente os PUFAs), é influenciada por diversos parâmetros como a
salinidade,acomposiçãodomeio,atemperatura,ofluxode ar, entre outros.Peloque,temde
se reunir diversos nutrientes e das condições ambientais no metabolismo das microalgas.
Na verdade, a Crypthcodinium cohnii é o único heterotrófico marinho dinoflagelado (, em
que o DHA é quase exclusivamente o único PUFA que se encontra nos seus lípidos, podendo
ser cerca de 65% do total dos ácidos gordos produzidos por esta microalga.
Num estudo realizado (desenvolvido no artigo “Optimisation of docosahexaenoic acid
production in batch cultivations by Crypthecodinium cohnii”) esta espécie de microalga foi
cultivadanummeiocompostoporglucose, extrato de levedura e sal marinho. Ao aumentar a
quantidade de extrato de levedura verificou-se que o seu crescimento era estimulado, no
entanto,a acumulaçãode lípidoseradiminuta.Relativamente à concentração de sal marinho,
só quando esta era superior a metade da concentração média da água do mar é que ocorreu
uma boa acumulaçãode lípidos.Adicionalmentemostrou-se que a temperatura de incubação
influencia a acumulação de lípidos e o crescimento celular. Usaram-se como modelo duas
temperaturas, 27ºC e 30ªC e, após comparação, mostrou-se que a temperatura de incubação
maiselevadapermitiuummelhorcrescimento,masfoi à temperatura mais baixa que ocorreu
uma maior acumulação de lípidos.
Numa segunda experiência (com base no artigo “Production of docosahexaenoic acid by
Crypthecodinium cohnii grown in a pH-auxostat culture with acetic acid as principal carbon
source”) a Crypthcodinium cohnii foi cultivada num meio contendo acetato de sódio como
principal fonte de carbono. O pH foi mantido a um valor constante devido à adição de ácido
acético, o qual proporciona uma fonte adicional de carbono (de forma controlada).
Demonstrou-se entãoque,aacumulaçãode lípidosporparte da Crypthcodiniumcohniifoi
mais elevada, do que nas culturas descontínuas em que a glucose era a principal fonte de
carbono.
7.2. MICROORGANISMOS OLEAGINOSOS: FUNGOS
É importante adequar a quantidade de azoto adicionado ao meio de cultura, pois
determinaaformação da biomassa produtiva, isto é, os lípidos. Quando é atingido o máximo
de concentração de biomassa (maior número células) o fornecimento de azoto é encerrado,
enquanto o carbono vai continuar a ser facultado para o meio de cultura de modo a manter a
acumulação de lípidos. Esta fonte de carbono tem de estar ajustada à taxa de consumo das
células para garantir um contínuo, mas moderado excesso, de substrato de carbono, tal que
este não comece a ter efeitos inibitórios na acumulação dos lípidos.
Há diversosfungosoleaginosossendoo fungoMortierella alpino um dosmais utilizados. No
geral,é cultivadonummeiode culturaconstituídoporglucose (é a fonte de carbono) e extrato
de leveduraouproteínas vegetais hidrolisadas, ambas como fontes de azoto. Durante todo o
processode fermentaçãoosparâmetrosdatemperatura,dopH, do fluxode ar,da agitação,da
pressão, da concentração de glucose e do oxigénio dissolvido são controlados, sendo que as
culturas vão sendo transferidas para fermentadores maiores passando pelo scale-up.
Com o objetivode conhecerascondiçõesótimas para um rápido crescimento de biomassa
e uma produção de lípidos (com uma grande proporção de ácidos gordos polinsaturados,
especialmenteoácidoaraquidónico-ARA) o fungo Mortierella alpina CBS 343.66 (num estudo

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referido no artigo “Effect of temperature and glucose supply on the production of
polyunsaturated fatty acids by the fungus Mortierella alpina CBS 343.66 in fermentor
cultures”) foi cultivado num fermentador com diferentes valores de pH, temperatura e
fornecimento de fontes de carbono (a glucose). Uma ótima produção de lípidos foi obtida a
pH=6.5, a uma temperaturade 25ºC, na presença de excesso de glucose (fonte de carbono) e
na insuficiência de cloreto de amónio (fonte de azoto).
8. MICROORGANISMOS OLEAGINOSOS: PROCESSOS DE EXTRAÇÃO DOS LÍPIDOS
Com o objetivo de tornar a recuperação de óleos e gorduras, a partir de microorganismos
oleaginosos,maiseficaz, aruturacelular(cell disruption) é umpassofundamental antesda sua
extração.
Os microorganismos abordados possuem uma parede celular resistente à quebra.
Consequentemente, diversas técnicas de rutura celulares têm sido desenvolvidas. Embora
existamjámuitastécnicasdisponíveis,só umnúmerorestritoé que se consegue aplicaranível
industrial.
Fig.8-Métodos de Rutura Celular: métodos físicos, químicos e biológicos
Nos métodos químicos e biológicos, é fundamental conhecer a estrutura e composição
das paredescelularesdosmicroorganismos,para que estes sejameficientes. A nível industrial
os métodosfísicossãoos maisusados,maisespecificamente ahomogeneização a alta pressão
(consiste emfazerpassaras célulasporumapequena válvula ou orifício a altas pressões, com
o auxiliode equipamentoespecializado) e o“beadmilling”(consistenumacâmaraque contém
discos rotativos localizados no centro e o efeito de maceração deve-se à ação de esferas de
vidro ou plástico que ocupam a maior parte do volume da câmara).
I. Rutura Celular
II. Segue-se a separação do conteúdo celular libertado (o homogeneizado), onde se
encontram os lípidos. Geralmente usa-se uma centrifugação ou filtração, sendo que a
eficiênciade ambasas técnicassãoinfluenciadaspelotamanhodosdetritos,pela densidade e
viscosidade do conteúdo celular libertado.
Se o homogeneizadotiverumaelevadaviscosidadeavelocidadede sedimentaçãodiminui,na
centrifugação.Jána filtraçãopode ocorrera obstruçãodo filtroe a redução na taxade fluxo.

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III. Isolamento da restante biomassa dos microorganismos oleaginosos. Geralmente os
óleos e gorduras são extraídos da biomassa dos fungos e algas por mistura de hexano, num
processode extraçãocontínuo.Esta misturapode serhomogeneizada de forma a garantir que
o máximo de óleos é extraído. O hexano agora associado aos óleos extraídos é removido por
evaporação para originar óleos “livres”.
Numestudo (baseadonoartigo “Investigationof cell disruptionmethodsforlipidextraction
fromoleaginous Microorganisms”),asespécies Cryptococcus curvatus, Mortierella isabellina e
a Chlorella sorokiniana foram selecionadas como microorganismos oleaginosos
representativos das leveduras, fungos e microalgas, respetivamente. Para cada espécie, as
células foram sujeitas a métodos físicos de rutura celular tais como autoclavagem, “bead-
beating” (consiste na maceração das células a alta velocidade recorrendo a esferas finas),
microondas(quebradascélulasatravésde choquesde ondasde altafrequência), “sonication”
(rompe as células através da cavitação de microbolhas induzida por ondas sonoras), e a um
método químico, a digestão ácida (rutura das células por adição de ácido clorídrico).
Posteriormente as células foram tratadas com um solvente orgânico de
clorofórmio/metanol (1:1, v/v) para extrair os lípidos, sendo que em algumas células estes
foram extraídos pelo método de Soxhlet - é um aparelho onde é colocada a biomassa
juntamente com um solvente orgânico (neste caso clorofórmio/metanol (1:1, v/v)), que
permite a extração de lípidos.
 Embora a recuperaçãode lipídiostenhavariadoentre asespéciesmicrobianas,
dos métodos de autoclavagem e microondas resultaram os menores teores de lípidos
extraídos em todas as espécies de microorganismos.
 Para a Cryptococcus curvatus a maior recuperação de lípidos ocorreu através
da digestão ácida, comparando com a “sonication”, “bead-beating” e o método de Soxhlet.
 Para as espécies Mortierella isabellina e Chlorella sorokiniana a maior
quantidade de lípidosfoi conseguidaatravésdométodode Soxhlet,seguidadadigestão ácida.
 Por último,verificou-seque adigestãoácidapode sero métodomaissimplese
eficaz para a recuperação de lípido a partir das espécies testadas, tendo em conta o fator
tempo e a temperatura da reação.

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Fig.9. Conteúdo lipídico extraído pelos métodos físicos e químicos de extração (A) M. isabellina; (B) C.
curvatus; (C) C. sorokiniana (gráficos retirados do artigo enunciado anteriormente)

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Um segundo estudo (Ultrasonication assisted lipid extraction from oleaginous
microorganisms,comparou os resultados da extração de lípidos usando o método usual,
clorofórmio/metanol (2:1, v/v) e um novo método usando vários solventes, incluindo água,
hexano,metanol e clorofórmio/metanol (1:1, v/v) sob a influência de ultrassons (520 kHz, 40
W e 50 Hz, 2800W). A extração de lípidos foi mais eficiente quando se usou o solvente
clorofórmio/metanol, sob os ultrassons de frequência 50 Hz e energia de 2800W.Assim este
processo de ultrassons usando como solvente o clorofórmio/metanol permitiu uma
recuperaçãototal dos lípidosnumcurtoperíodode tempo(15 minutos), e a uma temperatura
relativamente baixa(25ºC).Nométodo convencional, para que ocorra uma extração total dos
lípidos é necessário pelo menos 12 horas com uma temperatura de 60ºC.
Este novo métodoinovadoré promissorparaumaeficazextraçãode lípidosa partirde
microorganismosoleaginosos.

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CONCLUSÃO
Após a realização deste trabalho, concluímos que a produção de óleos e gorduras por via
microbianatem uma aplicação comercial diferente dos óleos e gorduras de origem vegetal e
animal. Enquanto os primeiros são explorados para a obtenção de produtos com alto valor
económico, os outros destinam-se à produção em larga escala com o menor custo possível.
Contudo,alémdosfatoreseconómicos,pensamosque,perante ocenárioecológicoatual,é
essencial que os biotecnólogos procurem alternativas mais ecológicas. A produção por via
microbiana é uma alternativa promissora pelo facto de poder ser otimizada para reduzir a
produçãode óleose gorduras através de plantas e animais e em como alternativa à alteração
genética de sementes e espécies vegetais.

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