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Artigo 4 cultivo de microalga com adição de glicerol em cultivos mixotróficos em fotobiorreatores para produção de biomassa com foc

  1. 1. CULTIVO DE MICROALGA COM ADIÇÃO DE GLICEROL EM CULTIVOS MIXOTRÓFICOS EM FOTOBIORREATORES PARA PRODUÇÃO DE BIOMASSA COM FOCO EM BIOCOMBUSTÍVEISKeli Cristiane Correia Morais1, Kassiana Ribeiro2, Robert Luis Lara Ribeiro3, David Alexander Mitchell4, JoséViriato Coelho Vargas5, André Bellin Mariano61 Bióloga, Mestranda do PIPE., NPDEAS, UFPR, Curitiba, PR, Brasil – biokeli2000@gmail.com2 Graduanda de Biologia, Pontifícia Universidade Católica do Paraná, NPDEAS, UFPR, Curitiba, PR, Brasil – kassi.ribeiro@hotmail.com3 Matemático, M.Sc., Doutorando do PIPE., NPDEAS, UFPR, Curitiba, PR, Brasil – robertlarabr@yahoo.com.br4 Microbiologista, PhD., Depto. de Bioquímica e Biologia Molecular, UFPR, Curitiba, PR, Brasil – davidmitchell@ufpr.br5 Engenheiro Mecânico, PhD., Departamento de Engenharia Mecânica, UFPR, Curitiba, PR, Brasil – jvargas@demec.ufpr.br6 Farmacêutico Bioquímico–Industrial, D.Sc., NPDEAS, UFPR, Curitiba, PR, Brasil – andrebmariano@gmail.com RESUMOA produção de biomassa de microalgas precisa de muitos aprimoramentos na tecnologia para permitir aprodução viável de biocombustíveis. O Núcleo de Pesquisa e Desenvolvimento de Energia Auto-Sustentável daUFPR desenvolveu um Fotobiorreator Tubular Compacto de 10 m3 com características para maximizar oaproveitamento de luz e CO2. Entretanto, muitos estudos ainda são necessários para desenvolver o meio decultivo adequado. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de biomassa da microalgaPhaeodactylum tricornutum em cultivos mixotróficos, nos quais existe a adição de uma fonte de carbonoorgânico complementando o CO2 fixado pela fotossíntese. O nutriente escolhido foi o glicerol, atualmente umsubproduto do processo de produção de biodiesel. Foram realizados três tratamentos: a) controle (sem adição deglicerol), b) glicerol 0,15 M adicionado no início do cultivo, e c) glicerol em adições sucessivas durante todo ocultivo equivalente a 0,15 M. O experimento foi realizado em sala de cultivo de microalgas sob condições pré-determinadas e constantes. A adição de carbono orgânico ocasionou aumento da concentração de biomassa de31,6%. Este resultado sugere que cultivos mixotróficos apresentam-se como uma viável alternativa do uso doglicerol, permitindo o aumento da produtividade de biomassa e óleo para produção de biocombustíveis.Palavras-chave: microalga, mixotrófico, glicerol, biomassa, biocombustíveis, Phaeodactylum tricornutum ABSTRACTCultivation of microalgae with the addition of glycerol in mixotrophic conditions in photobioreactors forproduction of biomass with emphasis on biofuels. Biomass production of microalgae needs many technologicalimprovements in technology to enable viable production of biofuels. The Center for Research and Developmentof Sustainable Energy (NPDEAS) at UFPR developed a compact tubular photobioreactors of 10 m 3 with featuresto maximize the utilization of light and CO2. However, many studies are still needed to develop the appropriateculture medium. The objective of this study was to evaluate the biomass production of microalga Phaeodactylumtricornutum in mixotrophic cultures, with the addition of an organic carbon source. Glycerol was chosen as theadditive nutrient to complement the CO2 fixed by photosynthesis. Glycerol was chosen because it is a byproductof the current biodiesel production process. Three different treatments were evaluated: a) control (withoutglycerol), b) glycerol (0.15 M) added at the beginning of cultivation, and c) successive additions of glycerolthroughout the growing season equivalent to 0.15 M. The experiment was conducted in a microalgae cultivationroom under constant and predetermined conditions. The addition of organic carbon caused a 31.6% increase inthe concentration of biomass. This result suggests that mixotrophic cultivation is a viable alternative to the use ofglycerol, enabling increased productivity of biomass and oil for biofuel production. Keywords: microalga, mixotrophic, glycerol, biomass, biofuels, Phaeodactylum tricornutumINTRODUÇÃO A diversificação da matéria-prima para a produção de biodiesel vem sendo incentivada pelo ProgramaNacional de Produção de Biodiesel (PNPB). Desta forma, as microalgas cultivadas em fotobioreatores são focode estudo do Núcleo de Pesquisa e Desenvolvimento em Energia Auto-Sustentável (NPDEAS) por apresentaremelevada produtividade e vantagens em relação às oleaginosas como: biomassa homogênea, maior eficiência
  2. 2. fotossintética, baixo custo com transporte e ainda por não concorrer por terras agriculturáveis. Odesenvolvimento dos fotobioreatores pelo NPDEAS envolve numerosas etapas, como a preparação da estruturado fotobiorreator (FBR), composição do meio de cultivo, escolha de microalgas e sua composição, operaçõesunitárias de separação, secagem e extração de óleo, produção de biodiesel, análise da qualidade de biodiesel pormétodo computacional, biodigestor, unidade trigeradora, resíduos e a implementação de softwares (MARIANOet al. 2009). As microalgas são microrganismos fotossintéticos que requerem nutrientes relativamente simples e cujabiomassa pode ser empregada para obtenção de biocompostos, como suplemento alimentar humano e animal oufonte de biocombustíveis (ANDRADE & COSTA, 2008). A microalga Phaeodactylum tricornutum Bohlin,1897 é uma das microalgas que tem sido estudada pelo nosso grupo de pesquisa por apresentar teor lipídico emsua estrutura, podendo ser empregada na produção de biocombustíveis. Em cultivo de microalgas, a fonte denutrientes é o componente de importância considerável devido ao elevado custo de produção. A fonte de carbonoadicional a estes cultivos possibilita maior rendimento em biomassa, já que haverá maior disponibilidade decarbono além do produzido via metabolismo fotossintético. A estimulação do crescimento de P. tricornutumcom adição de glicerol foi verificada e a biomassa seca foi quantificada. (CERÓN GARCIA et al, 2006;CAMACHO et al, 2000). O glicerol é uma fonte de carbono interessante em cultivos mixotróficos onde o foco éa produção de biodiesel devido a sua disponibilidade resultante do processo de transesterificação. Nestapesquisa, foi utilizada para o cultivo mixotrófico a microalga Phaeodactylum tricornutum que confere altadensidade lipídica em sua estrutura, possibilitando assim produzir grandes quantidades de biodiesel(LOURENÇO, 2006). Cultivos em condições mixotróficas para variadas espécies de microalgas têm sidoestudados (CERÓN GARCIA et al, 2006; ANDRADE & COSTA, 2008; RADMANN, 2009), no entanto, estetrabalho discute a influência das diferentes maneiras de adicionar o glicerol durante o cultivo para que se obtenhamáxima concentração de biomassa. São encontrados poucos trabalhos que estudaram a microalgaPhaeodactylum tricornutum, em condições mixotróficas, no entanto, estes demonstram melhor rendimento debiomassa do que em cultivos autotróficos, podendo duplicar a biomassa em relação ao experimento controle(GARCIA et al, 2005).MATERIAIS E MÉTODOS A microalga Phaeodactylum tricornutum Bohlin 1897, gentilmente cedida pelo Grupo Integrado deAquicultura da UFPR para o NPDEAS, foi cultivada em sala de cultivo climatizada. O NPDEAS tem o objetivode produzir biodiesel a partir de microalgas cultivadas em fotobiorreatores compactos, para tanto se faznecessário realizar cultivos experimentais com as espécies. O cultivo em batelada nos traz resultadospromissores de modo a otimizar o meio e aumentar a produtividade em biomassa. A Figura 1 exemplifica deforma ilustrativa o significado do metabolismo mixotrófico como sendo a interação dos metabolismosheterotróficos e autotróficos. Além da luz necessária para que a célula produza energia através do CO 2 e de H2Oatravés do processo de fotossíntese é fornecido carbono na forma orgânica (glicerol, glucose, acetato) resultandoassim no metabolismo mixotrófico. O cultivo mixotrófico foi testado neste trabalho utilizando o glicerol como fonte de carbono. Osexperimentos foram realizados em duplicata e o planejamento pode ser visto na Tabela 1. No experimento 1 foi adicionado glicerol diariamente, sendo o volume correspondente a concentraçãode 0,15M dividida pelo número de dias de cultivo, no experimento 2 a adição de todo o volume de glicerol foifeita no início do cultivo e no experimento 3 não houve adição de glicerol, resultando no experimento controle.A cultura foi realizada em erlenmeyers com capacidade de 2 litros num volume de 1,8 litros, mantidos emambiente de temperatura de 18 a 20 ºC sob aeração constante com fluxo de ar atmosférico de 2,7 L/min em cadaerlenmeyer. A intensidade luminosa de 5500 lux foi mantida por lâmpadas fluorescentes de 40W em fotoperíodointegral. O meio de cultura F/2 Guillard modificado foi preparado em água do mar padronizada em 15‰ eposteriormente autoclavados. A composição do meio Guillard F/2 modificado encontra-se na Tabela 2. Somenteapós atingirem temperatura ambiente o glicerol na concentração 0,15M foi adicionado. Foi escolhida estaconcentração de glicerol em decorrência de experimento prévio realizado em diferentes concentrações deglicerol. O inóculo inicial dos experimentos foi padronizado a 30.10 4 cel/mL de acordo com Soares (2010) com oobjetivo de atingir a densidade celular máxima, minimizando efeitos do autosombreamento, sendo assim, oinóculo inicial em todos os experimentos foi de aproximadamente 100mg/L. Em trabalhos com cultivosmixotrófico de Cerón García (2000) a concentração de biomassa para inoculação foi entre 70-100mg/L.
  3. 3. Figura 1 – Metabolismo das microalgas: (A) Representação da fotossíntese e destinos metabólicos da glucose nometabolismo celular; (B) Diferenças entre os metabolismos autotróficos, heterotróficos e mixotróficos.Figure 1 – Microalgae metabolism: (A) Photosynthesis and metabolic destinations of glucose in cellularmetabolism; (B) Differences between autotrophic, heterotrophic and mixotrophic metabolisms.Tabela 1 – Condições experimentais dos cultivos de microalgaTable 1 – Experimental conditions of microalgae cultivation Experimentos Concentração de Glicerol Maneiras de adição de glicerol 1 0,15 M Adicionado diariamente 2 0,15 M Adição no início do cultivo 3 0M Sem adição de glicerol A determinação de biomassa seca foi realizada de dois em dois dias, durante 16 dias. Foi coletado 150mL do meio para que a biomassa seca pudesse ser quantificada em triplicata. Para isso, foi filtrado 50mL domeio de cultivo em papel filtro quantitativo com auxílio de bomba à vácuo, como pode ser vista na Figura 2a. Ospapéis filtros foram mantidos em estufa a 60ºC até que o peso se mantivesse constante. A biomassa seca foiestimada através da diferença da massa do papel antes e depois da filtragem, os papéis quantitativos com abiomassa são apresentados na Figura 2b.
  4. 4. Tabela 2 – Composição do meio Guillard F/2 modificado.Table 2 – Composition of Guillard F / 2 modified medium. Solução Para cada 1litro de água foi adicionado: 1,0 ml de solução de N e P  75,0g de Nitrato (NaNO2); (Nitrato e Fosfato)  5,0g de Fosfato (Na2HPO4.7H2O);  5,50g de EDTA (C10H14N2O8Na2.2H2O);  4,00g de Cloreto de Ferro (FeCl3.6H2O);  1,0 ml de solução de Trabalho de 0,18g de Cloreto de Manganês (MnCl2.4H2O); Metais  10,0mL de solução Estoque de Metais.  50,0g de Tiamina (Vitamina B1)  0,5g de Biotina (Vitamina H); 1,0 ml de solução de Vitaminas  0,5g de Cianocobalamina (Vitamina B12); 0,75 ml de Solução de Silicato 30,0g de Silicato de Sódio Alcalino; 5,0 ml de Solução de TRIS  90,0g de TRIS (Tris Hidróximetil Amino Metano);  60,0mL de Ácido Clorídrico;  850,0mL de água destilada.Figura 2 – Determinação da biomassa seca de microalgas: (a) aparato experimental; (b) aspecto das amostras.Figure 2 – Determination of dry biomass of microalgae: (a) experimental apparatus, (b) samples aspects.RESULTADOS E DISCUSSÃOProdução de biomassa seca de P. tricornutum A concentração de biomassa seca da diatomácea P. tricornutum determinada de dois em dois diasdurante os cultivos com glicerol adicionado diariamente (Exp. 1), no início do cultivo (Exp.2) e o experimentocontrole, sem adição de glicerol (Exp. 3), são apresentados no Figura 3. Os valores médios de concentraçãomáxima a cada dois dias são apresentados na Tabela 3, expressos no decorrer de horas de cultivo. Aconcentração máxima de biomassa obtida no cultivo mixotrófico foi de 1,294g/L no experimento onde o glicerolfoi adicionado no início do cultivo. Enquanto isso, no cultivo autotrófico a biomassa seca máxima obtida foi de0,88 g/L. O cultivo mixotrófico com adição diária de glicerol foi 23,11% maior que o cultivo autotrófico, já ocultivo com adição de glicerol no início apresentou biomassa 31,6% maior que o controle. A evolução da biomassa seca no decorrer de 192 h de cultivo apresentada na Figura 3, mostra quehouve melhor assimilação do carbono orgânico nos cultivos onde esta fonte foi adicionada no início,apresentando diferença de 12% em acréscimo ao cultivo onde o glicerol foi adicionado diariamente. As curvasapresentaram bastante semelhança, mas ficou perceptível a diferença de concentração entre os cultivosmixotróficos e autotróficos.
  5. 5. Tabela 3: Biomassa seca média obtida nos cultivos mixotróficos e autotrófico (g/L) Table 3: Average dry biomass obtained in cultures mixotrophic and autotrophic (g/L) Tempo (h) Exp. 1 Exp. 2 Exp. 3 0 0,100 0,100 0,100 24 0,178 0,201 0,114 48 0,227 0,272 0,204 72 0,377 0,386 0,274 96 0,477 0,5111 0,387 120 0,656 0,804 0,593 144 0,731 0,848 0,636 168 0,893 1,013 0,746 192 1,151 1,294 0,885Figure 3 – Efeito da adição de glicerol na produção de biomassa seca de P. tricornutum em cultivo de 16 dias.Figure 3 – Effects of glycerol on dry biomass production of P. tricornutum in cultivation for 16 days.Produção de biomassa em fotobiorreator tubular compacto O NPDEAS desenvolveu um fotobiorreator tubular compacto de 10 m3 de capacidade para cultivo demicroalgas com foco na produção de biocombustíveis. FBR apresenta dimensões de 8 m de altura x 2 m delargura x 5 m de comprimento. A Figura 4 apresenta a fotografia do primeiro módulo construído. Os resultadosapresentados com aumento de biomassa seca em decorrência do uso de glicerol nos cultivos realizados noserlenmeyers de 2 litros mostram-se muitos significativos para que futuramente o cultivo mixotrófico sejaempregado nos fotobiorreatores construídos no NPDEAS. Sendo assim, teremos possibilidade de aumentar aprodutividade ao substituir o cultivo autotrófico pelo cultivo mixotrófico. O interesse em saber qual a influência do uso do glicerol no início e durante o cultivo se deve ao fato deque nos fotobiorreatores os cultivos podem ser realizados em regime contínuo, semicontínuo, ou em batelada.No primeiro teste que será realizado no fotobioreator, será adotado o regime em batelada, sem diluição com aintrodução de novo meio que se dá após alguns dias quando as microalgas atingem a taxa máxima decrescimento. De acordo com os resultados obtidos neste experimento pode-se concluir que o regime de embatelada com adição de glicerol no início do cultivo nos fotobioreatores pode atingir uma produtividade deaproximadamente 30% a mais, que num cultivo autotrófico. Novos experimentos são necessários para avaliaçãodos efeitos do glicerol em regimes de cultivo contínuos e semicontínuos.
  6. 6. Figure 4 – Fotobioreator construído no NPDEASFigure 4 – Photobioreactor built in NPDEASCONCLUSÃO A concentração de biomassa da microalga Phaeodactylum tricornutum pode ser aumentada pela adiçãode glicerol como fonte de carbono orgânico. Esse fato comprova a capacidade metabólica dessa microalga deconverter fontes orgânicas de carbono em biomassa. A maior concentração de biomassa (1,29g/L) foi obtida comadição de glicerol na concentração de 0,15M ao meio de cultivo, em modo batelada, com iluminação de 5500luxem meio Guillard modificado. Assim, os resultados indicam que a produção de glicerina proveniente do processode biodiesel pode ser aproveitada para obtenção de biomassa da microalga P. tricornutum com melhoresresultados que o cultivo autotrófico. Sugere-se que o mesmo experimento seja realizado em regime defotoperíodo de 12 horas e que adição de fonte de carbono seja realizada no início do ciclo noturno, deixandocarbono disponível para a microalga não sendo necessário que ela consuma sua reserva. Estudos com glicerinabruta proveniente do processo de produção de biodiesel também são indicados.AGRADECIMENTOS O NPDEAS agradece ao CNPq, CAPES e Nilko Metalurgia Ltda. pelo financiamento das pesquisas, aUFPR pela infraestrutura e ao Grupo Integrado de Aquicultura (GIA – UFPR) pelo espaço de trabalho e preparodo inóculo.REFERÊNCIASANDRADE, M. R., & COSTA, J. A. Cultivo da microalga Spirulina plantensis em fontes alternativas denutrientes. Ciência Agrotec. , 1551-1556. (2008).
  7. 7. CERÓN GARCIA, M. C.; F. GARCÍA CAMACHO; A. SÁNCHEZ MIRÓN; J. M FERNÁNDEZ SEVILLA;Y. CHISTI; E. MOLINA GRIMA. Mixotrophic production of marine microalga Phaeodactylum tricornutum onvarious carbon sources. J. Microbiol. Biotechnol v. 16, n.5, p. 689-694. (2006).CERÓN GARCIA, M. C.; F. GARCÍA CAMACHO; J. M FERNÁNDEZ SEVILLA; F. G. ACIÉNFERNÁNDEZ, E. MOLINA GRIMA. Mixotrophic growth of Phaeodactylum tricornutum on glycerol: growthrate and fatty acid profile. J. of Applied Phycology. v. 12, p. 239-248. (2000).CERÓN GARCIA, M. C.; A. SÁNCHEZ MIRÓN; J. M FERNÁNDEZ SEVILLA; E. MOLINA GRIMA; F.GARCÍA CAMACHO. Mixotrophic growth of the microalga Phaeodactylum tricornutum Influence of differentnitrogen and organic carbon sources on productivity and biomass composition. J. Process Biochemistry. v.40, p.297-305. (2005).GARCÍA, SANCHÉS, J.L.; E MOLINA GRIMA, F. GRACÍA CAMACHO, J. A. SÁNCHEZ PÉREZ; D.LÓPEZ ALONSO. Estudio de macronutrientes para La producción de PUFAs a partir de La microalga marinaIsochysis galbana. Grasas Aceites Sevilla. v.45, p. 323-332. (1995).MARIANO, A. B.; TORRENS, J. SATYANARAYANA, K. G. Energia auto-sustentável a partir de biodieselderivado de microalgas. In: 4º Congresso Internacional de Bioenergia, 2009, Curitiba. 4º CongressoInternacional de Bioenergia; 1º Congresso Brasileiro de Geração Distribuída e Energias Renováveis, 2009.PENTEADO, D. M. R. Estudos de otimização do meio de cultura para a microalga Phaeodactylum tricornutumpara produção de lipídios. Dissertação de Pós-Graduação em Bioquímica. Curitiba, 2010.RADMANN, E.; OLIVEIRA, C. F.; ZANFONATO, K.; VIEIRA, J. A. Cultivo Mixotrófico da MicroalgaSpirulina sp. LEB-18 com Adição Noturna de Diferentes Fontes de Carbono Orgânico. XVII Simpósio Nacionalde Bioprocessos. Natal-RN, 2009SOARES, D. Avaliação do crescimento celular e da produtividade de lipídeos de microalgas marinhas emdiferentes regimes de cultivo. Dissertação de Pós-Graduação em Bioquímica. Curitiba, 2010.

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