O documento descreve estudos sobre os efeitos do óxido nítrico (NO) nas correntes ativadas pelo neurotransmissor GABA em culturas de células amácrinas da retina. O NO pode promover aumentos moderados ou grandes mudanças na reversibilidade do potencial de GABA, alterando a função dos receptores de GABA de inibição para excitação. Essas mudanças ocorrem independentemente dos íons de cloreto extracelular e parecem envolver a liberação de cloreto armazenado internamente.

1. MSc. Monica Gomes Lima Doutoranda em Neurociências e Biologia Celular monicasafira@gmail.com monicalima@ufpa.br Agosto- 2011

2. Amácrinas: Retina interna: conecções com bipolares, ganglionares e outras amácrinas – influenciam diretamente sobre o sinal de saída da retina; Funcionamento e regulação de células amácrinas – crítico para o entendimento do processamento do sinal pela retina.

3. Introdução NO é a molécula sinalizadora mais difundida encontrada na retina: Imunomarcação para NOS-1: fortemente marcada em células amácrinas (Ding & Weinberg, 2007); Influência fisiológica: NO ativa a guanilato ciclase solúvel (GCs) para promover a síntese de GMPc.

4. Introdução NO e a retina interna: Reduz o acoplamento, via junções gap, entre AII e bipolares dos cones e dos bastonetes (Mills & Massey; 1995); NO diminui a função do receptor GABAA em cultura de amácrinas (Wexler et al., 1998) – NO diminui a função dos receptores GABAA, pois PKG diminui as correntes de GABA; Função do NO na retina: ??? Essa inibição é dependente da concentração de NO? Influencia no potencial de reversão do GABA (EGABA)?

5. MATERIAIS E MÉTODOS Cultura de Células: Cultura de Retina 6-14 dias (EE 14 – PE 1) Madura após 6 dias de plaqueadas: Canais controlados por ligante e por voltagem + sinapses GABAergicas com outras amácrinas. Embrião de galinha 8 dias Dissociação: 0,1% tripsina Tratadas com 0,1mg poly-L-ornithine/ml Cultivadas em DEMEM + 5% soro bovino fetal, penicilina, estreptomicina e 2mM de glutamina Alimentadas: 2-3 dias – Neurobasal® Medium (B-27, penicilina, estreptomicina e glutamina)

6. MATERIAIS E MÉTODOS Cultura de Células: Embrião de rato 18 dias Cultura de hipocampo Dissociação: 0,1% tripsina Tratadas com 0,1mg poly-L-ornithine/ml Cultivadas em DEMEM + 5% soro bovino fetal, penicilina, estreptomicina e 2mM de glutamina Alimentadas: 2-3 dias – Neurobasal® Medium (B-27, penicilina, estreptomicina e glutamina) 4-7 dias (EE 22– EE 25)

7. MATERIAIS E MÉTODOS Eletrophysiology: Amplificador Axopatch 1-D; Na pipeta de vidro havia 3 M KCl – contato com a cultura; Resistência da pipeta: Rompimento: 3-5Ω - SUCÇÃO; Perfuração: 5-10Ω – anfotericina B ou gramicidina (formam pequenas perfurações na membrana); Rompimento x Perfuração - efeitos na mudança de EGABA: P = 0.999; Os dados do ‘Voltage ramp’ eram subtraídos da corrente de vazamento.

8. MATERIAIS E MÉTODOS Soluções: Aplicações de GABA: 10-20 ms (controlado por computador); Diferenças nas soluções internas e externas às células: Ruptura: Interna: Cs+ + creatina fosfocinase + sal de dipotássio de ATP + sal de disódio de ATP + fosfocreatina + sal de disódio de GTP; Externa: TTX (300 nM – bloqueia canais de Na+) e LaCl3 (25-50 µM – bloqueia canais de Ca2+) – voltage clamp. Perfuração: anfotericina B ou gramicidina à solução interna. SNAP: doador de NO; NOC-12: doador de NO potente; NOC-18: doador de NO – lentamente; CARBOXY-PTIO: sal que elimina NO da reação; ODQem 10 mM de DMSO: inibidor da sGC e compete com NO pelos mesmos sítios de ligação; Furosemida e bumetanidaem 300 mM de DMSO;

9. MATERIAIS E MÉTODOS ‘NO-bubbled’: quantificar NO Soluções com SNAP: 15 min em solução com argônio > filtrado em soda lime (Hidróxido de sódio, potássio e cálcio e água) > protegida da luz ISO-NO meter (NOMK2 system) com eletrodo ISO-NOP (World Precision Instrument, Sarasota, FL); Solução com 250 µM SNAP = ~ 100 nM de NO; Injeções 10-50 µl promovia mudanças de 15-35 mV – duravam de 1-3s com a maior parte do No chegando nos primeiros 500 ms. Soluções de NO expostas ao ar: ‘NO-bubbled’ exposta ao ar por 10-30 min; Soluções livre de NO eram usadas como controle.

10. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3 efeitos do NO nas correntes ativadas por GABA: 1º) Moderadas concentrações de doadores de NO promovem moderados aumentos nas correntes ativadas por GABA; Aumenta a função do receptor GABAA – maior inibição Não é capaz de reverter EGABA Ruptura da membrana: canais de Na+ (solução externa) e K+ bloqueados (TEA e Cs+)

11. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3 efeitos do NO nas correntes ativadas por GABA: 2º) Em altas concentrações de NO (centenas de nM ou µM) produz uma mudança temporária (1-3 s) no EGABA; Efeito sinérgico NO + GABA NO +O2= N2O4 (tetróxido de dinitrogênio) N2O4 + água = ácido nítrico Ruptura da membrana: K+ bloqueados (TEA e Cs+)

12. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3 efeitos do NO nas correntes ativadas por GABA: 3º) Altas concentrações de NO alteram a função dos receptores GABAA: de inibição para excitação. Corrente dependente de NO e independente de GABA – em altas concentrações de NO mudança = 24.8 ± 4.2 mV

13. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3 efeitos do NO nas correntes ativadas por GABA: 3º) Altas concentrações de NO alteram a função dos receptores GABAA. Aumento de EGABA é seguido pelo aumento na amplitude da corrente.

14. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3 efeitos do NO nas correntes ativadas por GABA: 3º) Altas concentrações de NO alteram a função dos receptores GABAA: de inibição para excitação. GCs não tem atividade relacionada com a mudança EGABA induzida por NO.

15. RESULTADOS E DISCUSSÃO NO induz mudanças no EGABA devido à elevação do Cl- citosólico Por que o NO induz mudança na EGABA? Há mudança na seletividade à ions pelos receptores GABAA? Ânions internos: Cl- e acetato Troca acetato por metanosulfonato.

16. RESULTADOS E DISCUSSÃO NO induz mudanças no EGABA devido à elevação do Cl- citosólico 2) Há o mesmo efeito na administração de GABA e Glicina? Inibitórios; Ligados à Cl- NO aumenta a função do receptor de glicina NO promove uma despolarização do Vm

17. RESULTADOS E DISCUSSÃO A mudança promovida por NO é capaz de ser transmitida por sinapses Sinapses de células amácrinas GABAérgicas são normalmente inibitórias Para fora Para dentro - excitatória Produz tanto a corrente como a despolarização Despolarização

18. RESULTADOS E DISCUSSÃO NKCC não media o aumento no Cl- citosólico Qual o mecanismo que sustenta o aumento de Cl- citosólico (ECl-)? Qual o papel do NKCC e KCC2 no efeito induzido por NO? Co-transportadores de Cl-: NKCC (1Na+, 1K+, 2Cl-) e KCC2 (1K+ e 1Cl-) > ↑NKCC ↓KCC2 Perfuração: inibidores do co-transporte bumetanida (NKCC) e furosemida (KCC2) ECl- mais negativo

19. RESULTADOS E DISCUSSÃO NKCC não media o aumento no Cl- citosólico Participação de outros íons que possam ser co-transpostados por NKCC e KCC2 e participem da mudança do ECl- Reversão rápida do controle para 0 K+ A mudança ocorre na mesma magnitude – íons não influenciam na mudança.

20. RESULTADOS E DISCUSSÃO NKCC não media o aumento no Cl- citosólico Participação de outros íons que possam ser co-transpostados por NKCC e KCC2 e participem da mudança do ECl- Os outros íons não participam da mudança no ECl-

21. RESULTADOS E DISCUSSÃO Mudanças no ECl- são independentes do Cl- extracelular Endossomos: altas concentrações Cl- > matém alta a amplitude da corrente para dentro Esse Cl- armazenado é o responsável por mudanças nos ECl-? reduzir concentrações de Cl- externo – igualar às concentrações internas ECl- = 0 mV NO induz a redistribuição de Cl- na ausência de gradiente eletroquímico Correntes de GABA dependem do Cl- externo, mas de NO não.

22. RESULTADOS E DISCUSSÃO Mudanças no ECl- são independentes do Cl- extracelular Em 0 Cl- A mudança no ECl- é resultado da ação do NO

23. RESULTADOS E DISCUSSÃO NO promove a liberação de ECl- de uma fonte interna A força de que direciona Cl- diminui Igualou concentrações de Cl- internas às externas

24. RESULTADOS E DISCUSSÃO A mudança do ECl- ocorre por um mecanismo exclusivo das células amácrinas? Células do hipocampo de rato 0 Cl- externo 0 Cl- externo durante aplicação de NO Corrente para dentro dependente de NO.

25. RESULTADOS E DISCUSSÃO Papel do NO na retina Outras Amácrinas Bipolares GABAérgica ou Glicinérgica Altas concentrações Consistente com Wang et al. (2003) – diminuição da resposta de células ganglionares à luz se dá por por alterações no sinal de entrada (possivelmente vindos das células amácrinas.

26. http://www.slideshare.net/monica_lima/hoffpauir-et-al-2006 monicasafira@gmail.com monicalima@ufpa.br