1) O documento descreve um estudo sobre o envolvimento do óxido nítrico em parâmetros de fertilidade masculina, analisando a contractilidade do canal deferente de ratos e a motilidade de espermatozóides humanos após inibição da óxido nítrico sintase. 2) O óxido nítrico é produzido por três isoformas da óxido nítrico sintase e desempenha um papel importante no sistema reprodutor masculino, modulando a contração do canal deferente e a vasodilatação durante a

1. ESTUDO DO ENVOLVIMENTO DO MONÓXIDO DE
AZOTO EM ALGUNS PARÂMETROS DE FERTILIDADE
MASCULINA
Marco Pinto-Filipe, Rui Pinto, Beatriz Silva-Lima
Unidade de Farmacologia e Farmacotoxicologia
Faculdade de Farmácia – Universidade de Lisboa
Av. das Forças Armadas ~ P-1649-019 Lisboa ~ Portugal
Lisboa, 27 de Janeiro de 2003
Projecto 3.3.1.02/03-1 (Disciplina de Projecto I)

2. 2
1. Título do Projecto
ESTUDO DO ENVOLVIMENTO DO MONÓXIDO DE AZOTO EM
ALGUNS PARÂMETROS DE FERTILIDADE MASCULINA
Abstract: Nitric Oxide(NO) is involved in several physiological systems, namely the ones
related to male fertility. NO is synthesized from L-arginine by a family of enzymes known as the
nitric oxide synthases (NOS). There are 3 isoforms of NOS, present in spermatozoa and in all
structures of the male reproductive system. In order to contribute to the clarification of the role
of nitric oxide synthase/soluble guanylate cyclase pathway in the male reproductive system, we
analysed the phenylephrine(Phe)-induced contractility of the vas deferens, and the effect of the
inhibition of NOS in human spermatozoa motility.For the vas deferens contractility analysis we
used male Wistar rats, weighing 220-250g that were anaesthetised with ether and then
sacrificed by exsanguination. A portion of the vas deferens was removed, cleaned of
surrounding tissue and placed in 20ml Mg
2+
-free Krebs-Henselheit solution organ baths with the
following composition: NaCl 113mM, NaHCO3 29mM, KCl 4.7mM, KH2PO4 1.2mM, CaCl2
2.5mM and Glucose 11.5 mM aired with 95% O2 and 5% CO2 and kept at 37ºC. The
preparations were allowed to stabilize for 30 min before the addition of increasing
concentrations of Phe(1-32µM) for construction of concentration-response curves. Isometric
responses were recorded using a force transducer (TRI 201 – LETICA) connected to a LETICA
2006 polygraph. Each preparation was used for two successive curves, with 30 min. of
stabilization between them, the first in absence (control curve) and the second in presence of a
NOS inhibitor, N
G
-Nitro-L-Arginine Methyl Esther (L-NAME) (0,1 and 0,01µM). Concentration-
effect curve parameters, Emax and EC50%, were obtained by Michaelis-Menten Kinetics using the
Enzfitter software. For the sperm analysis, human sperm was obtained by masturbation after 3-
4 days of sexual abstinence from donors of normal sperm concentration and motility. All
samples were allowed to liquefy for at least 30 min. at 37ºC, and were evaluated for sperm
concentration, motility and morphology according to World Health Organization guidelines. Each
sample was used in presence of a NOS inhibitor, L-NAME (5 and 50 µM), and with NaCl 0,9%
(PS).Results were compared by a t-student bilateral test with a significance level of 95%.
Differences were considered statistically significant when p<0,05. All NOS inhibitors reduced the
Phe Emax. L-NAME maintained the sperm motility higher than PS. The reduction of the Phe-
induced contractility obtained in consequence of the inhibition of the NO/GC pathway suggest
that, in the rat vas deferens, despite its well identified relaxant properties, NO potentiates the
contractility induced by adrenergic stimulation. NOS inhibition in human sperm maintained
spermatozoa motility, suggesting that NO acts as a toxic element that can, possibly by a lipid
peroxidation mechanism, be a threat to male fertility.

3. 3
2. Introdução e Objectivo
2.1 - Introdução
2.1.1 – O Monóxido de Azoto e suas funções fisiológicas
O monóxido de azoto (NO) é actualmente uma das moléculas mais estudadas
nas ciências biomédicas devido à multiplicidade de funções que possui nos mais
variados sistemas fisiológicos, e pelo papel que pode desempenhar no
desenvolvimento de novos fármacos.
O NO é sintetizado a partir da L-Arginina, pelas enzimas sintetases do NO
(NOS). Esta reacção requer um número de cofactores, nomeadamente a b-
nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH), a flavina mononucleótido (FMN), a
flavina adenina dinucleótido (FAD) e a tetrahidrobiopterina (H4B), assim como a
calmodulina e o próprio cálcio1
. O oxigénio molecular é também usado nesta reacção,
que precede a síntese do intermediário Nω-hidroxiarginina e resulta na formação da L-
citrulina e do NO.2
Figura 1 – Sistema NOS – produção de NO, (AS) – Argininosuccinato sintase, (AL)-Argininosuccinato
liase
As NOS são heme-enzimas que têm sequências de aminoácidos (aa)
semelhantes à citocromo P-450 reductase e são as únicas proteínas conhecidas de
mamíferos que catalisam a reacção de hidroxilação e redução do NADPH.
Já foram descritos dois tipos de NOS, a constitutiva (NOSc) e a indutível (NOSi).
A NOSc foi primeiramente localizada no sistema nervoso (NOSn) e no endotélio
vascular (NOSe), embora se encontre expressa em várias células em diferentes

4. 4
órgãos do corpo.3
O NO gerado pelos neurónios actua como um neutrotransmissor,
enquanto que nos vasos, o NO induz a vasodilatação, inibe a agregação plaquetária4
e
regula a apoptose, entre outras funções.5
Ambas as NOS constitutivas, a NOSn e a NOSe, são cálcio- e calmodulina-
dependentes, e geram pequenas quantidades de NO, responsáveis pela modulação
de várias funções fisiológicas. Em determinadas condições, a actividade da NOSc é
aumentada devido a uma up-regulation da enzima pelas hormonas sexuais. Como na
NOSe a terminação NH2 tem em falta um domínio de 220 aa presente na NOSn, estas
isoformas diferem na sua massa molecular (130kD para a NOSe e 160kD para a
NOSn).2
Apesar de a NOSi ser também cálcio- e calmodulina- dependente, difere da
NOSe e da NOSn no sentido em que necessita de níveis muito menores de cálcio para
ser completamente activada, e parece ligar-se tão fortemente à calmodulina, que a
calmodulina forma uma subunidade constitutiva desta isoforma.6
Originalmente,
pensava-se que a NOSi só era induzida em condições patológicas, mas a sua acção
foi também identificada em determinados estadios fisiológicos, tais como a ovulação,
gravidez e parto.7
Estudos imunológicos com anticorpos α-NOSn, α-NOSe e α-NOSi revelaram que
estas enzimas estão presentes em quase todos os tecidos estudados, incluindo o
sistema reprodutor. Além disso, estas isoenzimas partilham uma homologia de aa de
cerca de 60%, e são codificadas por pelo menos 3 genes diferentes; nos humanos, os
genes responsáveis pela codificação da NOSe, NOSn e NOSi estão localizados,
respectivamente, nos cromossomas 7, 12 e 17.8
O NO possui a capacidade de, por um mecanismo dependente do Guanosina
Monofosfato cíclico (GMPc), relaxar as células musculares lisas (fig. 2). O NO
formado a partir da L-Arginina difunde-se entre as células e vai activar a Guanilato
Ciclase Solúvel (GCs). Esta, converte a Guanosina Trifosfato (GTP) em GMPc, o qual
promove a fosforilação de uma proteína cinase que, ao ser fosforilada, vai provocar a
redução da concentração de cálcio intracelular e o relaxamento da musculatura lisa
vascular e de outras estruturas tais como a árvore brônquica e no tracto urinário.9,10
No entanto, existem algumas estruturas musculares lisas em que a acção do NO tem
sido descrita como contracção. Tal é o caso do intestino onde Barthó & Lefebvre
observaram que a inibição da sintetase do NO induz a contractilidade induzida pela
acetilcolina10
e o canal deferente em que Pinto et al observaram um efeito semelhante
em preparações estimuladas com Fenilefrina.11

5. 5
Figura 2 – Efeito do NO na célula muscular lisa (smooth muscle cell). Depois de formado, o NO difunde-
se pelas membranas musculares, onde interage com a GCs (guan cyc), despoletando uma cascata de
reacções que conduzem à abertura dos canais de potássio, hiperpolarização da membrana celular e
inibição da contractilidade. (© Mayo Clinic)
Para além da modulação da contracção do canal deferente, a via da sintetase do
NO desempenha um papel importante no sistema reprodutor masculino. Com efeito, a
formação de NO após um estímulo sexual, conduz à vasodilatação dos seios
cavernosos e permite o afluxo de sangue que é responsável pela erecção. A partir
deste conhecimento foram já desenvolvidos vários fármacos com o objectivo de tratar
a disfunção eréctil. Estes fármacos têm uma acção inibitória da enzima responsável
pela degradação do GMPc nos corpos cavernosos, a Fosfodiesterase – 5 (PDE5),
permitindo assim a persistência de níveis de NO elevados e a consequente
vasodilatação nos seios cavernosos. O sildenafil (Viagra®) e o tadalafil (Cialis®)
actuam por este mecanismo e têm como indicação terapêutica a disfunção eréctil.12
2.1.2 – Intervenção farmacológica sobre a via da sintetase do NO
Várias estratégias são utilizadas para analisar o envolvimento da via da NOS e
do NO na modulação de determinadas funções fisiológicas:
1) avaliação da produção de NO nas estruturas envolvidas
2) efeito do aumento da formação de NO sobre essas funções, utilizando
moléculas dadoras directas de NO, como o SIN-1(3-morfolinosidnonimina) ou
percursores de L-Arginina.

6. 6
3) efeito da inibição de sintetases do NO com análogos da L-Arginina, como o NG
-
Nitro-L-Arginina Metil Éster (L-NAME), NG
-Nitro-L-Arginina (L-NOARG), NG
-
Nitro-MonoMetil-L-Arginina (L-NMMA).
4) efeito da redução do GMPc com inibidores da GCs, como o ODQ (1H-(1,2,4)-
oxadiazol-(4,3-a)quinoxalin -1-ona).
5) efeito do aumento do GMPc com inibidores de fosfodiesterases, como o
sildenafil.
2.1.3 – O Monóxido de Azoto no sistema reprodutor masculino
Os trabalhos de Middendorff et al. revelaram que a NOS está presente nas várias
estruturas constituintes do sistema reprodutor masculino. Foram encontradas as
isoformas nNOS e eNOS nas células endoteliais de vasos sanguíneos, em células
musculares lisas dos mesmos vasos, nos tubos seminíferos (células de Sertoli) e nas
células de Leydig. O NO, como é lipofílico, tem a capacidade de se difundir livremente
através das membranas celulares, o que permite que estas estruturas se influenciem
entre si.13
A eNOS também se encontra no epitélio do epidídimo e do canal deferente.
A expressão desta isoforma também é encontrada em espermatócitos e
espermátides.14
Figura 4 – Representação esquemática dos sistemas NOS nas células de Leydig (Leydig cell), vasos
sanguíneos testiculares (blood vessel) e tubos seminíferos (seminiferous tubule). Estes sistemas
influenciam as células de Leydig na produção de testosterona (testosterone), relaxamento (relaxation) dos
miofibroblastos peritubulares dos tubos seminíferos e a dilatação dos vasos sanguíneos testiculares. (+)
indica a livre difusão do NO através das membranas das várias estruturas. (adaptado de Middendorff et al
13
).

7. 7
2.1.4 - O canal deferente
O canal deferente é um canal especializado, um tubo muscular que transporta
espermatozóides do epidídimo para o ducto ejaculatório. A parede muscular deste
canal é marcadamente espessa em proporção ao diâmetro do lúmen. Esta parede
está organizada em 3 camadas musculares, sendo a mais externa e a mais interna de
fibras lisas longitudinais, e a camada intermédia de fibras circulares. O lúmen do canal
consiste numa mucosa, com uma lâmina própria com um epitélio secretor, pseudo-
estratificado colunar, com cílios apicais.9
A contracção do canal deferente é de extrema importância na progressão dos
espermatozóides durante o processo de ejaculação. Deste modo, o estudo in vitro da
contractilidade deste estrutura, utilizando-se diferentes fármacos com acção sobre a
NOS, permite-nos concluir quanto ao envolvimento desta via no canal deferente e,
consequentemente, sobre a fertilidade masculina.
Figura 3 – Estrutura do canal deferente. A - podemos observar as 3 camadas de tecido muscular. B - o
lúmen do canal deferente, exibindo-se a lâmina basal (basal cell layer) e o epitélio pseudo-estratificado
colunar (columnar cell layer), com cílios apicais.
2.1.5 - O Espermatozóide
A morfologia do espermatozóide é complexa. A cabeça, contém o acrossoma e o
núcleo. O acrossoma é uma saco que encapsula o núcleo, que possui enzimas
hidrolíticas que são libertadas durante a “reacção do acrossoma” e ajudam na
penetração do espermatozóide no óvulo. 15
BA

8. 8
A cauda contém um axonema, com pares de microtúbulos (9+2 ao centro) e
fibras densas externas (dineína e nexina). Segmentos diferentes da cauda são
delineados por estruturas adicionais. A peça intermédia contém uma hélice
mitocôndrial, enquanto que a peça final (o flagelo propriamente dito) contém apenas o
axonema.9
Figura 5 – Estrutura do espermatozóide. A peça intermédia contém uma hélice formada por mitocôndrias,
onde é obtida a energia para o movimento flagelar. (adaptado de Saleh et al
22
)
O movimento do espermatozóide é possível devido à estrutura do seu flagelo. Na
origem do movimento está o deslizamento dos microtúbulos do axonema, uns sobre
os outros, num ciclo mecânico-químico de ligar e desligar sucessivos dos filamentos
de dineína sobre o microtúbulo vizinho, deslizamento esse transformado em curvatura
com a forma e rapidez de deslocamento produzidos pela propagação de uma onda.
Este movimento depende da maturação da célula. O aumento dos níveis de AMPc é o
responsável pela iniciação do movimento, ainda que o cálcio regule a forma e a
amplitude da curvatura. Estes mensageiros actuam por intermédio de fenómenos de
fosforilação das proteínas do axonema. Anomalias nestas estruturas podem originar
discinésias e esterilidade. 16

9. 9
Figura 6 – Esquema-resumo dos principais factores implicados na regulação do movimento flagelar. Os
movimentos iónicos através da membrana plasmática permitem modificações de pH e de concentração
de cálcio intracelulares, que regulam a actividade dos sistemas de fosforilação-desfosforilação activos
sobre as proteínas do axonema, produzindo deslizamento intertubular e curvatura flagelar. O anião
bicarbonato HCO3
-
, indispensável à hiperactivação do espermatozóide, pode destabilizar a membrana
plasmática e activar a adenil ciclase (AC), e assim a síntese de Adenosina Monofosfato cíclico (AMPc)
que, activando a fosforilação, pode também aumentar a entrada de cálcio extracelular. O pH intracelular
(pHi), modulado pela entrada de bicarbonato e pelo antiporte sódio/protão, é igualmente um importante
regulador do movimento dos espermatozóides, agindo sobre o cálcio intracelular e a síntese de AMPc. Os
receptores (R) ligados a proteínas G (G) existem ao nível dos espermatozóides. Estes podem também
estar ligados a canais de cálcio e à adenil ciclase. (PDE – fosfodiesterases; PTP – fosfatases)
2.1.6 - Isoformas da NOS em Espermatozóides
Anteriormente a 1996, não havia nenhuma evidência que os espermatozóides
poderiam gerar NO. Foi então descoberto que a NOS estava presente tanto nos
espermatozóides humanos como nos de rato. No rato, a NOS era observada no
acrossoma e na cauda de espermatozóides anormais. Esta localização na cabeça
desaparecia depois de serem tratados, sugerindo que a NOS teria um papel
importante na capacitação.14
Contrariamente, nos espermatozóides humanos, a nNOS e a eNOS foram
encontradas nos segmentos pos-acrossomal e equatorial, mas não no flagelo.
Reacções imunológicas utilizando anticorpos α-NOS foram mais intensas em
indivíduos com normospermia (todos os parâmetros normais) quando comparadas

10. 10
com as reacções em indivíduos astenospérmicos (com diminuição da capacidade de
movimento espermático), que tinham pouca ou nenhuma imunorreactividade ao NO.
A presença da NOS nos espermatozóides foi, subsequentemente, confirmada
por Western-Blot. Em condições normais, uma banda correspondente a uma proteína
com 145kD foi reconhecida depois de incubada com um anticorpo α-eNOS.18
2.1.7 - Metabolismo do NO e Possíveis Mecanismos de Acção nos Espermatozóides
Embora inicialmente se pensasse que os efeitos do NO só seriam mediados via
activação da GCs e subsequente formação de GMPc, estudos mais recentes indicam
que o NO pode também induzir os seus efeitos por vias alternativas a esta. Como tem
uma semi-vida curta (<30 segundos), e uma enorme reactividade, foi demonstrado que
o NO reage com o oxigénio, anião superóxido, grupos sulfidril e metais de transição
(grupos heme, centros ferro-enxofre nas proteínas, etc.).
Nos mamíferos, alguns estudos sugerem o mecanismo de acção proposto na
fig.7.20
Recentemente foi também demonstrado que o NO participa na capacitação do
esperma humano e na fosforilação de resíduos de tirosina por interacção com uma via
do AMPc.21
Baixas concentrações de NO aumentam a concentração de AMPc, por
estimulação da actividade da Adenil Ciclase.
Outro aspecto importante do NO é a sua faceta de molécula efectora com
propriedades citotóxicas, não só pela sua acção directa, mas também pela interacção
com o anião superóxido, formando-se o anião peroxinitrito (ONOO-
), que é também
muito reactivo, induzindo a oxidação de grupos sulfidrilo e tioéster, e a nitração e
hidroxilação de substâncias de núcleo aromático como a tirosina, que também regulam
a peroxidação lipídica.22,23
Como os espermatozóides produzem tanto o anião superóxido como o NO, a
formação do anião peroxinitrito é possível nestas células.

11. 11
Figura 7 – Vias de transdução de sinal que podem estar envolvidas na capacitação de espermatozóides
induzida pelo NO. Nos espermatozóides de mamíferos, há uma estimulação da produção de NO pela
acção da cNOS, durante a capacitação. O influxo de cálcio, que ocorre imediatamente no início deste
fenómeno, pode activar a cNOS. Um aumento dos níveis de NO pode então activar, directa ou
indirectamente, a adenil ciclase espermática (AC), com o consequente aumento dos níveis de cAMP.
Além disso, o NO pode activar a ciclooxigenase (COX), resultando num aumento da produção de
prostaglandinas. Ainda não está estudado, mas é possível que, durante a capacitação, o NO transforme
lípidos, ou module enzimas como as fosfodiesterases de nucleótidos cíclicos (PDEs), proteína tirosina
cinases (PTKs), fosfatases (PTPs), ou uma combinação destas, porque estas enzimas são muito
sensíveis à oxidação. (+) indica regulação positiva; (-) indica regulação negativa. PKA – proteína cinase A
(adaptado de Herrero et al
20
)
2.1.7 – Análise de Esperma - Espermogramas
O intervalo de abstinência sexual é de grande importância para o estudo do
sémen. Em cada dia de abstinência (até uma semana), o volume seminal aumenta
em 0,4 ml, a concentração espermática em 10-15 milhões de espermatozóides por ml
e a contagem espermática total em 50-90 milhões. A motilidade e a morfologia

12. 12
espermáticas aparentemente não são afectadas por períodos de abstinência de 5-7
dias, mas períodos mais longos levam a uma motilidade prejudicada.
O volume seminal deve ser tido em consideração quando se avalia a produção
total de esperma pelos testículos. O volume de sémen em si somente afecta a
fertilidade para valores inferiores a 1,5ml, já que o tamponamento contra a acidez
vaginal se torna inadequado, ou quando o volume já é superior a 5ml. Volumes baixos
podem estar associados a uma colheita incompleta, ejaculação retardada, obstrução
do ducto ejaculatório ou deficiência androgénica.
Uma concentração de espermatozóides de 20 milhões/ml constitui o limite
inferior de normalidade definido pela Organização Mundial de Saúde
A motilidade do esperma geralmente é avaliada de dois modos: a quantidade de
espermatozóides móveis (n.º espermatozóides móveis vs. n.º de espermatozóides
total) e a qualidade do movimento espermático expresso em função do n.º de
espermatozóides com progressão em linha recta, que se deseja superior a 50% para
ambos os parâmetros. A morfologia do esperma está sujeita a grandes variações e é
raro ver amostras que contenham mais de 80% de cabeças espermáticas
consideradas normais.17
Aliás, a avaliação microscópica do sémen pode ainda revelar
a presença de espermatozóides aglutinados entre si, a nível da cabeça ou da cauda.
Este fenómeno pode ter causa imunológica ou inflamatória.
Normalmente são avaliados os seguintes parâmetros:
a) concentração
b) motilidade absoluta e relativa
c) VAP – smoothed path velocity (velocidade media)
d) VCL – track speed (velocidade real – curvilinear)
e) VSL – progressive velocity (velocidade linear)
f) STR – straightness (VSL/VAP)
g) Morfologia
h) Índice de Anomalias Múltiplas (n.º de anomalias contadas/n.º de
espermatozóides contados)

13. 13
Figura 8 – Anomalias possíveis na morfologia do espermatozóide (sperm morphology); (normal oval form
– forma normal, oval), (abnormal sperm – formas anormais)
Figura 9 – Significado de VAP, VCL e VSL
Relativamente às alterações possíveis de ocorrer em termos de características
dos espermatozóides, temos:
a) azoospermia – ausência de espermatozóides
b) oligospermia – diminuição do número
c) teratospermia – alteração na forma
d) astenospermia – diminuição da capacidade de movimento
e) necrospermia – ausência de vitalidade
f) normospermia – parâmetros normais
2.2 - Objectivo
Uma vez que a via da sintetase do NO é utilizada como alvo terapêutico na
disfunção eréctil, no presente trabalho procurámos analisar a intervenção do NO ao
nível do sistema reprodutor masculino a dois níveis: i) sobre a motilidade dos
espermatozóides; ii) sobre a contractilidade do canal deferente.
A eventual intervenção do NO nos sistemas referidos poderá trazer
consequências na capacidade de progressão de espermatozóides e, portanto, na
fertilidade masculina.

14. 14
3. Materiais e Métodos – Parte Experimental
3.1 – Análise de Esperma - Espermogramas
3.1.1 – Efeito da inibição da NOS pelo L-NAME sobre a motilidade de
espermatozóides humanos
A fim de analisar o envolvimento do NO na mobilidade dos espermatozóides,
fomos estudar o efeito da inibição da sintetase do NO com L-NAME sobre aquele
parâmetro, em esperma humano.
3.1.2 – Amostras
As amostras de esperma foram obtidas por masturbação após 3-4 dias de
abstinência sexual, sendo escolhidos os dadores com quantidade de espermatozóides
e mobilidade normais.
3.1.3 – Reagentes
Para a análise de esperma, foram utilizados os seguintes reagentes: NG
-Nitro-L-
Arginina-Metil-Éster (L-NAME) – da SIGMA ALDRICH - Soro Fisiológico (NaCl
0,9%)(SF) – da B BRAUN MEDICAL.
3.1.4 – Método
Para o início da experiência, o esperma foi mantido pelo menos 30 min. a 37ºC
para assegurar a sua liquefacção. Em seguida, e em 4 eppendorfs para cada
determinação, 100 µl de esperma foram adicionados de 100 µl de SF (controlo) ou
100 µl de solução de L-NAME em SF. Para a determinação da motilidade, foi retirada
1 gota de cada amostra para uma câmara de contagem, e observada no miscroscópio,
ligado a uma câmara de vídeo e a um computador – método CASA (computer aided
sperm analysis).

15. 15
Figura 10 – Esquema de trabalho na realização dos espermogramas
3.1.5 – Contagem e motilidade do esperma
A contagem e motilidade do esperma foram analisadas, nas instalações da
Clínica Harmonia, em Lisboa, com um software da Hamilton Thorn Research, o HTM-
C MOTILITY ANALYSER v. 8.0, ligado a um microscópio de contraste de fase
negativo (espermatozóides brilhantes sobre um fundo escuro), numa câmara de
contagem Makler. Foram avaliados os seguintes parâmetros, ao longo do tempo:
• Concentração
• Motilidade
• VAP
• VCL
• VSL
• STR
• Morfologia
• Índice de Anomalias Múltiplas
3.2 – Análise do Canal Deferente - Contractilidade

16. 16
3.2.1 – Efeito da inibição da sintetase do NO na contractilidade do canal deferente de
rato
Foi efectuado o estudo das consequências da inibição da NOS com L-NAME na
contractilidade do canal deferente de rato, estimulado com Fenilefrina (Phe).
3.2.2 - Animais
Este estudo foi conduzido em ratos Wistar, machos, com pesos compreendidos
entre 250 e 350 gramas, provenientes da Harlan Ibérica. Os animais foram mantidos
durante um período nunca inferior a duas semanas no biotério de manutenção da
Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa, para aclimatação até obtenção do
peso mínimo exigido para a experimentação, à temperatura de 25ºC e com ciclos de
luz de 14 horas diárias, com dieta de manutenção, IPM-R20 (Letica). Tanto a dieta
como a água foram fornecidas ad libitum até ao dia da experiência.
3.2.3 - Preparações
Os ratos foram anestesiados com éter e sacrificados. Ambos os canais
deferentes foram removidos, limpos de tecido circundante e colocados numa solução
de Krebs-Henselheit, isenta de Mg2+
(pois este reduz a magnitude das respostas
contrácteis, por um mecanismo de antagonismo com o Ca2+
), arejada com 95% O2 e
5% CO2, a 37ºC.
3.2.4 – Construção das curvas concentração-resposta
Os canais deferentes inteiros foram montados em banhos de 20 ml.
Seguidamente, foram submetidos a um período de estabilização de 30 min. sob uma
tensão base de 500mg, e lavados de 15 em 15 min., antes da adição de Phe para a
construção das curvas concentração-resposta. As respostas foram registadas com um
transdutor TRI 201 – LETICA ligado a um polígrafo LETICA 2006.
3.2.5 – Reagentes
Para as curvas concentração-resposta, foram utilizados os seguintes reagentes:
NG
-Nitro-L-Arginina-Metil-Éster (L-NAME), NG
-Nitro-D-Arginina-Metil-Éster (D-NAME) e
Fenilefrina, da SIGMA ALDRICH. Todos os reagentes foram dissolvidos em água

17. 17
destilada e as soluções de trabalho feitas na solução de Krebs-Henselheit (NaCl
113mM, NaHCO3 29mM, KCl 4.7mM, KH2PO4 1.2mM, CaCl2 2.5mM e Glucose 11.5
mM). Foram tomadas as devidas precauções para evitar a exposição à luz das
soluções de Phe.
3.2.6 - Respostas Contrácteis induzidas pela Phe: validação do método
Para garantir que as preparações de canal deferente estavam estabilizadas no
princípio de cada curva concentração-resposta, foi usada uma concentração sub-
máxima de Phe (1-2 µM) até se obter respostas contrácteis que fossem reprodutíveis.
Cada preparação foi usada para 2 curvas sucessivas, com 30 min. de estabilização
entre elas, sendo a primeira (controlo) na ausência dos inibidores, e a segunda na sua
presença (teste).
A reprodutibilidade deste modelo foi testada usando este protocolo na ausência
de inibidores em 2 curvas sucessivas.
3.2.7 - Efeito da inibição da via NOS na contractilidade induzida pela Phe
Curvas concentração-resposta foram obtidas usando concentrações isoladas e
crescentes de Phe (1 – 32µM), aplicadas a cada 10 min., primeiro na ausência
(controlo), depois na presença de L-NAME (0,1 e 0,01 µM).
3.2.8 - Análise dos parâmetros
Os parâmetros que caracterizam as curvas concentração-resposta, Emax e EC50%,
foram calculados por uma regressão não-linear, usando um software específico
(Enzfitter). Os resultados são dados como média ± erro padrão, onde n designa o
número de preparações provenientes de diferentes animais.
3.3 - Análise estatística
As comparações entre os parâmetros das curvas concentração-resposta obtidas
e a motilidade dos espermatozóides nas diferentes situações experimentais foram
efectuadas pelo teste t de student para amostras emparelhadas. As diferenças foram
consideradas significativas para valores de p ≤ 0,05.
4. Resultados e Discussão

18. 18
4.1 - Análise de Esperma – Espermogramas
4.1.1 - Efeito da inibição da NOS pelo L-NAME sobre a motilidade de espermatozóides
humanos
Em duas análises efectuadas, obtivémos os seguintes resultados, relativamente
à percentagem de espermatozóides móveis:
4.1.1.1 – Amostra 1
Concentração – 200 milhões de espermatozóides/ml
Motilidade Absoluta:90%
Motilidades Relativas:
Rápidos – 55%
Médios – 20%
Lentos – 15%
Imóveis – 10%
VAP – 37 µm/seg.
VCL – 45 µm/seg.
VSL – 29 µm/seg.
STR – 76%
Morfologia:
Normais – 50%
Anomalia na cabeça – 40%
Anomalia peça intermédia – 2%
Anomalia cauda – 8%
Índice de Anomalias Múltiplas – 1,05

19. 19
Tabela 1 – Mobilidade absoluta dos espermatozóides na ausência e em presença de L-NAME 5µM, ao
longo de 240 minutos. Os valores representam a % de espermatozóides móveis nas amostras em estudo
Tempo (minutos) Soro Fisiológico (%) L-NAME 5µM (%)
0 81,5 ± 5,5 82,5 ± 4,1
120 65,75 ± 7,3 70,25 ± 6,9
180 73,25 ± 4,0 66,75 ± 7,3
240 46,75 ± 4,6 60,5 ± 3,7*
* p<0,05 vs Soro Fisiológico
Figura 11 – A – Mobilidade absoluta dos espermatozóides na ausência e em presença de L-NAME 5µM,
ao longo de 240 minutos.
4.1.1.2 – Amostra 2
Concentração – 180 milhões de espermatozóides/ml
Motilidade Absoluta:85%
*

20. 20
Motilidades Relativas:
Rápidos – 50%
Médios – 25%
Lentos – 10%
Imóveis – 15%
VAP – 36 µm/seg.
VCL – 48 µm/seg.
VSL – 27 µm/seg.
STR – 73%
Morfologia:
Normais – 35%
Anomalia na cabeça – 50%
Anomalia peça intermédia – 5%
Anomalia cauda – 10%
Índice de Anomalias Múltiplas – 1,14
Tabela 2 – Mobilidade absoluta dos espermatozóides na ausência e em presença de L-NAME 50µM, ao
longo de 180 minutos. Os valores representam a % de espermatozóides móveis nas amostras em estudo
* p<0,05 vs Soro Fisiológico
Tempo (minutos) Soro Fisiológico (%) L-NAME 5µM (%)
0 71,25 ± 8,5 82 ± 10,2
60 52,75 ± 2,7 79,5 ± 2,9
180 44,5 ± 4,2 75,25 ± 5,2*

21. 21
Figura 11 – B – Mobilidade absoluta dos espermatozóides na ausência e em presença de L-NAME 50
µM, ao longo de 180 minutos.
4.1.2 – Conclusão
O L-NAME favorece a manutenção da motilidade dos espermatozóides ao longo
do tempo.
4.2 - Análise do Canal Deferente – Contractilidade
4.2.1 – Efeito da inibição da sintetase do NO na contractilidade do canal deferente de
rato
Em seis canais deferentes estudados, obtivémos os seguintes resultados,
relativamente à contractilidade e determinação dos parâmetros das curvas
concentração-resposta:
4.2.2 - Respostas Contrácteis induzidas pela Phe: validação do método
Nas experiências para validação do método, não foram observadas diferenças
no Emax (1351±108 e 1333±101 mg, n=6) e na EC50% (2,1±0,3 e 2,7±0,4 µM) da Phe
nas duas curvas concentração-resposta sucessivas. Podemos então concluir que,
*

22. 22
neste modelo, as diferenças observadas entre a curva controlo e a curva teste nos
protocolos usados, devem estar relacionadas com os reagentes testados.
Tabela 3 – Parâmetros das curvas concentração-resposta na validação do método
4.2.3 - Efeito da inibição da via NOS na contractilidade induzida pela Phe
A Phe (1-32µM) induziu contracções concentração-dependentes no canal
deferente de rato. A Fig. 12 mostra as curvas concentração resposta obtidas na
ausência (controlo) e na presença de L-NAME (0,01 e 0,1 µM).
Podemos observar que a inibição da NOS induziu uma diminuição concentração-
dependente da contractilidade do canal deferente. Não se verificaram diferenças na
EC50%. Para justificar a estereoespeficidade dos resultados, também estudámos o
efeito do D-NAME (0,1µM) nos parâmetros das curvas concentração-resposta. Não
foram observadas diferenças no Emax e EC50% na presença do D-NAME (Emax 94±4,3%
do controlo, EC50% 1,6±0,3 µM) e as curvas controlo (Emax 100%, EC50% 1,2±0,1 µM).
Tabela 4 – Parâmetros das curvas concentração-resposta na inibição pelo L-NAME
*p<0,05 vs Controlo
Curva 1 Curva 2
Emax (mg) 1351±108 1333±101
EC50% (µM) 2,1±0,3 2,7±0,4
Controlo
L-NAME
0,1µM
L-NAME
0,01µM
Emax (%) 100 ? ?
EC50% (µM) 1,2±0,1 ?* ?

23. 23
Figura 12 – Efeito da inibição da NOS nas curvas concentração-resposta induzidas pela Phe: curvas na
ausência e na presença de L-NAME (0,01 e 0,1 µM); *p<0,05 vs. Control
4.2.4 - Conclusão
A contractilidade do canal deferente é diminuída pela presença de L-NAME, o
que sugere uma actividade pró-contráctil para o NO.
4.3 - Discussão
No presente trabalho, foi estudado o envolvimento da via NOS/sGC na
motilidade dos espermatozóides humanos e na contractilidade do canal deferente,
numa série de protocolos farmacodinâmicos.
As NOS, são enzimas ubiquitárias responsáveis pela geração de NO. O NO está
implicado num enorme número de processos fisiológicos, incluindo a
neurotransmissão, controlo do tónus vascular, produção de hormonas, apoptose e
agregação plaquetária ,etc. Estes acontecimentos fisiológicos ocorrem primariamente
como resultado da activação da sGC pela ligação do NO ao ferro do seu grupo heme.
Isto leva à acumulação do segundo mensageiro, o cGMP. Adicionalmente, estes
*

24. 24
acontecimentos mediados pelo NO podem resultar nas suas conhecidas propriedades
oxidantes.
Nos últimos anos, a formação de espécies reactivas de oxigénio (ROS) no
sistema reprodutor masculino tem-se tornado uma preocupação pelos seus potenciais
efeitos tóxicos na qualidade e função do esperma. As ROS são agentes altamente
oxidantes que pertencem à classe dos radicais livres. Um radical livre é definido como
“qualquer átomo ou molécula que possui um ou mais pares de electrões
desemparelhados”.24
Contudo, alguns autores descrevem que pequenas quantidades
de ROS são necessários aos espermatozóides para adquirirem capacidades
fertilizantes (capacitação) (Fig. 7).25
Os espermatozóides, como todas as células vivas
em condições aeróbias, encontram constantemente o paradoxo do oxigénio: é
necessário para as funções vitais, mas os seus metabolitos (ROS) podem modificar as
funções celulares, pôr em perigo a vida celular, ou ambas.
De qualquer modo, as ROS devem ser permanentemente inactivadas e deve-se
manter uma pequena quantidade necessária para manter as funções celulares
normais.
O L-NAME, inibidor da síntese do NO, foi capaz de manter a motilidade dos
espermatozóides ao longo do tempo. Esta manutenção revelou-se concentração-
dependente, pois a diferença de motilidades observadas entre os grupos tratados e os
grupos controlos aumentou com o aumento da concentração de inibidor.
Assim, podemos concluir que o NO tem um efeito nocivo na capacitação dos
espermatozóides, em termos de mobilidade. Como se pode explicar este efeito?
No espermatozóide, é viável a formação do ião peroxinitrito, um radical livre, pela
reacção do NO com o anião superóxido, e existem nos espermatozóides estruturas
com estrutura passível de ser oxidada por este mecanismo destrutivo. Dentro das
estruturas responsáveis pela manutenção da integridade física do espermatozóide e
pela respiração celular associada ao movimento flagelar e obtenção de energia,
temos a própria membrana da célula e as mitocôndrias, que se encontram distribuídas
em hélice, na peça intermédia.
Este parece ser o mecanismo que melhor explica o efeito observado pela
inibição da NOS.

25. 25
Para melhor compreender todos os mecanismos onde o NO demonstra a sua
actividade, seria relevante verificar os efeitos na mobilidade dos espermatozóides com
os seguintes fármacos (ou análogos):
a) Sildenafil (ou outro inibidor das PDE)
b) SIN-1 (dador de NO)
c) D-NAME (enantiómero supostamente inactivo)
d) ODQ (inibidor da GC)
No canal deferente, a Phe foi capaz de induzir respostas contrácteis
concentração-dependente que diminuiram na presença de qualquer um dos inibidores
da NOS utilizados, L-NAME e L-NMMA, mas não no D-NAME.
A estereosespecificidade da acção do L-NAME e a semelhança qualitativa dos
efeitos dos inibidores da NOS, apontam fortemente para o envolvimento, no canal
deferente de rato, da via NOS/sGC e do NO na estimulação adrenérgica.
Contudo, o efeito do NO, como sugerido pelos resultados, resultou num
aumento, em vez de uma diminuição da contractilidade, o que seria de esperar tendo
em conta as propriedades relaxantes que já estão bem descritas no músculo liso.
Este tipo de propriedades já foram também descritas por outros autores, mas no
intestino delgado de rato. Barthó & Lefebvre descreveram um efeito pró-contráctil para
o NO. Mostraram que tal efeito poderia ser devido à libertação de noradrenalina
induzida pelo NO, a partir das terminações colinérgicas.10
Resumindo, o L-NAME, ajuda na manutenção da mobilidade dos
espermatozóides, significando que o NO a prejudica. Por outro lado, o NO aumenta a
contractilidade do canal deferente, o que é positivo. Este será porventura um
mecanismo de compensação do NO (homeostasia).
A estimulação da NOS no canal deferente e no esperma pode diminuir a
progressão e a motilidade espermática, mas aumenta a capacidade de erecção!

26. 26
Em conclusão, este estudo demonstra que a molécula de monóxido de azoto tem
uma grande multiplicidade de papéis no sistema reprodutor masculino e na sua
fertilidade.
Deste modo, a terapêutica direccionada às estruturas-alvo onde esta molécula
actua, ou de onde provém, poderá ser útil para o tratamento de disfunções do sistema
reprodutor masculino e influenciar positivamente factores que o poderão tornar mais
fértil.

27. 27
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