Diagnóstico Laboratorial de Anemias Hereditárias

Diagnóstico Laboratorial
Anemias Hereditárias
Prof. Paulo Roberto de Melo Reis

Conteúdo do eritrócito
250 a 350 milhões de moléculas de
hemoglobina
Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

Genética da hemoglobina
Cadeia beta Cadeia alfa 141 aa146 aa

Hemoglobinas fisiológicas
A combinação de duas
cadeias alfa ( α ) com
duas beta ( β ) formam
as hemoglobinas.
Portanto, a hemoglobina
tem estrutura
tretamérica.
α2β2

Tipos de Hb após 6 meses de
vida
Tipos de Hb Composição Concentração
A α2β2
96 – 98%
A2 α2δ2
2 – 4%
FETAL α2γ2
0 – 1%
Dados: Paulo César Naoum – Hemoglobinopatias e Talassemias

ANEMIA
TRATAMENTO
Avaliação entre 30 e 60 dias
Responsiva Não responsiva
Cura
Refratária ao tratamento
Anemia hereditária
Talassemia ( alfa,
beta)
Hemoglobinopatia
Anemia adquirida
Sideroblástica
Conduta terapêutica na anemia microcítica hipocrômica
Ferro Normal
e ferritina

É um grupo heterogêneo de distúrbios hereditários
que ocorre por alterações gênicas dos
cromossomos e que apresentam como
conseqüência alterações de membrana,
deficiência de produção enzimática e de
preenchimento hemoglobínico do eritrócito,
tanto qualitativa quanto quantitativamente.

A história familiar e descendência tomam
caráter decisivo na elucidação das
anemias hereditárias, em especial as
hemoglobinopatias e talassemias.

Defeitos de
membrana
Esferocitose
Ovalocitose
Estomatocitose
Defeitos
metabólicos
Piruvato quinase
Pirimidina 5-
nucleotidase
G-6-FD
Glutitiona redutase
Defeitos na
hemoglobina
Síntese deficiente:
Talassemia α; β
Variantes anormais:
HbS,
HbC

Prevalência de anemias
hereditárias no Brasil
Talassemia alfa– mínima 20 - 25%
Talassemias alfa – menor 3 – 6%
Deficiência de G6FD 3% em brancos
15% em negros
Hb AS 2% em brancos
10% em negros
Talassemia Beta menor
- Descente de Italiano
1%
6%
Hb AC 0,5 %
3% em negros
Esferocitose 1:500
Eliptocitose 1:500
Talassemia Beta maior 2,5:100.000

PRINCIPAIS TIPOS DE TALASSEMIAS
♦TALASSEMIA ALFA
♦TALASSEMIAS BETA
♦ TALASSEMIAS INTERATIVAS
♦ FENÓTIPOS TALASSÊMICOS

ORIGEM DAS TALASSEMIAS
Talassemia alfa  Ásia e áfrica
Talassemia beta  Mediterrâneo

Talassemia beta
As talassemias beta ocorrem por falha do gene que
sintetiza a globina beta, situados no cromossoma 11.
A diminuição da globina beta prejudica sua associação
com a globina alfa
NORMAL TAL. BETA TAL.β+
TAL. β0
MENOR MAIOR MAIOR
α β βα α αβ
β
Definição

CLASSIFICAÇÃO CLÍNICA DAS
TALASSEMIAS BETA
HEMOGLOBINA (g/dl) < 7 7 - 10 10 - 13 > 13
RETICULÓCITO 2 - 15 2 - 10 2 - 5 0,5 - 2
ERITROBLASTO + + + + +/ + - - - - - -
ERITRÓCITOS + + + + + + + / -
ALTERADOS
ICTERÍCIA + + + / - - - - - - -
ESPLENOMEGALIA + + + + + - / + - - -
ALTERAÇÕES + + +/ + + + + - - - - - -
ESQUELÉTICAS
NECESSIDADE DE + + + + / - - - - - - -
TRANSFUSÕES
MAIOR INTERMÉDIA MENOR MÍNIMA

Talassemia Beta

Talassemia beta

Pontilhado basófilo

TALASSEMIA ALFA
CONSEQÜÊNCIAS da LESÃO GENÉTICA
NO CROMOSSOMO 16
O DESEQUILÍBRIO α/β.
Sobra cadeia β que tetramerizam-se
FORMANDO Hb H (β4)

RESUMO DAS ALTERAÇÕES
LABORATORIAIS
α
α
α (↓) β
δ
Hb Fetal → 0 - 1%
Hb A2 → 2,0 - 4%
Hb A → 96 - 98%
Conseqüências da redução de
síntese de cadeias alfa
ALFA TALASSEMIA
Traços de Hb H na eletroforese
Precipitados de Hb H nos eritrócitos
Discreta microcitose
Anemia (±)
α
α
α β
δ
γ
γ

RESUMO DAS ALTERAÇÕES LABORATORIAIS
γ
α
α
α (↓ ↓)
β
δ
γ
β
DOENÇA DE Hb H
Hb H (10 - 20%) na eletroforese
Precipitados de Hb H nos eritrócitos
Anemia microcítica - hipocrômica (+, ++)
HCM ↓
Hb A2 ↓
Esplenomegalia
Síndrome hidrópica (Hidropsia Fetal)
Hb Bart’s 80 - 100%
Hb H ∼ 10%
Anemia eritroblástica (++++)

Talassemia alfa Relações laboratoriais
Mínima Menor Doença da
Hb H
Hidropisia
fetal
VCM 74-85 72-80 60-72 80-100
Hb 11-15 10-13 8-10 <7
% Hb
H
Traços-
2%
2 -5 5-20 0-20

Talassemia alfa
Resumo:
Hemoglobina H:
Tetrâmero de
cadeias beta
Hb H = β4
Hemoglobina de
Bart´s:
Tetrâmero de
cadeias gama
Hb Bart´s = γ4

Talassemia alfa
Hidropisia fetal

Hemoglobinas variantes
É um grupo de anormalidades hereditárias
em que a produção de hemoglobina
normal é suprimida e substituída, parcial
ou totalmente, pela formação de uma ou
mais das muitas variantes
hemoglobínicas.

Hemoglobina S
• É causada por uma mutação no gene beta da
globina.
• Há substituição de um base nitrogenada do
códon GAC para GTC, resultando na
substituição do ácido glutâmico (Glu) pela
valina (Val) na posição 6 da globina beta.

HISTÓRICO DA DOENÇA FALCIFORME
1835 - CRUZ JOBIM (BR)
1846 - LEBBY (USA)
1896 - HODENPY (USA)
1908 – JESSE ACIOLY(BR)
PACIENTES NEGROS
COM ANEMIA GRAVE
ICTERÍCIA
DORES AGUDAS

Hemoglobina C
globina.
• Há substituição do ácido glutâmico (Glu)
pela lisina (Lis) na posição 6 da globina
beta.

CÉLULAS EM ALVO NA Hb C/TAL
BETA

Hemoglobina D
• D Los Angeles  o ác. glutâmico (Glu) é
substituído pela glutamina (Gln) na posição 121
da globina beta.
•D Bushman  A Glicina (Gli) é substituída pela
arginina (Arg) na posição 16 da globina beta.
Apresenta a mesma mobilidade eletroforética da Hb S
OUTRAS

Hemoglobina E
globina.
•Há substituição do lisina (Lis) é substituída pelo
ácido glutâmico (Glu) na posição 26 da globina beta.
Tem mobilidade eletroforética ligeiramente a
frente da Hb C – causando confusão.

HEMOGLOBINAS VARIANTES
CERCA DE 400 TIPOS DIFERENTES SEM
CONSEQUÊNCIAS PATOLÓGICAS. Ex. Hb N, Hb J, Hb G,
Hb Porto Alegre
APENAS Hb S E Hb C CAUSAM PATOLOGIA
Hb S (SS, SC, SD, S/Tal) ⇒ FALCIZAÇÃO DO ERITRÓCITO
Hb C (SC, CC, S/Tal) ⇒ CRISTALIZAÇÃO DA Hb

Métodos para diagnosticar hemoglobinopatias e
talasemias
 Métodos auxiliares:
1. Resistência globular a salina 0,36%
2. Dosagem de Hb Fetal
3. Pesquisa de Hb Fetal
4. Teste de Falcização
5. Pesquisa de Talassemia Alfa (Hb H)
6. Pesquisa de Corpos de Heinz
 Métodos básicos:
1. Eletroforese Alcalina
2. Eletroforese Ácida
3. Dosagem de A2

Talassemias
LABORATÓRIO ESPECÍFICO
♦presença de Hb H: Tal. alfa
♦ aumento de Hb A2: tal. beta menor
♦ diminuição ou ausência de Hb A: tal. beta maior
♦ elevação > 20% de Hb fetal: tal. beta maior
♦ reticulocitose: anemias hemolíticas
♦ aumento de bilirrubina indireta: anemias
hemolíticas

Triagem
 Interpretação: Deficiência de hemoglobinização
Teste de resistência globular a salina 0,36%

Dosagem de Hemoglobina Fetal
Método de:
1) Singer –  concentrações
2) Betke -  concetrações

Coloração intra-eritrocitária de
Hemoglobina Fetal
Método de Kleihauer e Betke (modificado por Shepard e cols., 1962)
Princípio:
A hemoglobina Fetal é
acido-resistente e não
sofre eluição. Cora-se
pela eritrosina. As
outras hemoglobinas
são eluidas e não se
coram pela eritrosina

Teste de falcização das hemácias
Princípio:
O metabisulfito de
sódio reduz a tensão
de oxigênio e
fazendo com que
hemoglobina S tome a
forma característica
de foice, ou de meia-
lua.
Metabissulfito de sódio a 2%

Pesquisa intra-eritrocitária
Hemoglobina H
Pesquisa intra-eritrocitária – Azul brilhante de cresil
100 ul sangue
200 ul ACB
Incubar 2 horas

Talassemia alfa Hemoglobina H

Corpos de Heinz Hemoglobinas instáveis

Pesquisa intra-eritrocitária
Hemoglobina H Corpos de Heinz
Hemoglobinas instáveis
100 ul sangue
200 ul ACB
Incubar 2 horas

Reticulócitos
100 ul sangue
100 ul ACB
Incubar 30 minutos

Reticulócitos
Azul brilhante de cresil

Comparação
Hb H Corpos de Heinz Reticulócitos

Eletroforese
Eletro = Eletricidade
Forese = Separação

Eletroforese
É a migração de partículas quando
colocadas em campo elétrico.

Eletroforese
A migração indica o sinal da carga
da partícula.
Este sinal será oposto ao do pólo
para onde irá migrar.

Eletroforese de hemoglobina
ACETATO DE CELULOSE:
Preparação do hemolisado
Tampão TRIS - pH=8,6
Padrão ( hemolisado controle)

Preparação do hemolisado teste e padrão:
50 ul de sangue
100 ul de saponina a 1%

A hemoglobina H é instável e os solventes
usados para remoção do estroma das
hemácias ( éter, clorofórmio, toluol, etc)
desnaturam a Hb H
Importante

- +
A AC A2 A
HbH
Eletroforese de Hemoglobina.
Hemoglobina H

Eletroforese em acetato de celulose – TEB pH=8,6
Hemolisado com saponina a 1%.

Talassemia alfa Detalhe
Hb H


Eletroforese de Hemoglobina.
Padrão normal
- +
Ap AC A2 A

ELETROFORESE DE HEMOGLOBINAS
AP AC A2/C S/D F A PERFIL
AA
AS
SS
AC
CC
AF
Perfil eletroforético comparativo

Eletroforese em acetado de
celulose - Tampão TEB
pH=8,6.
Hemolisado com solução
de saponina a 1%.
SC AC AS SC
AA

ELETROFORESE DE Hb BART’S E Hb H

ELETROFORESE DE Hb EM RN E ADULTO

ELETROFORESE DE Hb EMBRIONÁRIAS

HEMOGLOBINAS NORMAIS APÓS SEIS MESES DE
VIDA
Hb A 96 a 98%
Hb A2 2 a 4%
Hb Fetal 0 a 1%

VARIANTES RARAS NÃO
PATOLÓGICAS
Hb PORTO ALEGRE

PATOLÓGICAS
Hb N BALTIMORE

PATOLÓGICAS
Hb G FILADELFIA E Hb F TEXAS

MUTAÇÕES NAS REGIÕES EXTERNAS
ELETROFORESE DE HEMOGLOBINAS EM ACETATO DE
CELULOSE

MUTAÇÕES NAS REGIÕES EXTERNAS
FAMÍLIA COM Hb C/TAL BETA

Eletroforese em ágar ácido – fosfato pH=6,2
Hemolisado com saponina a 1%.
Indicação: Diferenciar HBS da HBD-HBC da HBE

Padrão laboratorial
Hemoglobina S
Homozigótica Heterozigótica
HbS 89 a 99% 20 a 40%
HbA Ausente 60 a 80%
HbA2 1,5 a 3% 1,5 a 3%
HbF 1 a 2 % 1 a 2 %
Hemoglobina C
HbC 100 % 20 a 40 %
HbA Ausente 60 a 80%
HbF < 7% Ausente

Ordem de migração de
algumas hemoglobinas
-
• HbA2
• HbD e HbS
• HbL e HbP
• HbG
• HbQ
• HbF
• HbA
• HbM e HbK
• HbJ
• HbN
• Hb de Bart, HbI e HbH. +

Outras hemoglobinas
• HbG α Norfolk
• Hb de Bart
• Hb Lepore
• Hb Porto Alegre
• Hb Gun Hill
• Hb Freiburg
• HbM Boston
• HbM β Saskatoon
• HbM Iwate
• HbM Hyde Park
• HbF Texas
• HbF Roma
• Etc

Hemoglobinopatias
HbD – Homozigoto HbD/HbD - Semelhante a HbS,
porém, pela ausência do fenômeno drepanótico.
O estigma HbA/HbD é assintomático.
Ocorre: Índia e pequena % de negros nos EUA
HbE – Homozigoto HbE/HbE.
O estigma HbA/HbE é assintomático.
Ocorre: Sudeste Asiático.
HbS/HbC = 50% de cada.

Eletroforese
Ap AC A2 /C S A
Hb SS
Hb CC
Hb SC
antes da transfusão

Eletroforese
após a transfusão
Ap AC A2 /C S A
Hb SS
Hb CC
Hb SC

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