1. 31/03/2014
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Prof. Samuel Borges
Cultivando micro-organismos
O tamanho pequeno e o crescimento rápido dos micro-
organismos fazem que eles sejam sujeitos a experiências
fantásticas.
As lições aprendidas com o estudo desses micro-
organismos podem ser muitas vezes aplicadas a plantas e
animais, inclusive seres humanos.
Obtendo uma cultura pura
A maioria dos experimentos é feita com cultura pura,
que consiste num único tipo de micro-organismos derivado de
uma única célula inicial. Essas culturas puras existem
raramente na natureza.
Obtendo uma cultura pura
Em seu ambiente natural (terra, água ou no corpo
humano), encontramos culturas misturadas (micro-organismos
diferentes vivendo juntos. Assim, uma cultura pura deve ser
obtida artificialmente.

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Obtendo uma cultura pura
Obter uma cultura pura é um processo de dois passos:
Primeiro, os materiais são esterilizados para eliminar
todos os micro-organismos presentes.
Segundo, uma única célula microbiana é isolada e
cultivada para produzir um clone (descendentes de um mesmo
organismo).
Esterilização
A eliminação de todos os micro-organismos é chamada
esterilização. Todo o aparato e os materiais usados para obter
uma cultura pura devem ser esterilizados. Isso inclui o meio
(líquido ou sólido) que fornece nutrientes à cultura.
Esterilização
Esterilização por calor
O calor é normalmente usado para esterilizar todos os
materiais de laboratório não sujeitos a danos por altas
temperaturas, utilizando calor úmido ou calor seco.
O calor úmido significa exposição ao vapor (técnica mais
eficaz). O calor seco significa aquecimento em um forno ou
exposição direta a uma chama.
Esterilização
Esterilização por calor
O recipiente pressurizado projetado para esterilizar
materiais com calor úmido é chamado autoclave. A autoclave se
assemelha a uma versão maior da panela de pressão comum.
Os meios microbiológicos e tecidos, como toalhas, são
esterilizados em autoclave, como também os itens de vidro,
como pipetas e frascos ou tubos de ensaio vazios.

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Esterilização
Esterilização por calor
A chama aberta também é usada para esterilizar.
Sempre que um frasco ou tubo de ensaio é aberto para
adicionar ou remover materiais, passa-se o gargalo por uma
chama aberta para minimizar as chances de contaminação de
seu conteúdo.
As alças de inoculação de metal, usadas para transferir
micro-organismos de uma superfície para outra, são
frequentemente esterilizadas por chama aberta.
Esterilização
Filtração
As células microbianas podem ser removidas de líquidos
ou gases por filtração. Ela é mais demorada e cara que a
autoclave. Então, apenas líquidos ou soluções sensíveis ao calor
são filtrados.
Os filtros utilizados nesse processo são chamados
filtros de membrana.
Esterilização
Filtração
O líquido é filtrado despejando-o sobre um filtro de
membrana ajustada em um frasco onde aplica-se vácuo para
puxar o líquido pelo filtro, deixando os micro-organismos para
trás, na superfície do filtro.
Soluções de vitaminas, antibióticos e outros compostos
sensíveis ao calor são normalmente filtrados antes de serem
adicionados ao meio.
Esterilização
Substâncias químicas
A maioria da substâncias químicas não pode ser usada
para esterilizar meios de cultura, porque resíduos que são
tóxicos aos micro-organismos permanecem no meio.
Porém uma substância química, o hipoclorito de sódio
(alvejante comum), é comumente adicionado a culturas depois
das experiências terem sido completadas.

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Esterilização
Substâncias químicas
Esse tratamento é uma medida de segurança usada ao
lidar com micro-organismos perigosos, pois ele mata
rapidamente a maioria dos micro-organismos.
Outras substâncias são usadas para minimizar a
contaminação em todo o laboratório: sais de amônio são usados
para desinfetar superfícies, como bancos e mesas, por
exemplo.
Isolamento
Com todos os meios e equipamentos necessários
estéreis, o próximo passo é isolar uma cultura pura. O princípio
é simples: separar uma única célula de todas as outras e
fornecer os nutrientes e o ambiente necessário para ela
crescer.
Isolamento
Para isolar uma única célula, a população deve ser diluída
(reduzida). A diluição é normalmente feita de três modos: pelo
método de esgotamento, por pour plate ou por espalhamento
em placa.
Isolamento
Método por esgotamento
É o método mais fácil e mais comumente usado de
diluição de uma população microbiana.
Uma população de micro-organismos é selecionada com
uma alça de inoculação de metal estéril. Em seguida, é diluída
movendo-se a alça de um lado para outro na superfície de um
meio de ágar solidificado em uma placa de petri.

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Isolamento
Método por esgotamento
Como a alça é riscada de um lado para outro, cada vez
menos micro-organismos são depositados na superfície. Então a
alça é esterilizada em uma chama e usada para riscar a placa
novamente.
Dessa vez, os riscos sobrepõem os primeiros, de forma
que algumas células microbianas são arrastadas para uma
região fresca e estéril da superfície.
Isolamento
Método por esgotamento
A repetição desse processo por várias vezes dilui de
maneira suficiente a população microbiana, de forma que
células individuais são depositadas separadamente na
superfície do ágar.
Depois, as placas são incubadas (deixadas para crescer
em local aquecido apropriadamente) até que as células
individuais tenham se multiplicado suficientemente para
formar colônias (massas visíveis de células).
Isolamento
Pour plate e espalhamento em placa
As diluições pelo método por esgotamento são feitas
diretamente na placa. Nos métodos de pour plate e
espalhamento em placa, as diluições são feitas antes que as
amostras sejam colocadas na placa.
Essas diluições são enormes e, geralmente, são feitas
diluições consecutivas de 10 vezes ou de 100 vezes. Por
exemplo, para diluições de 10 vezes, 1 ml de células é
adicionado a 9 ml de meio de cultura estéril ou solução salina.
Isolamento
Pour plate e espalhamento em placa
A mistura é agitada e o processo é repetido. Depois de
duas diluições, a suspensão foi diluída em 100 vezes. Depois de
seis diluições, ela foi diluída um milhão de vezes.
As diluições são realizadas do mesmo modo tanto para o
método de pour plate como para o espalhamento em placa. Os
dois métodos diferem apenas no modo como a suspensão diluída
é adiciona à placa.

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Isolamento
Pour plate e espalhamento em placa
No método de pour plate, a amostra diluída é adicionada
ao meio contendo ágar derretido, misturada e despejada numa
placa de petri.
No método de espalhamento em placa, a amostra diluída
é despejada sobre a superfície de um meio de ágar solidificado
em uma placa de petri e espalhada uniformemente com uma
haste de vidro estéril.
Tipos de meio de cultura
Para cultivar micro-organismos em laboratório, os
nutrientes necessários devem ser fornecidos no meio de
cultura. O meio pode ser líquido ou sólido, sendo que a maior
parte dos meios sólidos são meios líquidos gelificados pela
adição de ágar.
O meio utilizado depende do micro-organismo e porque
está sendo cultivado, devido aos requisitos nutricionais muito
diferentes de cada um.
Tipos de meio de cultura
Meios definidos
Um meio definido é preparado a partir de substâncias
químicas puras; um meio definido que tem apenas ingredientes
suficientes para sustentar o crescimento é chamado de meio
mínimo.
O número de ingredientes que deve ser adicionado a um
meio mínimo varia muito, dependendo do micro-organismo que
está sendo cultivado.
Tipos de meio de cultura
Meios definidos
Escherichia coli, por exemplo, precisa de um meio mínimo
relativamente simples: ele deve conter apenas uma fonte
orgânica de carbono (glicose, por exemplo) e alguns sais
inorgânicos.
O preparo de um meio definido é demorado e os micro-
organismos crescem relativamente devagar neles. O meio
definido pode ser preparado apenas para micro-organismos
com requisitos nutricionais reconhecidos.

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Tipos de meio de cultura
Meios complexos
Um meio complexo é feito a partir de extratos de
materiais naturais, como carne, sangue, caseína (proteína do
leite), levedura e soja.
Os diversos ingredientes dos meios complexos estão
comercialmente disponíveis na forma de pós secos. As centenas
de misturas já formuladas em meios complexos específicos
também estão disponíveis.
Tipos de meio de cultura
Meios complexos
O caldo nutriente, é o mais frequentemente utilizado em
meios complexos. Quando solidificado com ágar é chamado de
ágar nutriente. Além de ser fácil de preparar, o meio complexo
proporciona o crescimento rápido da maioria dos micro-
organismos.
Tipos de meio de cultura
Meios seletivos
Os meios seletivos favorecem o crescimento de micro-
organismos especiais. Eles são usados para isolar ou detectar a
espécie favorecida em uma complexa mistura de outros micro-
organismos.
Poe exemplo, um meio seletivo pode ser usado para isolar
Salmonella typhi das fezes, que contêm um grande número de
micro-organismos diferentes.
Tipos de meio de cultura
Meios diferenciais
São usados para identificar micro-organismos pela
aparência de suas colônias. Por exemplo, o ágar sangue (um
meio ágar contendo hemácias) pode ser usado para identificar
Streptococcus pyogenes (infecção estreptocócica).
Nesses meios, as colônias dessa bactéria são cercadas
por uma zona clara, pois as hemácias sofrem lise (se destroem
por explosão) quando próximas das colônias.

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Tipos de meios de cultura
Meios diferenciais seletivos
Alguns meios são tanto seletivos como diferenciais. O
ágar MacConkey é um exemplo. Ele é seletivo porque contém
cristal violeta e sais biliares que inibem o crescimento de
muitas bactérias, mas não de bactérias coliformes e espécies
de Salmonella e Shigella.
Ele é diferencial porque contém vermelho neutro (um
indicador do pH) e lactose (açúcar do leite). Essa
característica faz com que as colônias de coliformes fiquem
vermelho coral.
Tipos de meios de cultura
Cultura de enriquecimento
É usada para isolar um micro-organismo ou tipo
particular de micro-organismo de uma grande e naturalmente
complexa população.
Por exemplo, as bactérias formadoras de endosporos
podem ser isoladas fervendo uma amostra de terra e
cultivando os sobreviventes, pois apenas os endosporos
sobrevivem a temperaturas de fervura.
Fornecendo um ambiente apropriado
Temperatura
Diferentes espécies bacterianas crescem melhor acima
de um limite de temperatura em particular. Em geral, a maioria
cresce acima de um limite de aproximadamente 40°C.
Elas crescem mais rapidamente quando próximo ao limite
máximo. Então, para um crescimento rápido, as bactérias são
cultivadas em ambientes quentes ao máximo de sua tolerância,
que normalmente reflete seu ambiente natural.
Fornecendo um ambiente apropriado
pH
O pH ótimo para espécies microbianas varia, mas
qualquer espécie em particular pode crescer somente dentro
de um limite relativamente pequeno.
A maioria das bactérias cresce melhor em valores de pH
próximos à neutralidade (na faixa de 6,5 a 7,5), enquanto que a
maioria dos fungos cresce melhor em um limite de pH entre 4,5
e 6,0.

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Fornecendo um ambiente apropriado
Oxigênio
Os micro-organismos respondem de forma diferente ao
oxigênio. Alguns, chamados de aeróbios estritos, não crescem
sem o oxigênio. Outros, chamados anaeróbios estritos, não
crescem em sua presença.
Ainda há outros tipos de organismos, como os anaeróbios
facultativos (que usam o oxigênio quando disponível), os
anaeróbios aerotolerantes (não são capazes de usar o
oxigênio, mas o mesmo não os prejudica) e os microaerófilos
(que precisam de oxigênio, mas apenas em baixas
concentrações).
Preservando um cultura pura
A maior parte dos laboratórios de microbiologia mantém
muitas cepas diferentes de micro-organismos. Essas culturas
podem ser mantidas vivas transferindo-as periodicamente para
um meio fresco.
É mais fácil preservar culturas microbianas em um
estado de não crescimento. Com o tratamento adequado, essas
culturas (chamadas de culturas de linhagem) permanecem vivas
por anos. A maioria das técnicas envolve dissecação (remoção
de toda a água) ou armazenamento em baixas temperaturas.
Referências bibliográficas
INGRAHAM, J. L.; INGRAHAM, C. A. Introdução à
microbiologia – uma abordagem baseada em estudos de
caso. São Paulo: Cencage Learning, 2010.
NEDER, R. N. Microbiologia – manual de laboratório. São
Paulo: Nobel, 1992.
VERMELHO, A. B.; PEREIRA, A. F.; COELHO, R. R. R.;
SOUTO-PADRÓN, T. Práticas de microbiologia. Rio de
Janeiro: Guanabara Koogan, 2006.