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Microbiologia Geral e Biossegurança

MICROBIOLOGIA GERAL E BIOSSEGURANÇA
1. Todos os campos do Formulário Padrão deverão ser devidamente preenchidos.
2. Esta é uma atividade individual. Caso seja identificado plágio, inclusive de colegas,
a atividade será zerada.
3. Cópias de terceiros como livros e internet, sem citar a fonte caracterizam-se como plágio,
sendo o trabalho zerado.
4. Ao utilizar autores para fundamentar seu Projeto Integrador, os mesmos devem
ser referenciados conforme as normas da ABNT.
5. Ao realizar sua atividade, renomeie o arquivo, salve em seu computador,
anexe no campo indicado, clique em responder e finalize a atividade.
6. Procure argumentar de forma clara e objetiva, de acordo com o conteúdo da disciplina.
Formatação exigida: documento Word, Fonte Arial ou Times New Roman tamanho 12.

MEIO DE CULTURA
1. Conhecer as técnicas básicas utilizadas na rotina da microbiologia.
2. Produzir o meio de cultura sólida utilizado para favorecer o crescimento bacteriano.
A rotina laboratorial executada por profissional atuante nas análises clínicas é imprescindível para
monitorar o estado de saúde dos indivíduos que devem manter o hábito constante de procurar atendimento
médico-laboratorial. Os exames básicos promovem uma abordagem ampla a respeito dos agentes
patológicos que pode estar prejudicando a saúde do paciente au xiliando profissionais da saúde a
compreender, diagnosticar e tratar doenças.

Caro aluno (a),
Na presente atividade prática, você irá preparar um meio de cultura caseiro utilizando recursos
adaptados da versão laboratorial, mas que proporcionará a você a noção de como o meio de cultura para
cultivo bacteriano é preparado. Vamos usar gelatina como substituto para o Ágar, responsável pela
solidificação do meio. E o caldo de legumes que será fonte de nutrientes para o crescimento e repr
odução
das bactérias.

VÍDEO-POCKET LEARNING
EMBASAMENTO TEÓRICO
A cultura pura é quando se obtêm um microrganismo por meio de uma única célula que cresce
e se multiplica no meio de cultura , possibilitando o estudo das características morfológicas e
fisiológicas dos microrganismos.
Quando estamos cultivando os microrganismos empregamos meio de cultura que contém
nutrientes e vitaminas necessários parao seu crescimento e reprodução. O fornecimento de nutrientes
tem que atender às exigências das espécies a serem cultivadas promovendo o crescimento e ou
esporulação satisfatória do microrganismo. A maior parte dos microrganismos cultiváveis crescem em
meio à cultura que contém uma fonte de carbono e nitrogênio e em menor quantidade outros nutrientes
como potássio, fósforo, enxofre, ferro e manganês.
O carbono é um elemento de grande importância para o desenvolvimento de microrganismos,
seja no seu habitat ou em meio de cultivo. Ele é um elemento estrutural que é considerado a principal
fonte de energia. O carbono é fornecido por meio de monossacarídeos como glicose, frutose e
galactose.
O nitrogênio é a parte essencial para a formação dos aminoácidos que compõem as proteínas
e é fornecido de forma orgânica (asparagina, caseína e peptona) e de forma inorgânica (nitrato de
sódio e nitrato de cálcio). Enquanto que o enxofre é utilizado na forma de sulfato para a biossíntese
de aminoácidos como cisteínas e metio nina. O enxofre na forma de sulfeto pode ser tóxico aos
microrganismos. O fosfato é um componente da membrana e está presente na síntese dos ácidos
nucleicos e ATP e é fornecido como fosfato de potássio. Os demais nutrientes são necessários em
pequena quan tidade e funcionam como cofatores. Entretanto, a composição do meio de cultivo
depende do microrganismo que se deseja cultivar e do objeto de estudo.
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De modo geral, quando trabalhamos com o cultivo de microrganismos o ambiente é asséptico,
ou seja, ambiente livre de contaminação. Após o preparo dos meios de cultivo eles devem ser
esterilizados, para garantir que estamos trabalhando somente com o microrganismo que pretendemos
estudar. Os meios de cultivo são classificados quanto: sua consistência; composição e seletividade.
Quanto à consistência, o meio pode ser líquido ou sólido. O meio líquido contém todos os
nutrientes necessários para o crescimento do microrganismo são dissolvidos em água. Uma vez
preparado e esterilizado pode inserir o microrganismo que se pretende trabalhar em meio de cultivo.
Este meio é utilizado quando se tem por objetivo obter maior massa em menor tempo, geralmente é
utilizado para o crescimento de bactérias. Contudo, os meios sólidos são preparados a partir da adição
de um agente solidificador, o AGAR na concentração de 1,5 a 2% p/v, antes de esterilização. Este tipo
de meio é o mais utilizado para a obtenção de culturas puras para estudar as características
morfológicas e para a estocagem de culturas puras.
O meio de cultivo em relação a sua composição pode ser: Sintético, semissintético e natural.
O meio sintético é quando sua composição química e concentrações são conhecidas. Um
exemplo é o meio CZAPK (nitrato de sódio 2g L-1, sulfato de magnésio 0,5 2g L-1, cloreto de potássio
0,52g L-1, sulfato ferroso 0.01 2g L-1, difosfato de potássio 1,0 2g L-1, sacarose 30 2g L-1, e o pH final
7,2).
O meio de cultivo semissintético é a composição química é parcialmente conhecida de alguns
componentes, por exemplo o meio de cultivo batata-ágar-dextrose. Sua composição é 500 ml do caldo
de batata (componentes desconhecidos), 20g dextrose e 20 g de ágar e completa para 1000 ml de
água.
Quando a composição do meio é desconhecida por completo, é denominado de meio de
cultivo natural como por exemplo o meio cenoura-ágar, que é composto de 400 ml do extrato de
cenoura, 20 g de ágar e completa para 1000 ml de água. O meio natural por apresentar baixo custo,
acaba sendo o mais utilizado nos laboratórios de pesquisa.
Os meios de cultivo podem apresentar se: seletivos, não seletivos e diferenciais. Os meios de
cultivos seletivos são aqueles que você vai adicionar uma substância que favorece o desenvolvimento
de um determinado organismo. Por exemplo adiciona cristal de violeta ao meio de cultivo favorecendo
o desenvolvimento de bactérias Gram negativa. Os meios de cultivo que desenvolvem uma grande
gama de microrganismos são denominados meios não seletivos. E os meios diferenciais, são meios
que permitem, mediante a adição de reagentes, verificar o comportamento de dois ou mais
microrganismos. Por exemplo quando adiciona ao meio de cultivo eosina e azul de metileno consegue
ver a diferença de Escherichia coli de Enterobacter aerogenes.

O meio de cultivo Batata-agar-dextrose (BDA), que é considerado o meio universal pois suporta
o crescimento de muitos organismos (fungos e bactérias) por isso é usado mundialmente como meio
de rotina nos laboratórios para o isolamento (obtenção da cultura pura) e manutenção temporária das
culturas.
A batata serve como importante fonte de Carboidrato, o amido é absorvido pelo microrganismo
como glicose após a hidrólise enzimática. A dextrose na quantidade certa permite o crescimento do
microrganismo pois é um monossacarídeo mais importante utilizado como fonte de energia na
respiração de procariotos e eucariotos. Como é preparado este meio, qual a receita do meio? O modo
de preparo é simples. Primeiro passo é ferver 200g de batata em 500 ml de água por 30 minutos.
Em seguida filtrar o caldo em gases. Fazer a fusão do ágar (20g) junto com a quantidade de
dextrose (20g) em 500 ml de água. Em seguida adicione o caldo e complete o volume para 1000 ml
de água. E o meio está pronto para ser esterilizado. Após ser esterilizado pode ser vertido em placas
de Petri, para ser feito o isolamento do microrganismo.
Referência: Página 26-28 da unidade II da apostila de Microbiologia e biossegurança.

Materiais de consumo:
Descrição Observação
3 placas de Petri estéril descartável Material a ser fornecido pelo aluno
Água Material a ser fornecido pelo aluno
1 tablete de caldo de carne Material a ser fornecido pelo aluno
1 envelope de gelatina em pó incolor Material a ser fornecido pelo aluno
Fogão Material a ser fornecido pelo aluno
Panela Material a ser fornecido pelo aluno
Software/aplicativo/simulador
Sim ( ) Não ( X )
Em caso afirmativo, qual?
Pago ( ) Não Pago ( )
Tipo de Licença: Não se aplica
Descrição do software/aplicativo/simulador:
Caso não seja necessário o uso do recurso, preencher com *Não se aplica (NSA)

Caros alunos (as),
Ao realizar a prática, separe um espaço organizado, limpo e arejado. Separe todos os materiais
necessários e coloque-os em uma disposição de fácil acesso e que permita que você fique confortável, de
preferência sentado, respeitando uma postura correta.
Tome cuidado ao manipular os materiais, principalmente no momento de utilizar a fonte de calor,
seja o fogão ou o micro-ondas. Coloque o seu material em recipiente adequado para cada situação.

/
VÍDEO POCKET LEARNING
PASSO A PASSO DA PRÁTICA
Procedimento 1: Preparo do meio de cultura
1. Inicie o preparo separando os materiais.
2. Posteriormente, macere o tablete de caldo de carne, desmanchando os grumos. Misture com a
gelatina em pó. Adicione uma xícara de água, leve ao fogo até ferver levemente e dissolver a gelatina
e o caldo de carne.
3. Reserve e deixe esfriar brevemente.
Procedimento 2: Acondicionamento do meio de cultura em placa de Petri
1. Você encontrará as placas de Petri estéreis disponíveis para venda em lojas online. Somente abra
as placas no momento da transferência do meio para evitar a contaminação das mesmas.
2. Para evitar a contaminação durante a manipulação das placas e transferênc ia do meio de cultura.
Acenda o fogo de uma das bocas do fogão e manuseie a transferência no perímetro ao entorno no
fogo.
3. Transfira uma pequena quantidade do meio para as placas de Petri e aguarde sua solidificação em
temperatura ambiente ou em geladeira para acelerar o processo caso seja necessário. Mas lembre
-
se, caso tenha levado as placas para solidificação em geladeira antes de realizar o semeio (prática
2) a mesma deverá estar em temperatura ambiente.
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Caro aluno (a),
Você deverá entregar o Relatório tipo Apresentação Simples (Power point ). Para isso, faça o
download do template, disponibilizado junto a este roteiro, e siga as instruções contidas no mesmo.
• Vídeo cultivando microrganismos em casa Parte 1. Disponível em:
https://www.youtube.com/watch?v=u3Wfp_YAjIc

CONTROLE DO CRESCIMENTO MICROBIANO –
ANTISSEPSIA DAS MÃOS
1. Executar corretamente a higienização das mãos, compreendendo a diferença entre o método
simples e a antissepsia.
2. Aplicar os conhecimentos obtidos na aula prática demonstrativa através da realização do
semeio de amostras em meio de cultura.
O conceito de microbiologia é relativamente novo, no entanto, o controle dos microrganismos já era
realizado a centenas de anos atrás. O cozimento dos alimentos é um dos métodos de preservação dos
alimentos mais antigo e que é empregado até hoje com algumas modificações. Os microrganismos estão
presentes em várias coisas que acontecem à nossa volta, estão envolvidos na fermentação, reciclagem de
nutrientes, fabricação de alimentos e bebidas, na indústria farmacêutica, medicina e na agricultura. As
descobertas que ocorrem na microbiologia ajudam os profissionais da saúde a compreender, diagnosticar
e tratar doenças que não são bem compreendidas.
Ao trabalharmos com o manuseio de microrganismos, seja em um laboratório, um hospital, uma
indústria dependemos de c onhecer formas de controlar os microrganismos no ambiente em que se
encontram. Vários são os métodos que podem manter os microrganismos em uma população estável e a
melhor a ser escolhida depende do que você quer destruir
Durante a quebra da teoria da gera ção espontânea, os cientistas da época comprovaram que a
fervura poderia matar muitos microrganismos, embora bactérias esporulantes pudessem sobreviver devido
à sua resistência ao calor. Os cientistas descobriram que os microrganismos poderiam ser mortos q uando
expostos a várias substâncias químicas ou de serem removidos do ar ou de um líquido utilizando filtros
especiais.

Caro aluno (a),
Na presente atividade prática, você dará sequência na aula prática 1, cujo preparou os meios de
cultura bacteriano e agora irá realizar o cultivo de bactérias presente no cotidiano. É de conhecimento
cientifico que as infecções relacionadas com os profissionais da área se devem a higienização incorreta
das mãos. Portanto, vocês irão semear no meio de cultivo amo stras coletas de mãos não higienizadas,
higienizada apenas com álcool 70 e amostra obtida após a realização correta da antissepsia com álcool
iodado.

VÍDEO-POCKET LEARNING
EMBASAMENTO TEÓRICO
As substâncias antimicrobianas, são aquelas que matam ou inibem o crescimento dos
microrganismos. Dependendo do microrganismo afetado se tornam específicos como:
antibacterianos, antifúngicos, antiprotozoarios e antiviral. Os agentes antimicrobianos que matam os
microrganismos são denominados de microbicidas.
As denominações bactericidas e fungicidas indicam o tipo de microrganismo destruído. E
quando ocorre a destruição de todos os microrganismos presentes em um material é denominado de
esterilização. No entanto tem os agentes que inibem o desenvolvimento do microrganismo, que são
chamados microbiostáticos, e claro que muitas definições podem surgir sendo os mais utilizados
fungistático e bacteriostático.
Os agentes de controle dos microrganismos podem sofrer grande influência de vários fatores
ambientais, bem como as características biológicas do microrganismo. Dentre as variáveis de maior
importância a serem consideradas quando se quer avaliar a eficácia de um a agente antimicrobiano
são: o tamanho da população microbiana; Intensidade ou concentração do antimicrobiano; tempo de
exposição ao agente microbiano; temperatura que os microrganismos são expostos ao agente
antimicrobiano; natureza do material que contém microrganismos e característica do microrganismo
presente.
Em relação ao tamanho da população, quanto maior for mais tempo vai levar para morrer.
Quanto menor for a intensidade ou a concentração do antimicrobiano mais tempo se leva para destruir
uma população de microrganismos. E quando se leva em consideração o tempo de exposição, quanto
maior for o tempo maior será o número de células mortas.
Os agentes microbianos são classificados como agentes físicos e químicos. A ocorrência da
redução do número de microrganismos por meio de um método físico ou químico é denominado de
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desinfecção. Enquanto, a esterilização é a destruição de todas as formas de vida microbiana (fungos,
bactérias e vírus) seja por meio da aplicação de um método físico ou químico.
Entre os agentes físicos temos: o calor, a flambagem, a filtragem e a radiação. Todavia, os
métodos químicos utilizam substâncias que têm capacidade de matar ou inibir o crescimento de um
microrganismo. Dentre os métodos químicos podemos citar os gases tóxicos e as soluções
desinfetantes.
Entre as soluções desinfetantes mais utilizadas nos laboratórios de microbiologia podemos citar:
o álcool 70%, ou hipoclorito de sódio e o peróxido de hidrogênio. O álcool 70% é amplamente utilizado
na obtenção do microrganismo em cultivo puro, como também em superfícies de trabalho e câmara
de fluxo. Quando utilizamos o álcool 70 % para desinfetar fragmentos estes ficam de 30 a 60 segundos
mergulhados no álcool 70%. O hipoclorito de sódio ou cálcio é eficiente para eliminar microrganismos
oportunistas da superfície dos tecidos. O hipoclorito de sódio ou cálcio é utilizado nas concentrações
de 0,05 a 0,1%. E o peróxido de hidrogênio é usado na concentração de 5% (pv).
A higienização do laboratório é imprescindível temos que estar atentos a vários cuidados de
assepsia e o material a ser utilizado pois qualquer corpo estranho pode levar a risco todo o trabalho,
experimento ou resultado de uma pesquisa.
IMPORTÂNCIA DA HIGIENIZAÇÃO DAS MÃOS
De acordo com as comprovações científicas as mãos são responsáveis pela transmissão das
infecções relacionadas a assistência à saúde, portanto, é de suma importância a realização de
procedimentos de higienização das mãos para diminuir as taxas de infecções principalmente entre os
profissionais de saúde.
A higienização correta das mãos é uma medida individual simples e imprescindível para prevenir
a propagação das infecções. A higienização das mãos pode ser: simples, antisséptica, fricção
antisséptica e a antissepsia cirúrgica das mãos. A higienização das mãos possui as seguintes
finalidades:
1) Remoção de sujidade, suor, oleosidade, pelos, células descamativas e microbiota da
pele, interrompendo a transmissão de infecções veiculadas ao contato;
2) Prevenção e redução das infecções causadas pelas transmissões cruzadas.
A utilização de agente antisséptico para higienização das mãos deve ter ação antimicrobiana
imediata e efeito residual ou persistente. Não devem ser tóxicos, alergênicos ou irritantes para a pele.
Recomenda-se que sejam agradáveis de utilizar, suaves e, ainda, ofereçam boa relação
custobenefício, dentre os agentes antissépticos disponíveis os mais utilizados são: álcool e a
clorexidina. Os álcoois apresentam rápida ação e excelente atividade bactericida e fungicida usados
para higienização das mãos são o etanol, o isopropanol e o n-propanol. A clorexidina é um agente

antisséptico cuja atividade antimicrobiana é mais lentamente que a dos álcoois, sendo considerada de
nível intermediário. Porém, seu efeito residual, pela forte afinidade com os tecidos, torna-o o melhor
antisséptico disponíveis (CONSELHO REGIONAL DE FARMÁCIA DE SÃO PAULO, 2010).
A técnica de higienização das mãos se torna inadequado na prática diária pelo esquecimento
de algumas etapas necessárias deste procedimento, havendo preocupação, por parte dos
profissionais de saúde, com a quantidade e não com a qualidade deste ato. As principais falhas na
técnica ocorrem, principalmente, pela não utilização de sabonete e a não observação das superfícies
das mãos a serem friccionadas. A higienização das mãos dos profissionais da saúde pode ser feita
utilizando: água e sabonete, preparação alcoólica e antisséptico degermante.
As técnicas de higienização das mãos podem variar, dependendo do objetivo ao qual se
destinam, a eficácia deste procedimento depende da duração e da técnica empregada.
1) Higienização simples das mãos
Possui a finalidade de remoção dos microrganismos que colonizam as camadas superficiais da
pele, assim como o suor, a oleosidade e as células mortas, retirando a sujidade propícia à permanência
e à proliferação de microrganismos.
Duração do procedimento: 40 a 60 segundos.
2) Higienização antisséptica das mãos
A finalidade dessa técnica é promover a remoção de sujidades e de microrganismos, reduzindo
a carga microbiana das mãos, com auxílio de um antisséptico. A técnica de higienização antisséptica
é igual àquela utilizada para higienização simples das mãos, com a diferença que o sabonete é
substituído por um antisséptico degermante, por exemplo, clorexidina.
Duração do procedimento: 40 a 60 segundos.
3) Fricção antisséptica das mãos (com preparações alcoólicas)
Esta técnica não proporciona a remoção de sujidades o objetivo é reduzir a carga microbiana
das mãos. A utilização de gel alcoólico preferencialmente a 70% ou de solução alcoólica a 70% com
1-3% de glicerina pode substituir a higienização com água e sabonete quando as mãos não estiverem
visivelmente sujas.
Duração do Procedimento: 20 a 30 segundos.

É importante salientar que alguns aspectos devem ser destacados antes de iniciar a técnica da
higienização das mãos para reduzir a contaminação microbiana, sobre esses aspectos devemos
destacar:
- É necessário retirar joias (anéis, pulseiras, relógio);
- Manutenção das unhas naturais, limpas e curtas;
- Não utilizar unhas postiças ou uso de esmaltes nas unhas;

Materiais de consumo:
Descrição Observação
3 Placas de Petri com meio de cultura (PREPARADA NA
AULA PRÁTICA1)
Material fornecido pelo aluno
Caneta marcadora permanente Material fornecido pelo aluno
Álcool 70° Material fornecido pelo aluno
1 Frasco pequeno de soro fisiológico Material fornecido pelo aluno
1 Frasco de álcool iodado Material fornecido pelo aluno
Swabs ou cotentes limpos Material fornecido pelo aluno
Caixa de sapato Material fornecido pelo aluno
Água correte Material fornecido pelo aluno
Sabonete líquido Material fornecido pelo aluno
Papel toalha para secagem das mãos ou toalha limpa Material fornecido pelo aluno
Software/aplicativo/simulador
Sim ( ) Não ( X )
Em caso afirmativo, qual?
Pago ( ) Não Pago ( )
Tipo de Licença: Não se aplica
Descrição do software/aplicativo/simulador:
Caso não seja necessário o uso do recurso, preencher com *Não se aplica (NSA)

Caros alunos (as),
Ao realizar a prática, separe um espaço organizado, limpo e arejado. Separe todos os materiais
necessários e coloque-os em uma disposição de fácil acesso e que permita que você fique confortável, de
preferência sentado, respeitando uma postura correta. Coloque o seu material em recipiente adequado
para cada situação.

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VÍDEO POCKET LEARNING
PASSO A PASSO DA PRÁTICA
Procedimento 1: Identificação das Placas de Petri
Escolha um local confortável com superfície previamente higienizada para iniciar o
experimento.
a) Na aula prática 1 você preparou 3 meios de cultura sólidos em placas de Petri e após a
solidificação dos meios poderá iniciar o experimento.
b) Com o auxílio de uma caneta marcadora identifique as placas de Petri como: 1) mão sem
lavar, 2) álcool 70° e 3) Antissepsia com álcool iodado.
Procedimento 2: Obtenção da amostra e semeadura nos meios de cultura
Para as 3 etapas do experimento a amostra deverá ser obtida sempre da mesma mão ,
podendo escolher realizar a coleta da mão direita ou esquerda.
a) Com o auxílio de um swab ou cotonete limpo (de preferência obtidos de embalagem lacrada
sem estar no uso cotidiano). O mesmo foi umedecido no soro fisiológico e friccionado sobre a pele da
palma da mão sem estar higienizada. Em seguida, a amostra foi semeada na placa de Petri contendo
a identificação “mãos sem lavar (1)”; A semeadura consiste em depositar a amostra na placa de Petri
em forma de estrias como mostrado na imagem abaixo.
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a) Posteriormente, foi realizado a higienize das mãos com álcool em gel 70° (2). Um novo
swab ou cotonete foi umedecido no soro fisiológico e esfregue na pele das mãos e realizado a
semeadura na placa que estava identificada como álcool 70°.
b) Para finalizar a última parte do experimento, foi realizada a higienização das mãos com
sabão de acordo com a técnica de lavagem das mãos. Posteriormente, foi realizada a antissepsia das
mãos pré-lavadas, com álcool iodado deixando agir por 1 minuto, esperando secar ao ar. A seguir foi
utilizado outro swab ou cotonete umedecido no soro fisiológico e o mesmo foi friccionado na palma da
mão lavada e feito antissepsia corretamente. Após isto, foi realizado a semeadura no meio de cultura
identificado como antissepsia com álcool iodado (III).
Procedimento 3: Crescimento microbiano
a) Acomode as placas dentro de uma caixa, coloque em local seguro e em
temperatura
ambiente.
b) Acompanhe o crescimento nos períodos de 24, 48 e 72 horas.
c) Fotografe a evolução do crescimento bacteriano durante este período, pode ser
que o crescimento bacteriano leve até uma semana para acontecer, isto em casos de
temperatura ambiente abaixo de 37°C que seria a temperatura ideal de crescimento em
laboratório.
OBSERVAÇÃO: Caso queira acelerar o processo de crescimento bacteriano e a temperatura se
sua cidade estiver fria o ideal que seja criado um ambiente aquecido imitando uma estufa. E
para isso basta acoplar uma lâmpada através de um foro na caixa de papelão e mantê-la ligada
na tomada.

Caro aluno (a),
Você deverá entregar o Relatório tipo Apresentação Simples. Neste caso, estruture seu documento
conforme apresentado a seguir. Para isso, faça o download do template em Power Point, disponibilizado
junto a este roteiro.
• Vídeo correta lavagem das mãos: https://www.youtube.com/watch?v=qR0ejxtr_Wk
• Vídeo aula prática antissepsia das mãos: https://eaulas.usp.br/portal/video.action?idItem=20059
• Roteiro de Aula Prática da Universidade Federal da Paraíba – Descrição de desinfecção ,
esterilização, assepsia e antissepsia:
http://portal.virtual.ufpb.br/biologia/pdf/roteiro_AP_BIOLOGIA_DE_MICROORGANISMOS.pdf

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