O documento discute testes in vitro com células para avaliar alimentos funcionais. Estes testes podem analisar a absorção, metabolismo, toxicidade e efeitos de compostos bioativos sem usar animais ou humanos. Exemplos de testes incluem ensaios com células Caco-2, ROS, LDH e testes de atividade enzimática como SOD e catalase.

1. INSTITUT KURZ
TESTES IN VITRO COM
CÉLULAS PARA ALIMENTOS
FUNCIONAIS
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2. ALIMENTO FUNCIONAL
(Abuajah et al., 2015; Nicoletti, 2012)
Alimentos funcionais: Itens dietéticos que, além de fornecerem nutrientes
e energia, modulam de forma benéfica funções-alvo no corpo, aumentando
uma determinada resposta fisiológica e/ou reduzindo o risco de doenças.
Relação entre os alimentos que comemos e nossa saúde. → Os
componentes funcionais dos alimentos podem ser aplicados de forma eficaz
no tratamento e prevenção de doenças.

3. ALIMENTO FUNCIONAL
(Robin et al., 2018; Ferruzzi et al., 2012)
Ainda são necessárias muitas pesquisas para entender melhor o papel dos
compostos bioativos da dieta e seus metabólitos na saúde humana.
Métodos in vitro podem ser usados para conhecer e compreender:
✓a identidade e quantidade de componentes bioativos nos alimentos e seus
metabólitos.
✓mecanismos de ação, absorção, biodisponibilidade, metabolismo e
atividade biológica.

4. In vitro é uma expressão do latim que significa “em vidro" e se refere à
técnica de realizar um determinado procedimento em um ambiente
controlado fora de um organismo vivo.
TESTES IN VITRO COM CÉLULAS
(OECD, 2018)
Pode ser realizado em uma ampla gama de células e deve ser selecionado o
material biológico que melhor se adapte ao objetivo.
Este teste pode ser usado para:
• Medicamentos
• Nutracêuticos
• Suplementos alimentares
• Alimentos functionais

5. Estudos in vitro analisam a absorção, distribuição, metabolismo e
excreção de compostos ativos.
→Permite uma avaliação de seus :
• performance
• toxicidade
• eficácia
• efeitos colaterais
TESTES IN VITRO COM CÉLULAS
(Ferruzzi et al., 2012)

6. Vantagens dos testes in vitro:
✓Não requer animais ou humanos
✓Ausência de restrições éticas
✓Não requer o envio de protocolos com animais
✓Evita/reduz a necessidade de pessoal de laboratório com experiência no
manuseio de animais
✓Menos preocupações de segurança
✓Baixo custo
✓Mais rápido
TESTES IN VITRO COM CÉLULAS
(National Academies Press, 1999)

7. O problema com o estudo in vitro é que não é uma representação completa
da resposta de um ser humano a um composto.
O corpo humano é muito mais complexo do que uma simples cultura de
células → Estudos in vitro não podem prever totalmente a influência que o
ingrediente ativo terá sobre os órgãos e sistemas, ou a interação com outros.
TESTES IN VITRO COM CÉLULAS
(Katherine et al., 2017)
Estudos in vivo são necessários para esclarecer todas as informações que
faltam.

8. Existem vários testes in vitro aplicados a alimentos funcionais :
• CAA (Atividade antioxidante celular)
• MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-Brometo de difeniltetrazólio]
• LDH (lactato desidrogenase)
• BrdU (bromodeoxiuridina)
• Teste de AMES
• SOD (superóxido dismutase)
• Catalase
• CAP-e (proteção antioxidante baseado em células eritrócitos)
• ROS PMN (espécies reativas de oxigênio em células polimorfonucleares)
• Ensaio de permeabilidade CACO-2
EXEMPLOS DE TESTES IN VITRO COM
CÉLULAS

9. CAA
(Reşat et al., 2016)
A atividade antioxidante celular (CAA) é um ensaio para quantificar a
atividade antioxidante de fitoquímicos, extratos alimentares e suplementos
dietéticos.
É um método de medição in vitro que usa colônias de células humanas ou
animais e não requer evolução in vivo de probandos.

10. CAA
(Wolfe & Liu, 2007)
O procedimento inclui as seguintes etapas:
1. A amostra é incubada com as células e com uma sonda precursora.
2. O precursor 2′,7′-diacetato de diclorofluorescina (DCFH-DA)
atravessa a membrana celular e é desacetilado por esterases celulares.
3. ROS intracelulares oxidam o precursor desacetilado (DCFH) em
diclorofluoresceína fluorescente (DCF).
4. O gerador de ROS é adicionado ao meio de cultura, passa através da
membrana celular e a reação de oxidação é acelerada.
5. A fluorescência é medida em intervalos de 3 a 5 minutos por 90
minutos ou até que as curvas atinjam um platô.

11. CAA

12. MTT
(van Tonder et al., 2015)
O ensaio MTT [3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio] mede a
viabilidade celular. Indiretamente, avalia a capacidade de energia celular de
uma célula.
O MTT amarelo é reduzido a um formazan roxo pelas enzimas
mitocondriais.

13. MTT
(Kuete et al., 2017)
O ensaio MTT inclui as seguintes etapas:
1. As células e os compostos de teste são preparados em placas de 96
poços, contendo 100µl/poço, e incubados durante o período de
exposição desejado.
2. 10µl de solução de MTT são adicionados por poço para obter uma
concentração entre 0,2-0,5mg/ml e incubados por 1 a 4 horas a 37°C.
3. 100µl de solução de solubilização são adicionados a cada poço para
dissolver cristais de formazan em uma solução colorida.
4. A quantidade de formazan é medida registrando mudanças na
absorbância a 570nm usando um espectrofotômetro de leitura de placa.

14. MTT
(Sittampalam et al., 2004)
As células viáveis convertem o MTT em um formazan roxo. Quando as
células morrem, elas perdem a capacidade de converter MTT em
formazan.→ A formação de cor é um marcador das células viáveis.
O sinal gerado depende dos seguintes parâmetros :
• concentração de MTT
• duração do período de incubação
• número de células viáveis e sua atividade metabólica

15. LDH
(Stoddart, 2011; Kumar et al., 2018)
A quantificação de LDH (lactato desidrogenase) é um ensaio de viabilidade
celular que fornece perceções rápidas, robustas e reproduzíveis sobre a
potencial toxicidade de compostos e produtos.
Boa correlação para a presença de dano e toxicidade em tecidos e células.
Avalia a integridade da membrana das células medindo a concentração da
enzima LDH citosólica que vazou no meio extracelular no caso de dano à
membrana.

16. LDH
1. O LDH liberado das células no sobrenadante da cultura catalisa a
hidrólise do lactato em piruvato. Esta reação é acompanhada pela
redução de NAD+ em NADH.
2. INT (cloreto de iodonitrotetrazólio), um sal de tetrazólio amarelo, é
reduzido a um formazan vermelho - catalisado por diaforase.
3. O formazan formado é medido por colorimetria a uma absorbância de
490nm.
A quantidade de formazan é diretamente proporcional à quantidade de
LDH na cultura → Diretamente proporcional ao número de células mortas
ou danificadas.
(Kumar et al., 2018; Forest et al., 2015)

17. LDH
(28)
LDH
LDH
Piruvato
LDH NAD +
NADH
Lactato INT
INT formazan
Diaforase

18. BRDU
(Crane& Bhattacharya, 2013)
O ensaio de incorporação de BrdU (5-Bromo-2'-desoxiuridina ou
bromodeoxiuridina) é usado para detectar a síntese de DNA → quantifica a
proliferação celular.
Mecanismos de proliferação celular e mediadores moleculares que
poderiam regular a proliferação celular podem ser identificados por meio
deste método.

19. BRDU
BrdU é incorporado ao DNA nuclear durante a fase S do ciclo celular.
Depois disso, pode ser detetado com métodos imunohistoquímicos.
1. As amostras são fixadas e incubadas com anticorpos monoclonais anti-
BrdU e nucleases.
2. A amostra é incubada com um anticorpo secundário contra o anticorpo
anti-BrdU.
3. A reação pode ser observada por microscopia de campo claro.
(Crane& Bhattacharya, 2013)

20. TESTE DE AMES
(Abhishek et al., 2018)
Teste de AMES involve microorganismos → Salmonella typhimurium é
usada para auxiliar na avaliação da potencial mutagenicidade e
carcinogenicidade de produtos químicos.
O ensaio é baseado na incapacidade dos mutantes autotróficos de histidina
de Salmonella typhimurium de crescer na ausência de histidina.
Por meio de seu efeito no DNA do microrganismo, alguns compostos
podem causar reversão para formas prototróficas que podem crescer na
ausência de histidina.

21. SOD
(Weydert & Cullen, 2010; Fukai & Ushio-Fukai, 2011)
SOD (superóxido dismutase) é o principal sistema de defesa antioxidante
contra O2•- (ânion superóxido) → Converte um radical superóxido tóxico
em peróxido de hidrogênio (H2O2) e oxigênio (O2).
A atividade da SOD pode ser medida por método bioquímico:
• A xantina-xantina oxidase é usada para gerar O2•-. A redução do
nitroblue tetrazolium (NBT) é um indicador da produção de O2•-.
• SOD compete com NBT por O2•− → O percentual de inibição da
redução do NBT é uma medida da quantidade de SOD presente.
• A catalase é incluída para remover o H2O2 produzido pela SOD. A
concentração original da proteína da amostra deve ser em torno de
20μg/μl.

22. CATALASE
Catalase é uma enzima que dissocia H2O2 em O2 e H2O.
A atividade da catalase é uma forma de medir a proteção contra o ataque
oxidativo por um alimento funcional ou suplemento nutricional.
Obtido pela medição da remoção de peróxido por um procedimento
espectrofotométrico.
Ensaio direto com cinética de pseudo-primeira ordem. Depende do
monitoramento da mudança de absorbância de 240nm em altos níveis de
solução de peróxido de hidrogênio (≥30mM).
A taxa de remoção de peróxido pela catalase é exponencial. A catalase
começa a ser inativada por H2O2 (em níveis >0,1M). H2O2 é consumido e
a catalase é inativada.

23. CATALASE
Os géis de atividade da catalase também podem ser usados.
Apresentam uma cor verde-azulada com largas bandas brancas onde a
enzima está presente. Após a separação da proteína nativa, a enzima
catalase remove os peróxidos da área do gel que ocupa.
A remoção do peróxido evita a redução do ferricianeto de potássio em
ferrocianeto de potássio, que reage com o cloreto férrico para formar um
precipitado de azul da Prússia.
Os géis de catalase terão uma banda que raramente satura e que fica maior
com o aumento da atividade da catalase.
(Ighodaro & Akinloye, 2018)

24. ENSAIO CAP-E
(Honzel, 2008)
Ensaio CAP-e (proteção antioxidante baseada em células eritrócitos) reflete
se os antioxidantes de produtos naturais podem entrar no citosol das células
vivas e protegê-las do dano oxidativo.
Inclui as seguintes etapas :
1. Os eritrócitos são expostos a um produto natural (antioxidantes entram
nas células).
2. Os antioxidantes não absorvidos são removidos e as células são
carregadas com um corante precursor.
3. Após um desafio oxidativo, o corante precursor emite luz fluorescente
em proporção à quantidade de dano oxidativo. A redução da
fluorescência é proporcional à proteção antioxidante.

25. ENSAIO ROS PMN
(Schauss et al., 2006)
O ensaio ROS PMN (espécies reativas de oxigênio em células
polimorfonucleares) monitora o efeito combinado de um produto de teste
em um tipo de célula inflamatória (PMN).
Este tipo de célula é uma parte importante de nossa defesa imune inata e
pode gerar ROS em resposta a danos oxidativos e estímulos pró-
inflamatórios.

26. ROS PMN ASSAY
(Honzel, 2008)
A célula PMN responde a compostos por 3 mecanismos diferentes:
1. Os antioxidantes penetram na célula e neutralizam os radicais livres
2. Compostos anti-inflamatórios medeiam a sinalização celular,
reprogramando a célula PMN para um comportamento menos
inflamatório → Redução na formação de ROS
3. Compostos pró-inflamatórios capazes de apoiar as funções imunes
inatas medeiam um sinal → Aumenta a função da célula PMN →
Aumenta a produção de ROS.
Os dados refletem uma combinação desses mecanismos operando em
paralelo.

27. ENSAIO DE PERMEABILIDADE CACO-2
(Lea, 2015)
Células Caco-2 (linha de células de carcinoma de cólon humano
polarizado) são usadas para analisar o processo de absorção de compostos.
No Ensaio de Permeabilidade Caco-2, monocamadas de células Caco-2 são
cultivadas em uma superfície permeável e colocadas em uma placa de
cultura de células para formar compartimentos doador-receptor.
Permite a medição do transporte de compostos em 2 direções: apical para
basolateral e basolateral para apical.

28. ENSAIO DE PERMEABILIDADE CACO-2
(Glahn, 2009)
A quantidade biodisponível do componente é representada pela quantidade
presente no extrato final.
A quantificação pode ser feita por meio de cromatografia líquida com
espectrometria de massa tandem.

29. • Abuajah, C. I., Ogbonna, A. C., & Osuji, C. M. (2015). Functional components and medicinal properties of food: a review.
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REFERÊNCIAS

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2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays. BMC research
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• D. Honzel, K. A. Redman, S. G. Carter, A. G. Schauss, J. R. Endres, L. Scherwitz, G. S. Jensen. Cell–based antioxidant
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Parallel Testing Using Erythrocytes and Polymorphonuclear Cells. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 56(18),
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• Lea T. (2015) Caco-2 Cell Line. In: Verhoeckx K. et al. (eds) The Impact of Food Bioactives on Health. Springer, Cham.
• Glahn, R. (2009). The use of Caco-2 cells in defining nutrient bioavailability: application to iron bioavailability of foods.
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REFERÊNCIAS