1) O estudo identificou geneticamente lagartas de Helicoverpa armigera em Roraima, Piauí e Bahia utilizando marcadores mitocondriais. 2) Foi encontrada evidência de fluxo gênico entre as populações do Norte e Nordeste do Brasil, indicando que H. armigera não está restrita a uma região. 3) Estudos futuros combinando DNA mitocondrial e nuclear são necessários para distinguir H. armigera de espécies similares como H. zea.

1. Universidade Estadual de Campinas
Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética
Identificação e Diversidade Genética de Populações
de Helicoverpa armigera do Norte e Nordeste do Brasil
Dr. Thiago Mastrangelo
Engº Agrônomo pela ESALQ/USP
PhD pelo CENA/USP
E-mail: mastrangelo@cbmeg.unicamp.br

2. Sumário
1. Introdução
– Crise Fitossanitária
– Identificação Morfológica de Helicoverpa armigera
– Novas incursões da praga no Brasil
– DNA barcoding
2. Material e Métodos
– Extração de DNA Total
– PCR, Purificação e Sequenciamento
3. Resultados
– Análises Filogenéticas
– Distâncias Genéticas
– DNA barcodes
– Rede de Haplótipos
– Diversidade Genética e Distribuição dos Haplótipos no Brasil
– Estrutura Genética das Populações
– Divergência Genética entre H. armigera e H. zea por 3 Genes Nucleares
4. Conclusões

3. 1. Introdução

4. 1. H. armigera x Crise Fitossanitária
• Praga de importância econômica no mundo:
- World: annual costs (control+yield losses) around US$ 5 billion (Lammers & MacLeod, 2007).
- China (1992): losses of US$ 1.3 billion in the Yellow River cotton region, North China (Sheng, 1993).
- India + China: 50% pesticides used to control H. armigera (Lammers & MacLeod, 2007).
- USA: 4,431 interceptions of H. 4,43 p armigera + Helicoverpa spp. since 1985 on fruits, vegetables and
ornamentals (Venette et al., 2003).
- USA: 1,400 interceptions at US ports between 2000 and 2004 (Passoa, 2004).

5. 1.2. Identificação Morfológica
(Pogue, 2004)

6. 1.3. Novas incursões da praga

7. Analysis of the Genetic Diversity and Structure of Cochliomyia hominivorax
Populations from the Brazilian Amazon basin

9. (Caterino et al. 2000; Hebert et al. 2003)
1. CATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTATCGAATAAACTGGGTGG
GTTGTTGCTGTCCCTCTCGGGGGAACTGTGCACGCCTTACCTTTTTTGTTTTTCCA………….. Helicoverpa assulta
2. CATTATTGAATAAACTTGGTTAGGTTGCTGCTGGCTCCTTGGAGCATGTGCACACCTAGCACCNTTTTTACCACCTGTGC
ACCCTTTGTAGACCTGGATACCTCTCGAGGAAACTCGGTTTGAGGACTTTTTTCCA………….. Helicoverpa armigera
OU
1. …………………………………..……………………………………………………Helicoverpa assulta
2. ….…………………………………………………………………………………... Helicoverpa armigera

10. 2. Material e Métodos

11. 2. Extração de DNA Total
Método Fenol:Clorofórmio (Lyra et al. , 2009)

12. 2. Extração de DNA Total
Ressuspendidos em 100 μμL de TE buffer Armazenados a -80 ºC

13. 2. Amplificação por PCR
• Primers: • Mix para PCR:
- COIF e COIR (Li et al., 2011)
- A-tLEU e B-tLYS (Liu & Beckenbach, 1992)
- 25 ng de DNA total
- 2,5 mM de MgCl2
- 0,25 mg/mL de BSA
-0,5 mM de cada primer
- 1,5 U de TaqDNA polymerase
- 10 x TaqBuffer
- EF-1α, IDH e RpS5 (Wahlberg & Wheat, 2008)
- 100 μM de dNTPs - Volume final: 25 μL
GeneAmp®PCR System
9700 thermal cycler
Condições
94oC 3’
94oC 30”
45 oC COI
2 μL
Gel agarose 1% em 1 x TAE
35 Ciclos
C - 48 ºC – COII
55 ºC - Nucleares
30”
70 oC
72 ºC – COII 1’ e 30”
oC ’
μ
70oC 7’
10oC forever

14. 2. Purificação e Sequenciamento
IllustraTMGFXTM kit
ABI3730xl DNA Analyzer sequencer

15. 3. Resultados

16. http://blast.ncbi.nlm.nih.gov
Basic Local Alignment Search Tool
http://www.boldsystems.org/

17. 3. Análises Filogenéticas – COI (658 pb)

18. 3. Distâncias Genéticas - COI

19. 3. DNA barcodes DNASP.V5 software

20. 3. Rede de Haplótipos – 96 sequências COI
arm13
arm12 PI‐7,16,17 RR‐5 arm11
arm7
TCS version 1.21 software
arm 1
PI‐1,2,6,8,9,10,11,13,20,21,22,
25,27,29,30,32,33,39
BA‐1 3 4 5 6 7 9 12
PI‐14,26,35
BA‐11
RR‐12
PI‐3,4
RR‐7
arm6
arm5
arm16
arm9
BA‐2
1,3,4,5,6,7,9,12
RR‐1,2,3,6,8
arm 2
PI‐5,12,15,18,19,23,24,28,
31,36,37
arm10
arm8
arm3
arm4
BA‐8, 10
arm15 RR‐4,9,10,11,13,14
PI‐38 arm14
PI‐34
13 mutations
11 mutations
H. gelotopoeon
10 mutations 6 mutations
5 mutations 6mutations
H. zea
(Li et al., 2011)
H. virescens
H. hawaiiensis
H. punctigera
6 mutations
25 mutations
39 mutations
H. assulta

21. 3. Diversidade Genética das Populações e Distribuição dos Haplótipos – COI + COII
‒ 22 haplótipos
‒Alta Ĥ e baixa π
‒ Fluxo Gênico

22. 3. Estrutura Genética das Populações – COI + COII
Arlequin v.3.5 software
As populações de H. armigera não estão estruturadas !

23. Grande Capacidade de Dispersão
• Esse padrão de variação genética é comum em
pragas capazes de se dispersar por longas
distâncias, como H. armigera (Daly & Gregg, 1985;
Zhou et al., 2000; Endersby et al., 2007) .
- Mark-recapture experiments Æ H. armigera
Moths can fly 200-300 km in a single night
(Pedgley, 1985)
y 3 g g
(Armes & Cooter, 1991).
-Barriers such as the Sahara desert had not prevented long
distance migration in H. armigera (Nibouche et al., 1998).

24. 3. Compatibilidade Reprodutiva entre H. armigera e H. zea

25. Problemas
• Problemas de usar apenas mtDNA:
- Genes COI + COII são informativos apenas quanto à herança maternal.
- Os 65 espécimes podem pertencer à linhagem original introduzida ou um híbrido
proveniente do cruzamento entre uma fêmea de H. armigera e um macho de H. zea.

26. 3. Divergência Genética

27. 1.2. Identificação Morfológica
(Pogue, 2004)

28. Cooperação Internacional
Austrália, China, Índia, Paquistão, Burkina Faso, Uganda
USA + Brasil

29. Publicação Internacional

30. 4. Conclusões
1) Há fortes evidências genéticas de que as lagartas analisadas de Roraima, Piauí e
Bahia são Helicoverpa armigera.
2) Estudos futuros combinando mtDNA e novos marcadores nucleares com linhagens
puras e híbridos de H. armigera e H. zea são necessários para a elaboração de
protocolos de identificação para essas duas espécies.
3) Enquanto esses protocolos estão sendo desenvolvidos, sistemas de identificação
baseados em mtDNA podem continuar provendo informações diagnósticas e de
origem geográfica que excedem aquelas que podem ser alcançadas utilizando-se
apenas chaves morfológicas.

31. 4. Conclusões
4) Há evidência de fluxo gênico entre as populações do Norte e Nordeste do Brasil.
5) H. armigera não está restrita apenas ao Brasil central ou Nordeste, tendo cruzado a
região amazônica.
6) Amostragens na Venezuela e Colômbia devem ser iniciadas o quanto antes para se
poder monitorar a entrada ou avanço dessa praga na América Central e EUA.

32. Muito Obrigado !