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  1. 1. Práticas de Biologia Celular PUBLICAÇÃO DIDÁTICA FARMACIA Profa. Responsável: Lílian Carla Carneiro Trindade, GO 2007
  2. 2. 1. Objetivos gerais da disciplina  descrever a estrutura, composição química e fisiologia das células, como um fundamento para a compreensão dos demais níveis de organização;  relacionar os conceitos apresentados em aula teórica com as observações práticas;  treinar o manuseio do microscópio de luz (instrumental básico utilizado para o estudo da célula);  desenvolver hábitos de trabalho em laboratório. 2. Regimento da disciplina biologia celular • Não é permitida a entrada de alunos após 15 minutos do início das aulas. • A freqüência dos alunos é controlada por chamada oral. • As aulas práticas são baseadas na Apostila “Biologia Celular – Aulas Práticas”, uma publicação didática do Curso de Ciências Biológicas da UEG - Unidade Universitária de Morrinhos. 4. BIBLIOGRAFIA BÁSICA: ALBERTS, B.; BRAY, D.; LEWIS, J.; RAFF, M.; ROBERTS, K.; WATSON, J. D. Biologia molecular da célula. 3a ed., Porto Alegre, Editora Artes Médicas, 1997. 1294p. De ROBERTIS, E. D. P.; ROBERTIS Jr., E. M. F. Bases moleculares da Biologia celular e molecular. 3a ed., Rio de Janeiro, Editora Guanabara Koogan, 2000. 307p. JUNQUEIRA, L. C.; CARNEIRO, J. Biologia celular e molecular. 7a ed., Rio de Janeiro, Editora Guanabara Koogan, 2000. 339p. KARP, G. Biologia celular e molecular - conceitos e experimentos. Manole, São Paulo, 2005, 786p. LODISH, H.; BERK, A.; MATSUDAIRA, P.; KAISER, C.A.; KRIEGER, M.; SCOTT, M.P.; ZIPURSKY, L.; DARNELL, J. 2004. Molecular Cell Biology. 5° Ed. Freeman, New York. 5. Disposições gerais Para um melhor aproveitamento das aulas práticas os alunos deverão: TRAZER A APOSTILA A TODAS AS AULAS; 1. Antes do início da aula, o aluno deve ler atentamente as instruções para cada exercício. Deve procurar trabalhar com iniciativa própria. 2
  3. 3. 2. No fim de cada exercício há sempre perguntas às quais o aluno deverá responder, após discuti-las com os colegas do grupo ou de acordo com consultas aos textos das aulas teóricas; 3. O aluno é responsável pelo material que lhe é fornecido: microscópio, lâminas, pinças, vidraria, etc. Deve zelar pela boa manutenção dos mesmos, lembrando-se de que os colegas de outras turmas farão uso desses mesmos materiais. 3
  4. 4. SUMÁRIO Práticas de Biologia Celular................................................................................................1 PUBLICAÇÃO DIDÁTICA.......................................................................................................1 Grupo 1....................................................................................................................................5 Grupo 2....................................................................................................................................5 Grupo 3................................................................................................................................5 Grupo 4................................................................................................................................5 Aerossóis - São micropartículas sólidas ou líquidas com dimensão aproximada de 0,1µ e 50µ, que podem permanecer em suspensão em condições viáveis por várias horas...........5 Vias aéreas de penetração....................................................................................................5 Via de penetração cutânea...................................................................................................5 Contaminação via ocular.....................................................................................................5 Contaminação via oral.........................................................................................................6 Proteção individual..............................................................................................................6 Proteção coletiva.................................................................................................................6 Regras Básicas de Segurança..............................................................................................6 Considerações finais............................................................................................................7 Prática no 1..................................................................................................................................8 Utilização do microscópio de luz................................................................................................8 Técnicas de estudo das células..................................................................................................14 Prática no 2................................................................................................................................19 Técnicas de preparo de materiais para microscopia de luz.......................................................19 1.Conceitos abordados...............................................................................................................19 Prática no 3................................................................................................................................26 Métodos de estudo da célula e morfologia celular....................................................................26 Prática no 4................................................................................................................................29 Organelas e macromoléculas podem ser separadas por centrifugação......................................29 Prática no 5................................................................................................................................32 Comparando células procarióticas e eucarióticas......................................................................32 Prática no 6................................................................................................................................35 Isolando o DNA* na cozinha....................................................................................................35 Prática no 7................................................................................................................................37 Estudando a passagem de solutos e solventes pela membrana plasmática................................37 Prática no 8................................................................................................................................39 Observando osmose nas células vegetais..................................................................................39 Prática no 9................................................................................................................................41 Cloroplastos e mitocôndrias......................................................................................................41 Prática no 10..............................................................................................................................42 Prática no 11..............................................................................................................................43 Mitose........................................................................................................................................43 BIOSSEGURANÇA 4
  5. 5. BIOSSEGURANÇA - e o conjunto de ações voltadas para prevenção, minimização ou eliminação de riscos inerentes às atividades de pesquisa, produção, ensino, desenvolvimento tecnológico e prestação de serviços, as quais possam comprometer a saúde do homem, dos animais, do meio ambiente ou a qualidade dos trabalhos desenvolvidos. Os agentes biológicos são considerados de acordo com a patogenicidade para o homem; a virulência, o modo de transmissão; a endemicidade; a existência ou não de profilaxia e de terapêutica eficaz. Existem 4 grupos distintos; GRUPO 1  Esta classe possui baixo risco individual e coletivo;  Microorganismos nunca descritos como agente causador de doenças para o homem, e que não constituem risco para o meio ambiente;  Exemplos: Bacillus cereus, Escherichia coli. GRUPO 2  Esta classe possui risco individual moderado e risco coletivo limitado;  Microorganismos que podem provocar doenças ao homem, com pouca probabilidade de alto risco para os profissionais de laboratório;  Exemplos: Schistossoma mansoni, Wuchereria bancrofti e Sporothrix schenckii. GRUPO 3  Esta classe possui risco individual elevado e risco coletivo baixo, podendo causar enfermidades graves aos profissionais de laboratório;  Exemplos: Mycobacterium tuberculosis, HIV e Trypanossoma cruzi. GRUPO 4  Esta classe agrupa os agentes que causam doenças graves para o homem e representam um sério risco para os profissionais de laboratório e para a coletividade;  Possui agentes patogênicos altamente infecciosos que se propagam facilmente, podendo causar a morte rapidamente;  Exemplos: Vírus Ebola; Lassa; Machup; Marbug. AEROSSÓIS - São micropartículas sólidas ou líquidas com dimensão aproximada de 0,1µ e 50µ, que podem permanecer em suspensão em condições viáveis por várias horas. VIAS AÉREAS DE PENETRAÇÃO  Pipetagem, centrifugação e abertura da centrífuga em funcionamento;  Maceração de tecidos, sonicação, agitação; flambagem com alça de platina;  Abertura de ampolas liofilizadas;  Manipulação de fluidos orgânicos, abertura de frascos com cultura de células. VIA DE PENETRAÇÃO CUTÂNEA  Picada com agulhas contaminadas;  Corte com vidraria quebrada ou trincada;  Corte por instrumentos perfurocortantes contaminados; CONTAMINAÇÃO VIA OCULAR  Ocorre em decorrência de projeção nos olhos de gotículas de material infectante;  As oculares de microscópios e aparelhos ópticos contaminados são grande fonte de infeção. 5
  6. 6. CONTAMINAÇÃO VIA ORAL  Pipetagem pela boca;  Hábito de fumar;  Roer as unhas;  Comer dentro do laboratório.  Boas práticas no laboratório  Lavar as mãos antes e após a jornada de trabalho;  Nunca pipete com a boca;  Não comer ou preparar alimentos;  Não beber nem fazer higiene bocal, maquilagem, depilação ou barbear-se e roer as unhas;  Manter os artigos de uso pessoal fora do laboratório;  Não use sapatos abertos;  Não trabalhar sozinho no laboratório. PROTEÇÃO INDIVIDUAL  Protetor facial  uso de jaleco  óculos de segurança  luvas cirúrgicas  pêra de borracha  pipetador automático  máscaras PROTEÇÃO COLETIVA  Protegem o profissional e o meio ambiente:  Câmeras de fluxo laminar  lava olhos  chuveiro de emergência REGRAS BÁSICAS DE SEGURANÇA  Conhecimento dos riscos laboratoriais;  Treinamento;  Aquisição de manual de segurança;  Cumprir as instruções de segurança;  Usar os equipamentos de proteção individual e coletiva;  Eliminar foco de exposição ao risco:  Manter bancadas limpas e livres  rotular o material de estudo  limpar imediatamente o derramamento de material biológico  evitar a formação de aerossóis  Comunicar situações de risco e acidentes. PROCEDIMENTO DE DESINFECÇÃO EM CASO DE ACIDENTES 1. Derramamento simples de material líquido contaminado, com pouca formação de aerossol (grupo de risco 1 e 2): 6
  7. 7.  cobrir a área afetada com toalha papel  colocar o desinfetante apropriado sobre o papel  aguardar 30 minutos  remover os papéis com pinça e colocá-los em saco plástico (usar luvas)  aplicar novamente o desinfetante esfregando-o 2. Derramamento de material líquido contaminado com formação de aerossóis (Ex.: gotas caindo da pipeta):  prender a respiração  abandonar a área por alguns minutos  proceder como o caso de derramamento simples 3. Queda de culturas em meio líquido ou sólido com quebra de recipiente:  prender a respiração  abandonar a área  trancar a porta colocando um aviso  aguardar 30 minutos  certificar-se da natureza do microorganismo envolvido para decidir sobre a proteção necessária e desinfetante a ser utilizado CONSIDERAÇÕES FINAIS  Acidentes são causados por atos inseguros ou condições inseguras;  Nunca permaneça em um laboratório sem o professor ou técnico responsável;  Reagentes químicos ou agente patogênicos apresentam maior risco;  Tenha o nº do telefone do corpo de bombeiros sempre em local visível;  Se eu não sei algo: PERGUNTAR É A ÚNICA SOLUÇÃO! Instruções de Laboratório, Reconhecimento e Manuseio do Microscópio Ordem: 1- Arrume em ordem o material necessário para cada experiência - isso evita confusão; 2- Use sempre o jaleco e/ou máscaras e/ou luvas quando necessário; 3- Etiquete cuidadosamente todo o material; 4- Depois de usar lavar e/ou limpar, reponha o material no devido lugar. Limpeza: 1- Depois de usar, lave a vidraria e enxágüe várias vezes em água limpa; 2- Não jogue o material usado na pia; 3- Deixe o seu lugar tão limpo como gostaria de encontrar. Precauções: 1- Sempre que ocorrer um acidente no trabalho, avise imediatamente ao professor; 2- Quando aquecer uma substância em um tubo de ensaio, não aponte a extremidade aberta para você ou para outra pessoa; 3- Nunca prove uma droga ou uma solução, a não ser com permissão do professor; 4- Se qualquer substância cair na sua pele, lave-a imediatamente com água corrente; 5- Leia os rótulos dos frascos antes de usar as substâncias nele contidas; 6- Quando qualquer substância cair no chão ou na mesa, lave o local imediatamente; 7- Ao lidar com vidraria, proceda com cuidado para evitar quebras e cortes perigosos; 7
  8. 8. 8- Substâncias inflamáveis devem ser aquecidas em banho-maria ou em chapa elétrica; 9- Em caso de dúvida sobre o uso de uma substância, consulte o professor. Atitude: 1- Use o tempo de laboratório para realizar apenas o exercício indicado para aula prática; 2- Leia antes da aula as instruções para o exercício do dia; 3- Siga todas as instruções cuidadosamente; 4- Registre os resultados em um caderno reservado para esse fim; Relatório 1- Faça os relatórios seguindo as instruções do seu professor; 2- A linguagem deve ser clara e sucinta; 3- Os desenhos e gráficos devem ser traçados com linhas firmes e a lápis; 4- Se for usar cores para os desenhos, elas devem ser fiéis ao visto em laboratório (Não copiar desenhos de atlas ou colegas); 5- Para cada experiência poderá ser feito um relatório sucinto que deverá constar de: Título, Objetivo, Introdução, Material utilizado, Procedimentos, Resultados, Discussão, Conclusões. ATENÇÃO: QUALQUER ATITUDE DO ALUNO QUE VENHA COLOCAR EM RISCO DE ACIDENTE O LABORATÓRIO OU UM COLEGA, IMPLICARÁ NA DISPENSA DO MESMO DAS AULAS PRÁTICAS. Prática no 1 Utilização do microscópio de luz 8
  9. 9. 1. Conceitos abordados O microscópio de luz é um aparelho utilizado para observação de objetos muito pequenos, impossíveis de serem examinados, em detalhes, a olho nu. O tipo de microscópio mais utilizado nos estudos citológicos é o composto, que é constituído basicamente por duas lentes convergentes. Neste microscópio a luz atravessa o objeto observado e o conjunto de lentes, antes de atingir o olho, formando uma imagem bidimensional. Assim, o objeto deve ser delgado o suficiente para que a luz atravesse-o. 1.1. Descrição dos componentes do microscópio O microscópio é composto, basicamente por dois sistemas: o óptico, formado pelas lentes e o mecânico que as sustenta. A seguir, encontram-se descritas cada uma das partes desses sistemas. A. Pé ou Base: é o suporte do microscópio, peça que sustenta todas as outras. B. Corpo ou Braço: é a peça que liga a base à parte superior do microscópio. C. Platina ou Mesa: é uma peça de formato retangular, ou arredondada, disposta paralelamente à direção da base do microscópio. Esta peça se destina à recepção da lâmina contendo o material para estudo. No centro da platina existe uma abertura para a passagem de luz. Associada à platina, normalmente, encontra-se uma peça denominada “charriot” cuja função é movimentar a lâmina no plano horizontal. Os dois parafusos dispostos lateralmente à platina, um sobre o outro, promovem a movimentação do “charriot”. O parafuso mais externo (de menor diâmetro) permite o deslizamento da lâmina da esquerda para direita e vice-versa. O parafuso de diâmetro maior é responsável pelo movimento da lâmina para frente e para trás. Acoplada ao “charriot”, há uma presilha que permite o encaixe e fixação da lâmina. 9
  10. 10. D. Fonte de luz: há uma fonte de luz apoiada sobre o pé do microscópio. Alguns microscópios possuem apenas um espelho para refletir a luz de uma fonte externa. E. Filtro: é uma placa de vidro colorida (azul, verde, etc.) fixada a um receptáculo, que torna a luz mais apropriada à observação do material. O filtro azul é usado em microscópio de rotina para transformar a luz amarelada da lâmpada em luz branca tipo luz solar. F. Condensador: é um conjunto de lentes situado abaixo da platina, que concentra e torna paralelo o feixe luminoso, fornecendo a luz necessária à iluminação uniforme do objeto em estudo. O “parafuso” do condensador, localizado lateralmente no braço do microscópio, permite a movimentação das lentes condensadoras que devem ser mantidas na posição mais elevada para obtenção de uma iluminação uniforme. G. Diafragma ou Íris: é uma peça associada ao condensador, regulável mediante uma alavanca, que controla a quantidade de luz que atinge o orifício da platina. A regulagem adequada deste diafragma oferece uma imagem com melhor contraste. H. Canhão: é a parte superior do microscópio, dotada de movimento de rotação constituída por uma peça semi-esférica, ligado a um tubo em cuja extremidade encontra-se a lente ocular. I. Revólver: localizado abaixo do canhão. O revólver é uma peça circular dotada de movimento de rotação, no qual se inserem as lentes objetivas. O disco do revólver possui ranhuras para que o observador possa gira-lo para as mudanças de objetivas. J. Ocular: é a lente superior do microscópio que se encaixa no tubo. Toda ocular traz indicado o aumento que proporciona à imagem do objeto observado. K. Objetivas: o microscópio possui, geralmente, quatro lentes objetivas. Toda objetiva traz gravado o aumento que proporciona à do objeto observado. Este aumento é indicado pelo número gravado com caracteres maiores. O número gravado com caracteres menores refere-se a abertura numérica da lente, um detalhe da óptica. 10
  11. 11. L. Parafuso macrométrico: na lateral do braço existem dois parafusos, geralmente, encaixados um no outro. O de maior diâmetro é o parafuso macrométrico, que permite grandes avanços ou recuos da platina em relação à objetiva. M. Parafuso micrométrico: esse parafuso permite pequenos avanços ou recuos da platina. Apresenta um menor diâmetro, podendo estar próximo ou associado ao macrométrico. N. Trava: junto ao braço do microscópio pode existir uma alavanca que trava o movimento do parafuso macrométrico em uma determinada posição, impedindo a movimentação da platina e protegendo as objetivas contra possíveis choques. Objetivos • Identificar e citar as funções de cada componente do microscópio de luz. • Relacionar a imagem formada e os aumentos obtidos com o funcionamento do sistema óptico. • Manusear corretamente o microscópio. 2. Procedimentos corretos para a focalização - Abaixe a mesa totalmente usando o parafuso macrométrico. Gire o revólver, encaixando a objetiva de menor aumento (4X). Verifique pelo ruído característico do encaixe se a objetiva está realmente encaixada. - Pegue a lâmina, segurando-a apenas pelas bordas. Verifique se a lamínula está voltada para cima. - Abra a presilha e coloque a lâmina sobre a platina, encaixando- a ao “charriot”. Solte a presilha e verifique se a lâmina está bem encaixada. Centralize o material no orifício da platina, utilizando os parafusos do “charriot”. - Acenda a luz do microscópio. - Verifique se o diafragma está aberto, olhando lateralmente se há passagem de luz através do orifício da platina. Caso seja necessário, abra o diafragma, movimentando a alavanca correspondente. 11
  12. 12. - Certifique-se se o condensador encontra-se em posição mais elevada. - Levante a platina até o seu ponto máximo movimentando o parafuso macrométrico, até o seu ponto máximo. - Agora, olhando através da ocular, com os dois olhos abertos e utilizando o parafuso macrométrico, abaixe lentamente a platina, até que o material a ser observado seja visto. Assim que isto ocorrer, corrija a focalização utilizando o parafuso micrométrico. - Explore o material, movimentando os parafusos do “charriot” com uma das mãos e o parafuso micrométrico com a outra. Coloque sempre o material a ser analisado no centro do campo de observação, antes de passar para a objetiva de aumento imediatamente superior. - Encaixe a objetiva de 10X e faça o ajuste da focalização, utilizando apenas o parafuso micrométrico. Observe o campo atentamente. - Selecione uma determinada área do material, centralize-a e encaixe a objetiva de 40X. Faça o ajuste da focalização, utilizando somente o parafuso micrométrico. - Terminando a observação, desligue a luz, gire o revólver para encaixar a objetiva de menor aumento (passando pela objetiva de 10X) e retire a lâmina. Obs. Nunca movimente a platina do microscópio com a objetiva de maior aumento encaixada. 3. Atividades de Fixação Você irá usar, na maioria das aulas práticas de BIOLOGIA CELULAR, o microscópio. Daí a necessidade de Você aprender a explorar todas as possibilidades deste instrumento ótico, bem como dos cuidados que Você deve ter com ele. LEIA COM ATENÇÃO O APÊNDICE DESTA AULA E VOLTE A ELE SEMPRE QUE TIVER DÚVIDAS. 1. Agora, o Professor irá lhe explicar como usar o microscópio e quais os cuidados que Você deve ter com ele. 12
  13. 13. • Retire da caixa a lâmina contendo a letra A e coloque-a sobre a platina, de modo a manter a letra na posição em que ela é lida, • Observe a posição da letra na imagem formada pelo microscópio com a objetiva de 4X. • Após a observação responda: a) Faça os esquemas da posição e do tamanho da letra observada, a vista desarmada e nos aumentos de 10X e 40X. Lâmina 10X 40X b) Qual a diferença quanto à posição da imagem da letra vista ao microscópio em relação a sua posição real observada a vista desarmada? _______________________________________________ c) Por que centralizar o material observado no campo de observação, a cada mudança de objetiva? ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ 2. Observação de organismos microscópios - Coloque sobre uma lâmina uma gota de água proveniente de um lago. - Cubra com uma lamínula encostando uma de suas bordas na gota e deixando-a descer suavemente, minimizando a formação de bolhas de ar. - Focalize. - Observe os organismos em diferentes campos de observação utilizando-se os parafusos do “charriot”. 13
  14. 14. - Desenhe o que observou. OBS. Para observar organismos mais transparentes, diminua a luminosidade usando o diafragma. Figura 1 - O Microscópio 1 = ocular 2 = objetivas e revólver 3 = platina 4 = charriot 5 = macrométrico 6 = micrométrico 7 = diafragma no condensador 8 = condensador 9 = botão do condensador 10 = dois parafusos centralizadores do condensador 11 = fonte de luz 12 = controle de iluminação 13 = diafragma de campo (alavanca no lado esquerdo do microscópio) 14 = dois parafusos de ajuste da lâmpada (esquerdo e direito) 15 = focalizadora da lâmpada (alavanca no lado direito do microscópio - não visível no fotografia) TÉCNICAS DE ESTUDO DAS CÉLULAS A história das ciências morfológicas é em larga escala a crônica da descoberta de novos métodos de preparação para os diferentes materiais e do desenvolvimento de instrumentos ópticos cada vez mais poderosos (Fawcett, 1982). Foi a construção do primeiro microscópio e o uso deste aparelho para o exame de diferentes materiais biológicos que possibilitou a elaboração da TEORIA CELULAR, segundo a qual todos os seres vivos têm como unidade mínima de estrutura e definição, a célula. Robert Hook, foi o primeiro a detectar a existência das células, a partir de estudos em cortiças. Em 1838, o botânico Mathias Scheidem e em 1939 o zoólogo Teodor Schwan fizeram a teoria segundo a qual, todos os organismos vivos são constituídos por células, com exceção dos vírus. A moderna doutrina celular se resume em 4 ítens:  A célula é a menor unidade de vida 14
  15. 15.  A vida é gerada pelo metabolismo que representa as reações químicas geradas pelos elementos químicos existentes dentro de uma célula;  Todo ser pluricelular provém de uma outra célula - o zigoto  Todas as células provém de outra preexistente A partir daí, os conhecimentos sobre a célula têm progredido paralelamente ao aperfeiçoamento dos métodos e aparelhos de investigações, principalmente ao da microscopia. Foram descobertas técnicas citoquímicas para a identificação e localização de diversas moléculas constituintes da células. Com o advento dos microscópios eletrônicos, que tem grande poder de resolução, foram observados pormenores da estrutura celular que não poderiam sequer se imaginados pelos estudos feitos com os microscópios ópticos. Mais ou menos simultaneamente com o uso da microscopia eletrônica foram aperfeiçoados métodos de separação de organelas celulares e para o estudo in vitro de suas moléculas e respectivas funções, permitindo manipular o genoma, dentre outras funções. Estudo de células vivas (“in vivo”) O exame de células vivas não permite um tempo prolongado de estudo devido ao tempo vital da célula. Também o material transparente não permite a distinção de determinadas estrutura, necessitando-se para isso o uso de corantes específicos. Para análise de um material vivo é necessário portanto:  Colocar uma gota de suspensão do material em questão na lâmina;  Cobrir a lâmina com a lâmínula;  Levar a lâmina ao microscópio para a análise. Exame de células em cultura (“in vivo”) As células de tecidos animais ou vegetais podem ser mantidas vivas e até crescerem, por períodos bastante longos desde que mantidas em meios que produzam as condições naturais que lhes eram próprias. São chamados meios de cultura, nos quais deverão estar presentes todos os nutrientes e sais minerais necessários para a sobrevivência das células, além das condições adequadas de temperatura, pH e oxigenação. 15
  16. 16. Colorações vitais: Quando se desejar corar os microorganismos, sem contudo matá-los, lança-se mão dos corantes atóxicos como o azul de metileno, vermelho neutro, etc.... em solução aquosa a 1%. Pode ser usada a mesma técnica do exame a fresco, já descrita, apenas submetendo o material a examinar à ação de um corante vital. Dessa forma o material aparece corado, sem que seja afetada sua vitalidade. Estudo de células em preparações permanentes Estudo de células vivas apresentam limitações como resolução do material e estocagem. Assim, desenvolveu-se técnicas que superavam esses fatores limitantes, onde as células são fixadas e coradas para melhor demonstração de seus componentes. Existem vários tipos de preparação de lâminas permanentes, de acordo com o material que está sendo analisado. Confecção de cortes para estudo em microscopia óptica e eletrônica:  A fixação é a primeira etapa na obtenção de um preparado permanente evitando a autólise da célula, impede a proliferação de bactérias, endurece a célula para que ela resista mais e aumenta a afinidade das estruturas celulares pelos corantes usados na microscopia. 16
  17. 17.  É necessário fazer cortes delgados para análise de estruturas celulares utilizando-se para isso o micrótomo. Corantes: Quase todas as organelas são transparentes e incolores, o que dificulta o seu estudo, para isso é necessário utilizar-se de corantes específicos para visualizar partes específicas de uma célula. Corantes foram definidos por Langeron como substâncias coradas que permitem transmitir a propriedade de sua cor a outros corpos. Muitas são as substâncias corantes, sendo que quase totalidade são derivadas da anilina. Classificam-se em Naturais: destacam-se o carmim, a hematoxilina ou Artificiais: também conhecidos por corantes da anilina, sendo os com maior destaque os básicos (ou nucleares – violetas de genciana, cristal de violeta, verde de malaquita, azul de metileno, fucsina básica, azul de tolidina, verde de metila), ácidos (ou citoplasmáticos – eosina, fluoresceína, fucsina ácida, orange G, vermelho congo, aurância, ácido pícrico) e neutros (eosinato de azum de metileno e de azul AZUR, giemsa). 17
  18. 18. A maioria dos corantes comporta-se como base ou como ácido. Nos corantes básicos, o grupamento responsável pela cor é catiônico, combinando com os grupamentos ácidos das moléculas celulares. Já os corantes ácidos são anionicos e combinam-se com os componentes básicos celulares. 18
  19. 19. Prática no 2 Técnicas de preparo de materiais para microscopia de luz 1.Conceitos abordados O estudo dos seres vivos em nível citológico é limitado por três fatores principais: as pequenas dimensões da maioria das células, a falta de contraste entre as estruturas celulares, a espessura e o tamanho dos órgãos que se pretende estudar. Em conseqüência, a análise da estrutura e organização celular não depende somente do uso do microscópio, mas também de técnicas básicas de preparo do material biológico. Na utilização do microscópio de luz, a lâmina de vidro serve como um suporte para o material. O processamento do material biológico, desde sua obtenção até a montagem sobre a lâmina, consiste de uma série de passos que concorrem, direta ou indiretamente, para a manutenção das características originais das células e para uma boa observação. Nos estudos citológicos pode-se utilizar materiais frescos ou fixados. Essa escolha deverá atender aos objetivos do trabalho. A. MATERIAIS FRESCOS Utilizam-se preparações a fresco quando não existe interesse na sua preservação. O material é preparado imediatamente após sua obtenção e, depois de observado, é descartado (Lâminas não permanentes). Como exemplo destas preparações podemos citar: esfregaço de líquidos corporais, cortes feitos a mão livre em tecidos vegetais, entre outros. B. MATERIAIS FIXADOS A fixação é uma operação muito importante e crítica, sendo empregada naqueles materiais que serão preservados por longos períodos de tempo. Ela 19
  20. 20. envolve a morte e a preservação das células de um órgão ou de um tecido que serão posteriormente estudados. Um bom fixador é aquele que modifica o mínimo possível a composição química das células e preserva o máximo possível a sua estrutura. Utilizando-se materiais fixados pode-se preparar tanto lâminas permanentes quanto lâminas não permanentes, esta escolha deverá atender aos objetivos do trabalho. Existem diversos tipos de preparações onde pode-se obter lâminas permanentes: 1) Esmagamento Alguns materiais podem ser esmagados entre lâmina e lamínula obtendo- se células suficientemente isoladas. Após a fixação, pequenos fragmentos do material fixado são comprimidos sob a lamínula, que pode ser removida, quando necessário, com nitrogênio líquido. 2) Decalque É obtido ao se comprimir suave e firmemente a superfície de um fragmento do material fresco sobre uma lâmina. As células superficiais se destacam e aderem à lâmina, sendo posteriormente fixadas e coradas. Geralmente, as células se rompem e tais preparados são úteis na obtenção de núcleos livres no citoplasma. 3) Esfregaço É feito com líquidos corporais, como o sangue. Coloca-se uma gota do líquido sobre a extremidade de uma lâmina que, com o auxílio de uma segunda lâmina inclinada sobre a primeira, o material é espelhado uniformemente. A preparação é deixada secar ao ar, fixada e corada. Algumas dessas preparações dispensam o uso de lamínulas. 20
  21. 21. 2. Descrição geral das etapas de preparação de lâminas 2.1. Coleta A coleta do material deve ser precedida de estudos que garantam a obtenção do objeto de estudo em melhor condição possível. Quando se pretende estudar in vivo a análise é feita imediatamente após a coleta; preservando assim, as condições do material. Se o estudo for in vitro após a coleta o material deve ser fixado. 2.2. Fixação A fixação consiste no tratamento de células ou tecidos com agentes que estabilizem as estruturas como se as mesmas estivessem vivas. Deve se levar em consideração na escolha do fixador:  o poder de penetração,  capacidade de causar morte,  não alteração morfológica das células e tecidos e,  propiciar boa conservação do material. São exemplos de fixadores:formol 5%; álcool 70%; tetróxido de ósmio; ácido crômico; ácido acético 45% além de misturas. 2.3. Cortes Os cortes são imprescindíveis em materiais multicelulares, como tecidos vegetais e animais, para permitir a passagem de luz pelo material (pré- requisito básico para a preservação do material ao microscópio) e o estudo de estruturas complexas, por possibilitar uma visão ampla das camadas mais internas e a individualização de células. 21
  22. 22. 2.3.1. Interpretação de cortes É importante notar que, um único corte não permite resolver a forma de uma dada estrutura. No exemplo que se segue, uma secção horizontal de três objetos diferentes, apresenta a mesma configuração. Objetos Pode-se, no entanto, obter informações adicionais, observando-se cortes do mesmo objeto em diferentes direções. Isto requer, naturalmente, que se disponha de mais de um exemplar do objeto. Em um corte longitudinal, os objetos A, B e C apresentariam, respectivamente, as seguintes configurações: 22 A B C A B C A B C
  23. 23. 23
  24. 24. Os cortes podem ser de 4 tipos: transversal (quando feito paralelamente ao menor comprimento do material), Longitudinal (quando feito paralelamente ao maior comprimento do material); Oblíquo (quando a direção do corte não está relacionada a nenhum eixo) e paradérmico (paralelo à superfície do órgão – obtenção de epidermes). Estes diferentes cortes são importantes para que possamos construir a visão tridimensional das estruturas celulares. Deve-se ter em mente que a figura que se vê representa apenas uma secção do objeto. Essa figura é bidimensional, e as estruturas têm três dimensões. Por esse motivo, para construção do modelo tridimensional das estruturas observadas, utilizando a microscopia, deve-se ou fazer vários tipos de cortes ou, fazer uma série de cortes seqüenciais. Além disso, algumas estruturas, devido à sua localização, não 24
  25. 25. são reveladas em todos os tipos de corte, devendo-se verificar o tipo de corte adequado para cada estudo. 2.4. Coloração Quando o material a ser observado é translúcido, ou, quando se quer observar estrutura específica torna-se necessário o uso de corantes, que são substâncias capazes de transferir cor a outras substâncias, propiciando contraste entre as estruturas e o meio. 3. Objetivos  Descrever as metodologias comumente utilizadas no preparo de materiais citológicos;  Conhecer os passos do preparo de lâminas permanentes e justificar os propósitos de cada um.  Interpretar imagens de cortes histológicos e reconstruir formas tridimensionais a partir delas. 4. Atividades de fixação A. Montagem de lâminas permanentes a partir de materiais incluídos em historesina.  Observe a seqüência de trabalho montada na bancada lateral do laboratório. Na seqüência estão representados os passos envolvidos no preparo de lâminas permanentes.  Após as observações responda as questões. a. Os materiais, para serem observados ao microscópio, devem ser delgados, por que? b. Cite 4 maneiras de se preparar materiais para serem observados ao microscópio. c. Qual a importância da fixação dos materiais? d. É possível preparar uma lâmina permanente utilizando-se materiais frescos (não fixados). Explique. e. Comente sobre a utilização de cortes seqüenciais. 25
  26. 26. Prática no 3 Métodos de estudo da célula e morfologia celular 1. Conceitos abordados A biologia celular e molecular estuda objetos muito pequenos, por isso depende inteiramente do aperfeiçoamento dos instrumentos e das técnicas de pesquisa. Alguns métodos para estudo da célula: microscopia, fracionamento celular, métodos citoquímicos, métodos imunocitoquímicos e radioautografia. Abaixo são apresentados diferentes níveis de estrutura biológica (adaptado de De Robertis & De Robertis Jr., 2000): Dimensão Área de Estudo Estruturas Métodos para Visualização 0,1 mm (100µm) ou mais Anatomia Órgãos Olho humano; lentes simples 100-10µm Histologia Tecidos Microcópios ópticos 10-0,2µm (200nm) Citologia Células, bactérias Microscopia de raios X 200-1nm Morfologia submicroscópica e ultra-estrutura molecular Componentes celulares e vírus Microscopia de polarização; Microscopia eletrônica Menos de 1nm Estrutura molecular e atômica Disposição dos átomos Difração de raios X 2. Métodos de estudo da célula 2.1. Microscopia • Microscópio óptico compõe-se de uma parte mecânica, que serve de suporte, e uma parte óptica, constituída por três sistemas de lentes: o condensador, a objetiva e a ocular.  O conhecimento atual sobre as células foi obtido nos últimos 25/30 anos após o desenvolvimento da microscopia eletrônica. A principal vantagem conferida por esse equipamento é seu maior poder de resolução que permitiu o estudo da ultra-estrutura ou morfologia sub-microscópica da célula. 26
  27. 27.  Os cortes para observação no microscópio eletrônico (M.E.) são muito finos, geralmente de 20 a 50 nm de espessura, fixados e contrastados com contrastantes próprios à microscopia eletrônica, tal como o tetróxido de ósmio. 2.2 Bases ópticas da microscopia – formação de imagem A luz, que atravessa as lentes condensadoras, é uniformemente espalhada sob a lâmina e atravessa o objeto observado incidindo na lente objetiva. Estando o objeto colocado anteriormente ao ponto focal da lente objetiva, formar-se-á, no plano focal da lente ocular, uma imagem real (que pode se projetada em um anteparo), maior e invertida. A luz, ao atravessar a ocular, formará uma imagem virtual, maior e direita com relação à imagem formada pela objetiva. Deste modo, a imagem final do objeto, proporcionada pelo microscópio, será virtual, maior e invertida em relação ao mesmo. O observador ao examinar o material verá uma imagem real e invertida, pois a luz ao atravessar o cristalino do olho formará uma imagem real e invertida com relação a imagem formada pela ocular. O cérebro inverte esta imagem. O aumento final da imagem é resultado do produto do aumento proporcionado pelas lentes oculares e objetivas. Veja a figura abaixo: 27
  28. 28. Figura 2. Princípio de funcionamento do microscópio de luz Poder de resolução – O termo poder de resolução refere-se à capacidade de um sistema ótico de discriminar a imagem de um objeto que se encontra em seu campo de visão. Por exemplo, abaixo de um certo limite mínimo (0,1mm), o olho humano não identifica a ocorrência de dois objetos distintos, eventualmente visualizando-os como um único objeto. Limite de resolução – menor distância que deve existir entre dois pontos para que eles apareçam individualizados 28 Retina Lente dos olhos Lentes da ocular Imagem formada pela objetiva (real, maior e invertida) Lentes da objetiva Objeto sobre a lâmina Lentes do condensador Fonte de luz
  29. 29. Prática no 4 Organelas e macromoléculas podem ser separadas por centrifugação 1. Conceitos abordados O estudo bioquímico dos componentes celulares requer a separação e o isolamento cuidadoso das várias organelas e macromoléculas celulares. Só a partir de organelas ou de seus vários componentes moleculares purificados é possível estudar como esses componentes interagem entre si para promover o funcionamento de uma organela. Desta forma, as metodologias empregadas para o fracionamento celular e molecular são fundamentais para o estudo da organização molecular e do funcionamento da célula. As células podem ser rompidas de várias maneiras; por exemplo, por intermédio de choque osmótico, pelo uso de vibrações ultra-sônicas e por métodos mecânicos quando são forçadas a passar por um pequeno orifício ou são homogeneizadas. A aplicação cuidadosa desses procedimentos permite que organelas como núcleo, mitocôndrias, complexo de Golgi e peroxissomos fiquem intactos e também que muitas vesículas derivadas do retículo endoplasmático, chamadas de microssomos, mantenham muito de suas propriedades bioquímicas originais. Como os componentes resultantes do rompimento celular apresentam grandes diferenças de tamanho, eles podem ser separados por centrifugação. Postos em um tubo a girar em alta rotação, as diferentes organelas vão sofrer a ação da força centrífuga. Estruturas maiores como células intactas e núcleos vão sedimentar primeiro no fundo do tubo. Por exemplo, 5 minutos de centrifugação a 1000 rpm (Rotações Por Minuto) é suficiente para separar este material. Centrifugações com maior número de rpm e por maior tempo (por exemplo, 10 minutos a 20.000 rpm) farão sedimentar componentes um pouco menores, como 29
  30. 30. mitocôndrias, lisossomos e peroxissomos. Altas rotações em tempo ainda maiores (80.000 rpm por 3 horas) sedimentam ribossomos e grandes macromoléculas. Embora não seja possível, por intermédio do uso de uma centrífuga com pequena capacidade rpm, realizar as separações necessárias para o isolamento eficiente das diversas organelas, as atividades apresentadas a segui possibilitam que a ação da centrifugação, no isolamento de alguns componentes celulares, seja vivenciada de modo concreto e discutida com base nos resultados observados. Material necessário  Folhas de Tradescantia purpurea*  Gral e pistilo (pode ser pires e colher)  Tubos de centrífuga  Pipetas de Pasteur  Centrífuga  Detergente de louça (líquido ou gel)  Água acidulada (2 a 3 gotas de vinagre – ácido acético – em mais ou menos 100 mL de água) Procedimentos 1. Coloque 3 mL de água acidulada em um gral (ou em um pires); 2. Esmague nessa solução 2 a 3 folhas de Tradescantia com um pistilo (ou uma colher); 3. Transfira com uma pipeta de Pasteur a parte líquida do homogeneizado para um tubo de centrífuga e centrifugue rapidamente (15 seg.) para retirar fibras de celulose e outros resíduos maiores; 4. Transfira o sobrenadante para um tubo novo. Observe que o líquido tem cor marrom. Centrifugue por 5 minutos. 30
  31. 31. Pode se ver claramente, após a centrifugação, que o sobrenadante é um líquido roxo, pela presença do pigmento hidrossolúvel antocianina. No fundo do tubo fica um precipitado verde, pela presença de cloroplastos, que são organelas grandes e por isso vão para o fundo do tubo. 5. Transfira o sobrenadante para um novo tubo. 6. Com uma pipeta Pasteur, ressuspenda o precipitado (cloroplastos) em água acidulada. 7. Acrescente uma gota de detergente no tubo contendo a “solução verde” e agite o tubo por mais ou menos um minuto. 8. Centrifugue por 5 minutos os tubos com o sobrenadante (“solução roxa”) e com o precipitado (“solução verde”). 9. Observe e descreva o que aconteceu com o material contido nos tubos. Questões para discussão 1. Que método é utilizado para romper as células, nesta prática? ____________________________________________________________ 2. Por que foi usada água acidulada? ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ 3. O que será encontrado no sobrenadante após a primeira centrifugação? E no precipitado? ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ 4. Qual a função do detergente? __________________________________________________________ __________________________________________________________ 5. Pesquise a respeito da classificação taxonômica de T. purpurea. 31
  32. 32. Prática no 5 Comparando células procarióticas e eucarióticas 1. Conceitos abordados Os seres vivos podem ser classificados em dois grandes grupos: os procariontes e os eucariontes, conforme a organização da célula que os compõe. O objetivo desta prática é o de comparar células procarióticas e eucarióticas, estabelecendo semelhanças e diferenças. Ao microscópio óptico, o que mais chama a atenção é a grande diferença de tamanho entre as células eucarióticas e procarióticas típicas. É claro que se pode encontrar células procarióticas, como algumas cianofíceas, cujo tamanho está próximo ou mesmo é maior que algumas células eucarióticas. Entretanto, a regra é que os procariontes geralmente têm células muito menores que os eucariontes. Outra diferença bem marcante é a presença do núcleo nos eucariontes e sua ausência nos procariontes. Internamente, não só a presença do núcleo difere nos dois tipos de células, mas também a intensa compartimentalização das diversas funções celulares em organelas envoltas por membranas – o sistema de endomembranas – característico das células eucariontes. Infelizmente, o sistema de endomembranas é de difícil visualização ao microscópio óptico, sendo mais bem observado ao microscópio eletrônico. Isto restringe o elenco de atividades práticas possíveis com o uso de microscópios comuns, e a observação da característica mais notável para diferenciar os dois tipos de organização celular fica, geralmente, limitada à observação de presença/ausência de núcleo (como exceção a esta generalização pode-se citar a visualização de vacúolos contráteis e digestivos em ciliados – e em preparações de lâminas permanentes com colorações especiais para visualizar retículo endoplasmático, complexo de Golgi ou mitocôndrias). 32
  33. 33. Uma forma bem didática de evidenciar as diferenças em relação às dimensões das células é colocar lado a lado células bacterianas e células da mucosa da bochecha. 2. Material necessário  Lâminas e lamínulas  Palitos  Placa de Petri com colônias de bactérias  Alça de platina  Lamparina  Álcool 70%  Corante azul de metileno 0,5%  Papel-filtro  Frasco com capacidade de 250 mL  Microscópio 3. Procedimentos 1. Com uma alça de platina (ou um palito de dente ou de fósforo), encoste levemente em uma colônia de bactérias; 2. Esfregue a alça na lâmina até espalhar bem a amostra coletada; 3. Fixe as bactérias pelo calor, passando a lâmina na chama de uma lamparina, com as bactérias voltadas para cima (cuide para a lâmina não aquecer demais); 4. Com um palito de fósforo, raspe a parte interna da bochecha e, depois, esfregue o palito sobre a região da lâmina em que previamente foram colocadas as bactérias; 5. Mergulhe a lâmina em álcool 70% para fixar as células; 6. Coloque uma gota de corante (azul de metileno 0,5%) sobre o material e aguarde 1 minuto; 7. Remova o corante, passando na lâmina um pequeno fluxo de água, sob a torneira; 8. Cubra com a lamínula, seque a lâmina e observe ao microscópio. 33
  34. 34. Questões para discussão 1) Por que fixamos as bactérias pelo calor e as células eucarióticas com álcool 70%? ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ 2) Qual a função do corante azul de metileno? ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ 3) Quais as principais diferenças observáveis entre as células das bactérias e as da bochecha? ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ 4) Quais as principais diferenças internas que não puderam ser observadas ao MO? 34
  35. 35. Prática no 6 Isolando o DNA* na cozinha (* na verdade ácidos nucléicos = DNA + RNA) Material necessário  Uma cebola grande  Um ralador de queijo e um prato  Sal de cozinha  Detergente para louça (em gel é melhor do que o líquido)  Água quente (de 65 a 80o C)  Filtro de café e suporte para filtro  Gelo  Álcool gelado  Dois frascos de vidro (com capacidade de ± 200 mL)  Um bastão (pode ser de vidro ou mesmo um arame)  Recipiente plástico (caixa ou bacia com capacidade de 1L) Procedimento 1. Rale a cebola e coloque-a em um dos frascos. 2. Adicione à cebola ralada 100 mL de uma solução feita com 80mL de água quente, 20 mL de detergente e uma colher (de sopa) de sal. Misture esta solução com a cebola ralada. 3. Espere 10 minutos e então coloque o frasco com a cebola em um banho de gelo (recipiente plástico com um pouco de água e vária pedras de gelo). À medida que a solução onde está a cebola esfria é possível observar que o líquido parece estar “talhando”. 4. Quando a solução com a cebola ralada estiver fria, filtre. O líquido filtrado é aparado em um frasco limpo. 5. Incline o vidro com o líquido filtrado (em ângulo de 30o e 40o ) e derrame vagarosamente, pela parede, o álcool gelado. Observe que o álcool não se mistura 35
  36. 36. prontamente com a solução filtrada, formando duas fases (na superior fica o álcool). Entre as duas fases é possível observar a formação de um precipitado com aspecto de “fiapos” esbranquiçados, que são os ácidos nucléicos. 6. Com a ajuda do bastão, principalmente se existir um gancho na ponta, é possível enrolar os ácidos nucléicos que estão precipitando. 7. Uma vez enrolados no bastão, os ácidos nucléicos devem secar por alguns minutos ao ar (deixar evaporar o álcool); depois, o material deve ser transferido da extremidade do bastão para um tubo com 0,5 mL de água. 36
  37. 37. Prática no 7 Estudando a passagem de solutos e solventes pela membrana plasmática 1. Conceitos abordados As células de qualquer organismo estão cobertas pela membrana celular. A constituição dessa membrana promove a passagem controlada de substâncias e o conseqüente equilíbrio dinâmico no interior do organismo. A água e outros íons pequenos podem passar sem gasto de energia (transporte passivo) pelas membranas biológicas. Uma das formas de transporte passivo é a osmose, que vem a ser a passagem do solvente de uma solução menos concentrada para a solução mais concentrada, através de uma membrana semipermeável. A observação ao microscópio do fenômeno osmótico, atuando diretamente nas hemácias e em células vegetais, permite ao professor promover uma boa discussão com os alunos sobre a permeabilidade e a organização da membrana celular. 2. Material necessário  Lâminas e lamínulas  Agulha hipodérmica descartável  Lâmina de barbear  Conta-gotas  Água destilada  Soro fisiológico (NaCl 0,9%)  Solução hipertônica (solução saturada de NaCl e/ou açúcar; o mais eficiente é fazer uma solução saturada de sal e açúcar)  Papel-filtro  Luvas descartáveis 37
  38. 38.  Microscópio óptico (MO)  Desinfetante com cloro (alvejante)  Algodão 3. Procedimento 1 Coloque uma gota de soro fisiológico em duas lâminas limpas. 1. Faça um pequeno furo na ponta do dedo com uma agulha descartável estéril e coloque uma gota de sangue sobre cada lâmina (todas as agulhas devem ser imediatamente dispensadas em um frasco com uma solução de 20% de desinfetante à base de cloro) 2. Cubra com lamínula e observe ao MO. Descreva e desenhe as hemáceas. 3. Em uma das lâminas, com um conta-gotas coloque uma gota de uma solução hipertônica em um dos lados da lamínula e encoste um papel-filtro do outro lado para substituir o soro da lâmina. Dessa forma, o papel-filtro do outro lado puxará um pouco do sangue da lâmina e, no outro lado, um pouco da solução hipertônica entrará em contato com as células sanguíneas. 4. Observe ao MO principalmente a região da Lâmina onde as hemácias entraram mais em contato com a solução hipertônica. 5. Na outra lâmina, repita o mesmo procedimento anterior, só que em vez de solução hipertônica use água destilada. Observe a região da lâmina onde as hemácias entraram mais em contato com a solução hipotônica. 6. Terminada a observação, as lâminas devem ser mergulhadas em uma solução de desinfetante à base de cloro (20%) ou álcool 96GL, para depois serem limpas e reaproveitadas. Passar um algodão com álcool na mesa do microscópio e demais partes manuseadas do aparelho. 38
  39. 39. Prática no 8 Observando osmose nas células vegetais Material necessário  Lâminas e lamínulas  Solução de azul de metileno 0,5%  Cebola  Lâmina de barbear  Conta-gotas  Água destilada  Solução hipertônica (Solução saturada de NaCl e/ou açúcar, o mais eficiente é fazer uma solução saturada de sal e açúcar)  Papel-filtro Procedimento 1. Retire a epiderme de uma escama de cebola e coloque sobre uma Lâmina com uma gota de azul de metileno, cubra com a lamínula e observe ao MO. 2. Desenhe as células de epiderme de cebola, indicando a parede celular, o núcleo e o nucléolo. 3. Coloque em um dos lados da lamínula uma gota de uma solução saturada de NaCl e/ou sacarose. Com um papel-filtro, absorva a solução que está entre a lâmina e a lamínula de forma tal que a solução hipertônica entre em contato com a epiderme de cebola. Algumas vezes é mais eficiente retirar a lamínula, e com o papel de filtro retirar a solução que está em volta da epiderme e substituí-la por solução hipertônica. 4. Descreva e desenhe o que aconteceu. Identifique os plasmodesmos. 39
  40. 40. 2. Observação de folhas de Elodea canadensis a) Coloque em uma lâmina, uma folha nova de Elodea canadensis. b) Coloque uma gota de água sobre a lâmina. c) Cubra com a lamínula. d) Examine ao microscópio. e) Discuta o que Você observou. Como se chama o fenômeno? Que conclusões Você pode tirar ? Questões para fixação 1. O que é osmose? Quando ocorre? 2. Por que ocorre hemólise (rompimento das células) quando as hemácias são colocadas em água destilada? 3. Por que não ocorre hemólise com as células da cebola? 4. O que acontece quando as células são colocadas em solução hipertônica? Por quê? 5. O que é plasmólise? 6. O que são plasmodesmos? 40
  41. 41. Prática no 9 Cloroplastos e mitocôndrias Nesta aula Você fará observações, ao microscópio ótico, da morfologia dos cloroplastos de diferentes tipos de plantas. Em seguida Você fará a interpretação de uma micrografia mostrando o corte longitudinal de um cloroplasto. 1. Presença e morfologia dos cloroplastos em epiderme de folhas de samambaia e lírio. 1.1. Método a) Retire com uma gilete (ou pinça, ou unha) uma película fina da face inferior da folha da samambaia e do lírio. b) Coloque o material sobre uma gota de água na lâmina. c) Cubra com lamínula. d) Focalize o material com a objetiva de menor aumento e em seguida utilize a objetiva de 40X. 1.2. Observações: a) Morfologia - Faça um esquema do estômato e das células da epiderme de cada material. Indique a presença dos cloroplastos nestas células. b) Você observou diferenças quanto à presença de cloroplastos nesses dois tipos de plantas que pertencem a grupos taxonômicos diferentes ? Que tipo de diferenças ? _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ 2. Observe a micrografia eletrônica mostrando um corte longitudinal de cloroplastos. Faça um desenho esquemático dessa figura, indicando os seus componentes, bem como o material utilizado (espécie e órgão) para a preparação. 41
  42. 42. Indique no seu esquema os locais onde ocorrem a fotofosforilação e o ciclo de Calvin. Prática no 10 Tema - Citoesqueleto a) Examine a lamina de espermatozóide humano. Questões para Discussão - Relacione centríolos, flagelos e cílios. - Comentar as estruturas visualizadas nos espermatozóides. DISCUSSÃO: CONCLUSÕES: 42
  43. 43. Prática no 11 Mitose 1. Conceitos abordados O crescimento e o desenvolvimento dos organismos vivos dependem do crescimento e da divisão de suas células. Nos organismos unicelulares a divisão celular resulta numa verdadeira reprodução, originando novos indivíduos. Ao contrário, nos organismos pluricelulares, que provêm de um zigoto, repetidas divisões desta célula inicial levam ao desenvolvimento e crescimento do indivíduo. A gênese de novas células constitui um fenômeno cíclico denominado ciclo celular. A maior parte do ciclo celular é compreendida pela intérfase, período entre o final de uma divisão e o começo de outra. Uma série de eventos permite, para fins de estudo, identificar e caracterizar uma seqüência de quatro fases no processo mitótico, apesar de não existirem limites precisos entre elas. Estas fases são conhecidas como prófase, metáfase, anáfase e telófase. A mitose garante ao longo do processo proliferativo celular, a manutenção da identidade das células, por meio da transferência da bagagem gênica de uma célula às suas descendentes. 2. Procedimentos: Nesta aula Você fará a identificação de fases da mitose em lâminas permanentes contendo cortes longitudinais e transversais de raízes. Em seguida Você vai preparar lâminas temporárias de pontas de raiz, pelo método de esmagamento e coloração pelo carmim. 1. Lâminas permanentes de raízes de cebola (Allium cepa). Com a objetiva de 10X focalize a região meristemática . 43
  44. 44. b) Com a objetiva de 40X identifique as fases da mitose. Desenhe-as. Descreva as características principais de cada fase. 44 INTÉRFASE PRÓFASE METÁFASE _______________________________________________________ _______________________________________________________ _______________________________________________________ _______________________________________________________ _____________________________________________ _______________________________________________________ _______________________________________________________ _______________________________________________________ _______________________________________________________ ____________________________________________ _______________________________________________________ _______________________________________________________ _______________________________________________________ _______________________________________________________ ____________________________________________
  45. 45. Lâminas temporárias de células de ponta de raiz de cebola. 45 ANÁFASE TELÓFASE _______________________________________________________ _______________________________________________________ _______________________________________________________ _______________________________________________________ ____________________________________________ _______________________________________________________ _______________________________________________________ _______________________________________________________ _______________________________________________________ ____________________________________________

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