Wang et al 2003

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Nitric Oxide Differentially Modulates ON and OFF Responses of Retinal Ganglion Cells

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Wang et al 2003

  1. 1. Fevereiro - 2011 Monica Gomes Lima Doutoranda em Neurociências [email_address]
  2. 2. <ul><li>NO é a molécula sinalizadora mais difundida encontrada na retina : </li></ul><ul><ul><li>Influência fisiológica - mais claramente pelo mecanismo de sinalização onde NO ativa a guanilato ciclase solúvel (GCs) para promover a síntese de GMPc. </li></ul></ul><ul><li>Estimulação da retina pela luz estimula liberação de NO (Neal et al ., 1998); </li></ul><ul><ul><li>Fotorreceptores: (Savchenko et al ., 1997) </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>canais iônicos controlados por voltagem no bastonete; </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>canais ligados a nucleotídeos cíclicos em cones e bastonetes. </li></ul></ul></ul><ul><ul><li>Bipolares: (Mills & Massey, 995) </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>modula níveis de GMPc; </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>reduz o acoplamento entre amácrinas AII e bipolares dos cones. </li></ul></ul></ul>INTRODUÇÃO
  3. 3. <ul><li>Ganglionares: </li></ul><ul><ul><li>Doador de NO: modula a condutância dos canais de GMPc (Ahmad et al ., 1994; Kawa & Sterling 2002); </li></ul></ul><ul><ul><li>NO: pode modula a atividade retiniana (Goldstein et al. , 1996; Maynard et al. , 1995); </li></ul></ul><ul><ul><li>Como NO afeta a resposta de células ganglionares individualmente? </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>E se houver adaptação ao escuro? </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Existe preferência por alguma classe de ganglionar? </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>A resposta à luz é mediada por alguma das vias ligadas ao bastonete? </li></ul></ul></ul>INTRODUÇÃO
  4. 4. <ul><li>Ganglionares: </li></ul><ul><ul><li>on, off e on-off. </li></ul></ul>INTRODUÇÃO
  5. 5. <ul><li>Eletrofisiologia: </li></ul><ul><ul><li>Preparação da retina de furão: </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>Patch-clamp: </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>P35-P55; </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Enucleação dos olhos : oxigenados a 37ºC – 12min; </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Dissecação da retina: mantida em EMEM (95% de O 2 – 5% CO 2 ); </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Separação de parte da retina </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><ul><li>Registros eram feitos por 30-120min; </li></ul></ul></ul></ul><ul><ul><ul><ul><li>Eletrodo era preenchido (mM): 140 KCl, 10 HEPES, 0,5 EGTA, 0,5% lucifer yellow. </li></ul></ul></ul></ul><ul><ul><li>Estimulo luminoso: </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>LEDs controlados por computador: 463, 569 e 651 nm </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><ul><li>Ativação dos fotorreceptores. </li></ul></ul></ul></ul>MATERIAIS E MÉTODOS
  6. 6. <ul><li>Eletrofisiologia: </li></ul><ul><ul><li>Aplicação da droga: </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>L-Arginina: 1 - 5 mM; </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>D-Arginina: 1 - 5 mM; </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>SNAP: 1 mM; </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Estricnina: 50 µM. </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><ul><li>Dissolvidos em EMEM – administrados por gravidade. </li></ul></ul></ul></ul><ul><li>Análise Morfológica: </li></ul><ul><ul><li>Células eram identificadas após registro (73 células). </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>Nikon Eclipse E600 ou Confocal Bio-Rad MRC-1024ES; </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><ul><li>Diferenciar classes de células ganglionares. </li></ul></ul></ul></ul>MATERIAIS E MÉTODOS
  7. 7. <ul><li>Efeitos do NO na resposta provocada pela luz: </li></ul><ul><ul><li>Registro de 55 células: antes, durante e depois; </li></ul></ul><ul><ul><li>47 de 55 foram afetadas por l-arginina; </li></ul></ul><ul><ul><li>Resposta on : 29 de 37 </li></ul></ul>RESULTADOS Trasiente Sustentada
  8. 8. <ul><li>Magnitude do efeito: </li></ul>RESULTADOS
  9. 9. RESULTADOS OFF ON-OFF
  10. 10. <ul><li>Efeito das concentrações de L-arginina: </li></ul>RESULTADOS Resposta on <ul><ul><li>Diferenças nas inibições das respostas on e off . </li></ul></ul>
  11. 11. <ul><ul><li>4 on : ↓ resposta (19,2-53,4%); </li></ul></ul><ul><ul><li>e 3 off : 2 bloqueadas e 1 reduzida (38,5%). </li></ul></ul>RESULTADOS <ul><ul><li>SNAP tem efeito semelhante ao da L-arginina. </li></ul></ul><ul><li>Efeito do SNAP: </li></ul><ul><ul><li>4 </li></ul></ul>ON OFF
  12. 12. <ul><li>NO em Diferentes Classes Morfológicas: </li></ul><ul><ul><li>Alfa: 75% (6 em 8); </li></ul></ul><ul><ul><li>Beta: 88,5% (23 em 26); </li></ul></ul><ul><ul><li>Gama: 75% (9 em 12). </li></ul></ul>RESULTADOS
  13. 13. <ul><li>Influência de L-arginina ou SNAP no Potencial de Repouso: </li></ul><ul><ul><li>Pot. Repouso: -57,4±4,6 mV; </li></ul></ul><ul><ul><li>Após aplicação da droga: 61 de 73 céls. </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>12 de 73: hiperpolarizaram (2-5 mV); </li></ul></ul></ul><ul><li>Efeitos do NO: </li></ul><ul><ul><li>Podem influenciar respostas visuais – excitabilidade da membrana – efeitos do NO nas respostas provocadas pelas correntes; </li></ul></ul>RESULTADOS
  14. 14. <ul><li>Efeitos do NO nas respostas provocadas pelas correntes: </li></ul><ul><ul><li>30 céls. ganglionares: 10 passos de 10-180 pA </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>19 on : 14 de 19 - ↓ respostas L-arginina (18,4-58,5%) </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>5 off : todas afetadas – 4 bloqueadas e 1↓ 36,7%. </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>6 on-off : on reduzida em 5, off bloqueadas em 4. </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Mas não há uma relação clara entre os efeitos do NO nas repostas provocadas pela luz e nas repostas provocadas pela corrente: </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><ul><li>Sub-grupo com excitabilidade de membrana sensível ao NO. </li></ul></ul></ul></ul>RESULTADOS
  15. 15. <ul><li>Avaliação da adaptação ao escuro (resposta off ): </li></ul><ul><ul><li>Mediada por duas vias </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>Bastonete > bipolar de bastonete > A II > bipolar do cone off > ganglionares off ( APB-sensível ) </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><ul><li>Sinapses glicinérgicas; </li></ul></ul></ul></ul><ul><ul><ul><ul><li>APB: bloqueia - Hiperpolarização da bipolar ligada ao bastonete – não ocorre liberação de glutamato; </li></ul></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Bastonete > bipolar de cone off > ganglionares off ( APB-resistente ) </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><ul><li>Bastonete – cone (gap junctions) – bipolar do cone. </li></ul></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Podem influenciar na modulação pré-sináptica da resposta off de céls. Ganglionares. </li></ul></ul></ul>RESULTADOS
  16. 16. <ul><li>Qual das vias está envolvida no bloqueio das respostas off ? </li></ul><ul><ul><li>Avaliação da resposta pré-sináptica: </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>SNAP : doador de NO; </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Estricnina : bloqueia receptor glicinérgico; </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>APB : bloqueia receptor glutamatérgico. </li></ul></ul></ul>RESULTADOS
  17. 17. RESULTADOS 7 em 11 4 em 11
  18. 18. <ul><li>NO: </li></ul><ul><ul><li>Modula as três classes de ganglionares (alfa, beta e gama); </li></ul></ul><ul><ul><li>“ Amortece” resposta visuais à estímulos em flashes; </li></ul></ul><ul><ul><li>Via off é mais sensível; </li></ul></ul><ul><li>Evidência direta: influencia na resposta das céls. ganglionares, individualmente; </li></ul><ul><li>Afeta a transferência da informação retina-níveis superiores do sistema visual; </li></ul><ul><li>Não atribuído à toxicidade: respostas on e off são diferentes; </li></ul>DISCUSSÃO
  19. 19. <ul><li>Possíveis sítios de ação para a modulação do NO nas respostas visuais: </li></ul><ul><ul><li>Doadores de NO ↑GMPc em céls da retina: </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>Múltiplos sítios de ação podem contribuir para efeitos do NO; </li></ul></ul></ul><ul><ul><li>Pequena proporção de neurônios: NO afeta propriedades intrínsecas da membrana - Descargas provocadas por corrente; </li></ul></ul><ul><ul><li>Pouco provável que respostas on e off diferentes sejam refletidas pela ação dos fotorreceptores </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>Primeira influência do NO – céls. ganglionares (pré-sináptico); </li></ul></ul></ul>DISCUSSÃO
  20. 20. <ul><li>APB-sensível x APB-resistente: A redução da resposta off </li></ul><ul><ul><li>APB-sensível (Müller et al ., 1988): hiperpolarização de bipolar de bastonete </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>Estricnina: inibe sinapses glicinérgicas (sinapses com ganglionares off). </li></ul></ul></ul><ul><ul><li>APB-resistente ( Hack et al. 1999; Soucy et al. 1998): </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>4 em 11: atividade da via APB-resistente – funcional na adaptação ao escuro (mesópicas e escotópicas); </li></ul></ul></ul><ul><ul><li>NO inibe liberação de glicina: </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>Sinapses glicinérgicas: mecanismos pelo qual bloqueia as respostas das células ganglionares off . </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>+ outros sítios de ação </li></ul></ul></ul>DISCUSSÃO
  21. 21. <ul><li>Redução da resposta on : </li></ul><ul><ul><li>Não tentaram estabelecer os sítios de ação do NO nas respostas das ganglionares on ; </li></ul></ul><ul><ul><li>Literatura: </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>NO reduz o acoplamento: </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><ul><li>de gap junctions na retina (DeVries & Schwartz 1989; Miyachi et al ., 1990); </li></ul></ul></ul></ul><ul><ul><ul><ul><li>de AII com bipolar de cone on (Mills & Massey, 1995); </li></ul></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>NO: Canais ligados a GMPc em bipolares on ( Nawy & Jahr,1990, 1991; Shiells & Falk, 1990) </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><ul><li>Aumento da resposta a luz em bipolares on !!! </li></ul></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Não há uma regra – diminuição das respostas à luz nas céls. ganglionares on . </li></ul></ul></ul>DISCUSSÃO
  22. 22. <ul><li>O NO possui um poderoso efeito na retina, principalmente às relacionadas com a respostas off à estímulos luminosos </li></ul><ul><ul><li>86% das respostas off sofreram alteração – maior parte foi bloqueada; </li></ul></ul><ul><li>Complementar: </li></ul><ul><ul><li>NGL: bloqueio da NOS reduz as respostas visuais de todas céls X e Y (Cudeiro et al ., 1994) – L-arginina não possui efeito na resposta visual; </li></ul></ul><ul><ul><li>Córtex: manipulações no sistema NO produz reduções/aumentos na reposta visual (Cudeiro et al ., 1997). </li></ul></ul>CONCLUSÃO
  23. 23. Slideshare: [email_address]

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