Hoffpauir et al, 2006

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Nitric oxide transiently converts synaptic inhibition to excitation in retinal amacrine cells.

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Hoffpauir et al, 2006

  1. 1. MSc. Monica Gomes Lima<br />Doutoranda em Neurociências e Biologia Celular<br />monicasafira@gmail.com<br />monicalima@ufpa.br <br />Agosto- 2011<br />
  2. 2. Amácrinas:<br />Retina interna: conecções com bipolares, ganglionares e outras amácrinas – influenciam diretamente sobre o sinal de saída da retina;<br />Funcionamento e regulação de células amácrinas – crítico para o entendimento do processamento do sinal pela retina.<br />
  3. 3. Introdução<br />NO é a molécula sinalizadora mais difundida encontrada na retina: <br />Imunomarcação para NOS-1: fortemente marcada em células amácrinas (Ding & Weinberg, 2007);<br />Influência fisiológica: NO ativa a guanilato ciclase solúvel (GCs) para promover a síntese de GMPc.<br />
  4. 4. Introdução<br />NO e a retina interna:<br />Reduz o acoplamento, via junções gap, entre AII e bipolares dos cones e dos bastonetes (Mills & Massey; 1995);<br />NO diminui a função do receptor GABAA em cultura de amácrinas (Wexler et al., 1998) – NO diminui a função dos receptores GABAA, pois PKG diminui as correntes de GABA;<br />Função do NO na retina: ???<br />Essa inibição é dependente da concentração de NO? Influencia no potencial de reversão do GABA (EGABA)? <br />
  5. 5. MATERIAIS E MÉTODOS<br />Cultura de Células:<br />Cultura de Retina<br />6-14 dias (EE 14 – PE 1)<br />Madura após 6 dias de plaqueadas:<br />Canais controlados por ligante e por voltagem + sinapses GABAergicas com outras amácrinas.<br />Embrião de galinha<br />8 dias<br />Dissociação: 0,1% tripsina<br />Tratadas com 0,1mg poly-L-ornithine/ml<br />Cultivadas em DEMEM + 5% soro bovino fetal, <br /> penicilina, <br /> estreptomicina e <br /> 2mM de glutamina<br />Alimentadas: 2-3 dias – Neurobasal® Medium<br /> (B-27, penicilina, <br /> estreptomicina e glutamina)<br />
  6. 6. MATERIAIS E MÉTODOS<br />Cultura de Células:<br />Embrião de rato<br />18 dias<br />Cultura de hipocampo<br />Dissociação: 0,1% tripsina<br />Tratadas com 0,1mg poly-L-ornithine/ml<br />Cultivadas em DEMEM + 5% soro bovino fetal, <br /> penicilina, <br /> estreptomicina e <br /> 2mM de glutamina<br />Alimentadas: 2-3 dias – Neurobasal® Medium<br /> (B-27, penicilina, <br /> estreptomicina e glutamina)<br />4-7 dias<br />(EE 22– EE 25)<br />
  7. 7. MATERIAIS E MÉTODOS<br />Eletrophysiology:<br />Amplificador Axopatch 1-D;<br />Na pipeta de vidro havia 3 M KCl – contato com a cultura;<br />Resistência da pipeta:<br />Rompimento: 3-5Ω - SUCÇÃO;<br />Perfuração: 5-10Ω – anfotericina B ou gramicidina (formam pequenas perfurações na membrana);<br />Rompimento x Perfuração - efeitos na mudança de EGABA: P = 0.999;<br />Os dados do ‘Voltage ramp’ eram subtraídos da corrente de vazamento.<br />
  8. 8. MATERIAIS E MÉTODOS<br />Soluções:<br />Aplicações de GABA: 10-20 ms (controlado por computador);<br />Diferenças nas soluções internas e externas às células:<br />Ruptura: <br />Interna: Cs+ + creatina fosfocinase + sal de dipotássio de ATP + sal de disódio de ATP + fosfocreatina + sal de disódio de GTP;<br />Externa: TTX (300 nM – bloqueia canais de Na+) e LaCl3 (25-50 µM – bloqueia canais de Ca2+) – voltage clamp.<br />Perfuração: anfotericina B ou gramicidina à solução interna.<br />SNAP: doador de NO;<br />NOC-12: doador de NO potente;<br />NOC-18: doador de NO – lentamente;<br />CARBOXY-PTIO: sal que elimina NO da reação;<br />ODQem 10 mM de DMSO: inibidor da sGC e compete com NO pelos mesmos sítios de ligação;<br />Furosemida e bumetanidaem 300 mM de DMSO;<br />
  9. 9. MATERIAIS E MÉTODOS<br />‘NO-bubbled’: quantificar NO<br />Soluções com SNAP: <br />15 min em solução com argônio > filtrado em soda lime (Hidróxido de sódio, potássio e cálcio e água) > protegida da luz<br />ISO-NO meter (NOMK2 system) com eletrodo ISO-NOP (World Precision Instrument, Sarasota, FL);<br />Solução com 250 µM SNAP = ~ 100 nM de NO;<br />Injeções 10-50 µl promovia mudanças de 15-35 mV – duravam de 1-3s com a maior parte do No chegando nos primeiros 500 ms.<br />Soluções de NO expostas ao ar: ‘NO-bubbled’ exposta ao ar por 10-30 min;<br />Soluções livre de NO eram usadas como controle.<br />
  10. 10. RESULTADOS E DISCUSSÃO<br />3 efeitos do NO nas correntes ativadas por GABA:<br />1º) Moderadas concentrações de doadores de NO promovem moderados aumentos nas correntes ativadas por GABA;<br />Aumenta a função do receptor GABAA – maior inibição<br />Não é capaz de reverter EGABA<br />Ruptura da membrana: canais de Na+ (solução externa) e K+ bloqueados (TEA e Cs+)<br />
  11. 11. RESULTADOS E DISCUSSÃO<br />3 efeitos do NO nas correntes ativadas por GABA:<br />2º) Em altas concentrações de NO (centenas de nM ou µM) produz uma mudança temporária (1-3 s) no EGABA;<br />Efeito sinérgico NO + GABA<br />NO +O2= N2O4<br />(tetróxido de dinitrogênio)<br />N2O4 + água = ácido nítrico<br />Ruptura da membrana: K+ bloqueados (TEA e Cs+)<br />
  12. 12. RESULTADOS E DISCUSSÃO<br />3 efeitos do NO nas correntes ativadas por GABA:<br />3º) Altas concentrações de NO alteram a função dos receptores GABAA: <br /> de inibição para excitação.<br />Corrente dependente de NO e independente de GABA – em altas concentrações de NO<br />mudança = 24.8 ± 4.2 mV<br />
  13. 13. RESULTADOS E DISCUSSÃO<br />3 efeitos do NO nas correntes ativadas por GABA:<br />3º) Altas concentrações de NO alteram a função dos receptores GABAA.<br />Aumento de EGABA é seguido pelo aumento na amplitude da corrente.<br />
  14. 14. RESULTADOS E DISCUSSÃO<br />3 efeitos do NO nas correntes ativadas por GABA:<br />3º) Altas concentrações de NO alteram a função dos receptores GABAA: <br />de inibição para excitação.<br />GCs não tem atividade relacionada com a mudança EGABA induzida por NO.<br />
  15. 15. RESULTADOS E DISCUSSÃO<br />NO induz mudanças no EGABA devido à elevação do Cl- citosólico<br />Por que o NO induz mudança na EGABA?<br />Há mudança na seletividade à ions pelos receptores GABAA?<br />Ânions internos: Cl- e acetato<br />Troca acetato por metanosulfonato.<br />
  16. 16. RESULTADOS E DISCUSSÃO<br />NO induz mudanças no EGABA devido à elevação do Cl- citosólico<br />2) Há o mesmo efeito na administração de GABA e Glicina?<br />Inibitórios;<br />Ligados à Cl-<br />NO aumenta a função do receptor de glicina<br />NO promove uma despolarização do Vm<br />
  17. 17. RESULTADOS E DISCUSSÃO<br />A mudança promovida por NO é capaz de ser transmitida por sinapses<br />Sinapses de células amácrinas GABAérgicas são normalmente inibitórias<br />Para fora<br />Para dentro - excitatória<br />Produz tanto a corrente como a despolarização<br />Despolarização<br />
  18. 18. RESULTADOS E DISCUSSÃO<br />NKCC não media o aumento no Cl- citosólico<br />Qual o mecanismo que sustenta o aumento de Cl- citosólico (ECl-)? Qual o papel do NKCC e KCC2 no efeito induzido por NO?<br />Co-transportadores de Cl-: NKCC (1Na+, 1K+, 2Cl-) e KCC2 (1K+ e 1Cl-) > ↑NKCC ↓KCC2<br />Perfuração: inibidores do co-transporte bumetanida (NKCC) e furosemida (KCC2)<br />ECl- mais negativo<br />
  19. 19. RESULTADOS E DISCUSSÃO<br />NKCC não media o aumento no Cl- citosólico<br />Participação de outros íons que possam ser co-transpostados por NKCC e KCC2 e participem da mudança do ECl-<br />Reversão rápida do controle para 0 K+<br />A mudança ocorre na mesma magnitude – íons não influenciam na mudança.<br />
  20. 20. RESULTADOS E DISCUSSÃO<br />NKCC não media o aumento no Cl- citosólico<br />Participação de outros íons que possam ser co-transpostados por NKCC e KCC2 e participem da mudança do ECl-<br />Os outros íons não participam da mudança no ECl-<br />
  21. 21. RESULTADOS E DISCUSSÃO<br />Mudanças no ECl- são independentes do Cl- extracelular<br />Endossomos: altas concentrações Cl- > matém alta a amplitude da corrente para dentro<br />Esse Cl- armazenado é o responsável por mudanças nos ECl-?<br /> reduzir concentrações de Cl- externo – igualar às concentrações internas<br />ECl- = 0 mV<br />NO induz a redistribuição de Cl- na ausência de gradiente eletroquímico<br />Correntes de GABA dependem do Cl- externo, mas de NO não.<br />
  22. 22. RESULTADOS E DISCUSSÃO<br />Mudanças no ECl- são independentes do Cl- extracelular<br />Em 0 Cl-<br />A mudança no ECl- é resultado da ação do NO<br />
  23. 23. RESULTADOS E DISCUSSÃO<br />NO promove a liberação de ECl- de uma fonte interna<br />A força de que direciona Cl- diminui<br />Igualou concentrações de Cl- internas às externas<br />
  24. 24. RESULTADOS E DISCUSSÃO<br />A mudança do ECl- ocorre por um mecanismo exclusivo das células amácrinas?<br />Células do hipocampo de rato<br />0 Cl- externo<br />0 Cl- externo durante aplicação de NO<br />Corrente para dentro dependente de NO.<br />
  25. 25. RESULTADOS E DISCUSSÃO<br />Papel do NO na retina<br />Outras Amácrinas<br />Bipolares<br />GABAérgica ou Glicinérgica<br />Altas concentrações<br />Consistente com Wang et al. (2003) – diminuição da resposta de células ganglionares à luz se dá por por alterações no sinal de entrada (possivelmente vindos das células amácrinas.<br />
  26. 26. http://www.slideshare.net/monica_lima/hoffpauir-et-al-2006<br />monicasafira@gmail.com<br />monicalima@ufpa.br<br />

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