Projeto Carne In Vitro, TIO III - Trabalho Interdisciplinar Orientado, Unesp, set/2014

1. Carne in vitro
Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia
Trabalho Interdisciplinar Orientado III (TIO-III)
Unesp-Araraquara | Setembro-2014

2. Nas apresentações anteriores...
(TIO-I e II)

3. Relevância de Demanda

4. Relevância Ambiental

5. Relevância Ambiental
(http://calmariatempestade.wordpress.com/2012/06/22/carne-de-laboratorio/)

6. Relevância Social

7. Etapas de Produção - Simplificado

9. Etapas de Produção - Diferenciação II

10. Tecido Muscular - Tipos

11. Miogênese

13. Tipos Celulares
• Células Tronco Embrionárias:
– Vantagens:
• Em teoria, tem potencial ilimitado de proliferação; (esse potencial poderia ser limitado
por mutações genéticas a longo prazo)
– Desvantagens:
• Processo de diferenciação muito longo e complexo;
• Células Satélites:
– Vantagens:
• Tem maior tendência à proliferação;
– Desvantagens:
• Adicionam uma fase de diferenciação a mais no processo;
• São escassas no tecido muscular;
• Mioblastos:
– Vantagens:
• Já são diferenciadas;
• São abundantes;
– Desvantagens:
• Necessitam de engenharia genética para formarem colônias imortalizadas;
• Proliferam-se mais lentamente;

14. Mecanismos de Regulação Gênica em
Eucariotos
http://genmol.blogspot.com.br/2011/09/genetica-molecular-sinopse-do-controle.html

15. Diferenciação do Tecido Muscular
In Vitro
• Necessidade de Estímulos
Químicos:
– Proteínas reguladoras;
– Fatores de crescimento;
– Nutrientes e oxigênio;
• Necessidade de Estímulos Físicos:
– Ancoramento das células;
– Alinhamento correto para a fusão
dos Mioblastos;
– Contração das células para a
formação dos Sarcômeros;
Meio de Cultura
Telas de Fixação

16. Meio de Cultura
• Deve conter:
– Nutrientes;
– Hormônios e proteínas de regulação gênica;
– Fator de crescimento;
– Carregadores de oxigênio;
• Desafio:
– Custo viável;

17. Fator de Crescimento
• Substâncias que controlam o ciclo celular (transição
da fase G0 para G1);
• Soro fetal bovino => Implicações éticas inviabilizam o
uso em escala
• Meios comerciais livres de soro (Ultroger G) => Caro
• Meios alternativos (extrato de cogumelo) =>
Necessita de mais pesquisas

18. Transportadores de Oxigênio
• Atuariam no lugar do sangue para manter
concentrações adequadas no meio;
• Opções:
– Versões modificadas de hemoglobina (produzidas a
partir de plantas e micro-organismos geneticamente
alterados);
– Versões químicas inertes (produzidas artificialmente);

19. Suporte de Fixação
• Promove a ancoragem da célula;
• Deve possuir uma textura adequada para
promover o alinhamento dos mioblastos;
• Poderia ser:
– Comestível:
• Dispensa etapa de remoção do tecido;
• Pode incorporar qualidades ao produto;
• Biopolímeros: colágeno, alginato, quitosana etc
– Não comestível:
• Etapa adicional de remoção das células
(biodegradação);

20. Mecanismos de Contração
• Necessários para a diferenciação celular;
• Poderiam ser:
– Mecânicos;
– Químicos (um material que contraísse com variações no
PH e Temperatura);
– Elétricos (choques no tecido);
• Estudos sugerem que estímulos elétricos são a melhor
opção, não sendo difíceis de reproduzir em escala
industrial;

21. Espessamento do Tecido – Sistema
Vascular Artificial
• Células começam a morrer por falta de nutrientes
quando o tecido atinge de 2 a 3 mm de
espessura;
• Para superar esse problema, é necessária a
criação de um sistema vascular artificial (a partir
de colágeno);
• Esse sistema foi possível por meio de processos
de microfabricação, difíceis de reproduzir em
escala industrial;

22. No TIO III...

23. Objetivos
• Geral: Estabelecer técnicas que possam contribuir com a
viabilidade de produção de Carne In Vitro em escala
laboratorial e comercial.
• Específicos:
1) Estudar o efeito de diferentes composições de meios de
cultura na diferenciação e proliferação dos mioblastos, de modo a
contribuir com o desenvolvimento de um meio economicamente
viável para produção em escala;
2) Estabelecer protocolos básicos no cultivo de células animais,
tais como composição e preparação do meio de cultura, avaliação
e contagem de células, análise e separação de subprodutos
metabólicos, etc;

24. Metodologia

25. 1º - Isolamento das CS
• Biópsia do tecido muscular;
• Banho enzimático de colagenase tipo II,
tripsina e DNAse, diluídas em meio de cultura
DMEM pré-aquecido a 37 °C;
• CS encubadas em meio de cultura DMEM, a
37°C e 5% de CO;

26. 2º - Caracterização das Células
Satélites e Mioblastos
• Marcadores proteicos:
– 14 proteínas características expressas na CS:
• MyoD, Myf-5, MNF, c-Met, M-cadherin, Pax7, Miogenina,
PCNA, Ki-67, Sox-8, CD-34, c-sky, p-27kip,
V-rsc
– Cada proteína está caracterizada de modo a permitir,
além de identificar as CS, reconhecer processos
metabólicos específicos de cada fase do ciclo celular
• Exemplo:
p-27kip - Há uma relação inversa entre a capacidade
proliferativa da CS e a abundancia da proteína pk27kip,
podendo estar envolvida no crescimento e na hipertrofia
muscular.

27. 2º - Caracterização das Células
Satélites e Mioblastos
• A sequencia de aminoácidos, tamanho da cadeia, peso molecular e outras
informações sobre cada proteína pode ser obtida no site da “RCSB Protein
Data Bank” (http://www.rcsb.org/)

28. 2º - Caracterização das Células
Satélites e Mioblastos
• Para identificar os marcadores proteicos na
cultura celular => Eletroforese em Gel de
Poliacrilamida (SDS-PAGE)

29. 2º - Caracterização das Células
Satélites e Mioblastos
• Para garantir que a banda é realmente da proteína de
interesse => Western blotting seguido por sondagem com
anti-corpos marcados.

30. 3° - Proliferação da Cultura Primária
• Encubação a 37°C;
• Alta concentração de fatores de crescimento;
• Controle de pH:
– O controle é feito por indicador no meio de cultura, de
coloração vermelha em pH neutro e laranja ~ amarelo em pH
ácido;
• Controle da pressão osmótica:
– Atmosfera de CO2 e umidade
– Diminui o stress das células, diminuindo a evaporação do meio
de cultura
• Troca parcial periódica do meio de cultura:
– Diminuir a concentração de metabólitos (ácido lácteo e
amônia);
– Reposição de nutrientes;

31. Determinação da Concentração de
Glicose
• Método de Bergmeyer e Bernt (1974):
I) D-glicose + H2O + O2 -> Ácido D-glucónico + H2O2
II) H2O2 + o-dianisidina reduzida -> 2H2O + o-dianisidina oxidada (castanho)
III) o-dianisidina oxidada (castanho) + H2SO4 + -> o-dianisidina oxidada (rosa)
– A primeira reação é catalisada pela glucose-oxidase (GOD) e a
segunda por peroxidase (POD).
– O o-dianisidina atua como corante, e é reduzido por peróxido de
hidrogénio a um produto que tem uma cor-de-rosa na presença
de ácido sulfúrico (reação 3) e é medido colorimetricamente a
540 nm.

32. YSI Industrial Analyzer
• Análise automatizada de várias alíquotas em
simultâneo;
• Permite quantificação de glicose, ácido lácteo,
amido, glicina etc;
• Baseado em métodos amperimétricos

33. Contagem das células
• Hemocitômetro ou contador de partículas eletrônico;
• Fases de crescimento da cultura:

34. 4° - Proliferação em escala
• Biorreator adequado para cultura de células animais:
– Controle automatizado dos parâmetros;
– Sistema de aeração que não cause o cisalhamento das células;
• Microcarreadores para células dependentes de
ancoragem:
– Microesferas de colágeno;
• Fator limitante do tamanho do biorreator:
– Baixa capacidade de diluição de O2 no meio de cultura;

35. Cisalhamento em Biorreatores com
Aeração Direta

36. 5° - Diferenciação do Tecido Muscular
• As células são semeadas nos suportes;
• Dois grupos de ensaios:
– Suportes de Colágeno;
– Suportes de Alginato;
• Os suportes vão para um biorreator
especialmente concebido para este fim;
• A concentração dos fatores de crescimento é
diminuída no meio, o que desencadeia o
processo de diferenciação;

37. Biorreator para a Diferenciação

38. Biorreator de Fibra Oca Adaptado
• Objetivo: maximizar a produção contornando as limitações de oxigenação
e fornecimento de nutrientes, que limitam o desenvolvimento máximo do
tecido à espessura de 2~3 mm.

39. Biorreator de Fibra Oca Adaptado
• Dois meios de cultura:
– Extracapilar: moléculas grandes;
– Intracapilar: moléculas pequenas e alta
concentração de O2; fluxo mais intenso;
• Os capilares seriam confeccionados com o
biomaterial comestível do suporte;
– Ensaios para avaliar a capacidade dessa confecção
(plasticidade, elasticidade, permeabilidade,
afinidade com as células etc)

40. Perspectivas do TIO
• Conhecer melhor cada etapa do processo de
produção da carne in vitro, e os conceitos práticos e
teóricos relacionados;
• Contribuir de alguma forma para o desenvolvimento
de novas tecnologias;
O trabalho que será desenvolvido nos próximos 5
semestres em TIO é de natureza teórica, mas sempre
visado uma aplicabilidade prática.

41. Referências Bibliográficas
• BHAT et all, “Prospects for In Vitro Cultured Meat – A Future Harvest”, Principles of Tissue Engineering (cap. 79), 4ª ed, 2014.
• POST et all, “Principles of Tissue Engenering for Food”, Principles of Tissue Engineering (cap. 78), 4ª ed, 2014.
• BUTLER, Michael. Animal Cell Culture and Technology, 2ª ed, 2004;
• FOSCHINI et all. “Células Satélites Musculares”, Arq Bras Oftalmol. 2004; 67(4):681-7;
• SANTIAGO et all, “Performance of a vortex flow bioreactor for cultivation of CHO-K1 cells on microcarriers”, Process Biochemistry vol.
46, Jan/2011
• DRURY et all. “Mooney Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications Biomaterials”, 24 (2003), pp. 4337–
4351;
• ALBERTS et all. “Biologia Molecular da Célula”, 5ª edição, 2008;
• DATAR et all. “Possibilities for an in vitro meat production system”, IFSET – Innovative Food Science and Emerging Tecnologies, n° 11,
2010;
• POST et all. “Cultured meat from stem cells: Challenges and prospects” , Meat Science, n° 92, 2012;
• TAVARES, Adriana Alexandre dos Santos. “Análise dos Efeitos Terapêuticos dos Electrões de Auger em Culturas de Células”, Tese de
Mestrado em Engenharia Biomédica, Universidade do Porto, Julho de 2008;
• “Inside the Meat Lab”, Revista Scientific American, n° 108, Junho de 2011;

42. Grupo
• Caio Ricardo
• Camile Pedrosa
• Euclides Formica
• Larissa Gomes
• Lucas Nakamura
• Lucas Zamian
• Lucas Henares
• Murilo Oliveira
Unesp Araraquara
Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia
3° Semestre - 2014