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  1. 1. MÓDULO III PCR
  2. 2. Reacção em Cadeia da Polimerase: fotocopiadora molecular Laboratório Virtual de Biotecnologia Introdução O que é a técnica de PCR? O desenvolvimento da Reacção em Cadeia da Polimerase (Polymerase A PCR explora de uma forma espantosa a função natural de um Chain Reaction – PCR), em meados grupo dos anos oitenta, pode considerar-se polimerases. como uma revolução dentro de outra. encontram-se presentes em todos os Esta técnica veio possibilitar novas seres vivos e têm como função copiar estratégias de análise de genes no o âmbito da tecnologia enzimas denominadas Estas material enzimas genético (além de de DNA corrigirem anos ocorrer durante o processo de cópia). recombinante, iniciada nos setenta. técnica permite Esta de a os erros que podem Uma reacção de PCR necessita análise de quantidades ínfimas de essencialmente material genético o que possibilita um sequência de DNA que se pretende melhoramento das técnicas utilizadas amplificar, de um par de sequências no diagnóstico genético, investigação nucleotídicas iniciadoras forense, sistemática, etc. normalmente são De acordo com presença da (que denominadas Hughes, primers), de nucleótidos (A, T, G e C) Director do National Center for Human e de uma polimerase. Os primers são Genome Research at the National pequenas Institutes of Health, a técnica de PCR cadeia “é a tecnologia mais importante dos laboratório últimos empresas anos”. A Mark da revista Science sequências simples, (ou de DNA desenhadas em encomendadas de de a Biotecnologia refere ainda que, por ser muito mais especializadas), simples complementares às extremidades 3’ todas e as menos dispendiosa técnicas que anteriormente do segmento que de DNA são relevante. utilizadas na duplicação de DNA, esta Assim, durante a reacção de PCR, os técnica democratizou a investigação primers irão flanquear a sequência genética, colocando-a ao alcance de que todos os biólogos. modo, queremos é necessário informação sobre DNA, sobre ou amplificar. a obter Deste alguma sequência as de sequências flanqueantes, para levar a cabo uma 2
  3. 3. reacção de misturados amostra PCR. em de Os primers excesso DNA com ciclo demora apenas alguns minutos a e, por isso, todo o processo é muito a enzima Adiciona-se polimerase. e são ainda magnésio (cofactor da polimerase) e os nucleótidos. rápido (Fig.1). Desnaturação da amostra para separar as cadeias de DNA (95 ºC, 5 min.) A reacção de PCR consiste numa série de ciclos, cada um dos quais envolvendo três passos efectuados a Emparelhamento dos primers (55 ºC, 30 s) diferentes temperaturas: A desnaturação (Passo 1) consiste na incubação do DNA a uma temperatura de 95 ºC para separar as cadeias simples. Segue-se o emparelhamento dos primers (Passo 2) que flanqueiam Desnaturação (95 ºC, 30 s) o DNA, diminuindo gradualmente a Síntese de DNA (72 ºC, 2 min.) Figura 1 – Um ciclo de PCR. temperatura para cerca de 55 ºC. Esta temperatura varia dependendo da composição do primer e da sua complementaridade com o DNA alvo. Durante este passo, as duas cadeias complementares permanecem do DNA desnaturadas alvo porque estão em concentração baixa e não se encontram para emparelhar. Como estão presentes em concentração muito alta, os primers emparelham com as regiões flanqueantes do DNA alvo. Finalmente, para completar o ciclo, é feita a síntese de DNA pela DNA polimerase a uma temperatura de 72 ºC (Passo 3). Esta enzima faz a extensão dos primers, utilizando como molde a cadeia a que cada primer está emparelhado. O ciclo de desnaturação (95 ºC), emparelhamento (55 ºC) e síntese (72 ºC) é repetido várias vezes. Cada O resultado final é a amplificação das sequências de DNA delimitadas pelos dois primers utilizados na reacção. Na prática obtém-se uma quantidade enorme de um DNA alvo partindo de uma mistura complexa em que esta molécula pode estar presente como cópia única. Esta quantidade é suficiente para que o DNA possa ser directamente visualizado num gel de agarose. As temperaturas elevadas que se utilizam durante cada ciclo de PCR requeriam o uso de uma polimerase estável, ou seja, de uma enzima que não desnaturasse cada vez que fosse exposta a temperaturas altas. No final da década de 80 foi isolada a primeira enzima bactéria bactéria termoestável Thermus vive a partir aquaticus. junto a da Esta fontes hidrotermais (cuja temperatura ronda 3
  4. 4. os 80 ºC) designada e a Taq sua polimerase, DNA polimerase, O aparecimento polimerase e da dos Taq DNA termocicladores mantém-se activa, mesmo quando permitiu a proliferação desta técnica exposta a de tal modo que, actualmente, está temperaturas de 95 ºC, fazendo com ao alcance de virtualmente todos os que seja ideal para ser utilizada na cientistas e estudantes. repetidamente PCR. Quando esta técnica começou a Aplicações da técnica de PCR ser utilizada, os ciclos de temperatura A PCR tem tido uma diversidade eram obtidos através da transferência de aplicações crescente. É utilizada manual dos tubos da reacção entre actualmente diferentes em para ser directamente sequenciado ou temperaturas clonado; para mapeamento de genes; recipientes banhos-maria específicas. a Esta postos actividade era para para amplificar diagnóstico de DNA: doenças entediante para os cientistas e podia hereditárias e doenças infecciosas; provocar o aparecimento de erros, para uma vez que era difícil manter os outros, para estudos moleculares de banhos evolução. Uma das capacidades mais à temperatura ideal e estudos forenses; e, entre controlar bem os tempos de cada surpreendentes desta banho. Este problema foi ultrapassado capacidade amplificar quando organismo extintos, alguns há vários se inventaram termocicladores os automatizados. de técnica é DNA a de milhões de anos. Nestes, os tempos e as temperaturas de cada fase do ciclo são introduzidos no computador PCR: a fotocopiadora molecular e são executadas A técnica de PCR está a fazer com sem ser necessário o material genético o que a invenção transferir os tubos da reacção de da prensa fez com o material escrito: recipiente em recipiente (Fig.2). está a tornar acessíveis inúmeras precisamente cópias de material genético de um modo rápido e barato. Em princípio esta técnica material pode genético reproduzir de o qualquer organismo em quantidades ilimitadas. Deste modo, podemos analisar de um modo simples o material genético de qualquer organismo, incluindo o Homem. Facilmente vemos as inúmeras vantagens que esta técnica Figura 2 – Termociclador automatizado. 4
  5. 5. trouxe à Biotecnologia, tendo quase imediatamente ocupado um lugar de destaque em inúmeras áreas da investigação. Questões de análise No Laboratório Biotecnologia Virtual encontrará de uma animação que ilustra e explica cada etapa da técnica de PCR (canal 1 da LVBtv). 1 – Descreva o que ocorre durante um ciclo da técnica de PCR. 2 – Enumere as principais vantagens desta técnica relativamente a outras utilizadas anteriormente para amplificar moléculas de DNA. 3 – Faça necessário uma para lista do realizar material uma experiência utilizando esta técnica. 4 – Indique as principais áreas onde se pode aplicar esta técnica. 5
  6. 6. ALA METODOLÓGICA Todos os pares de primers Teoria: amplificam do mesmo modo a Conclusões: mesma molécula de DNA? Princípios: Registos/Observações: Pista 1 Conceitos: Desenho experimental: Material biológico DNA alfa-C5 DNA beta-A7 Par de primers 1 Par de primers 2 Pista 1 Pista 2 Pista 2 6 ALA CONCEPTUAL
  7. 7. ALA METODOLÓGICA Um par de primers Teoria: apresenta sempre o mesmo Conclusões: resultado, Princípios: independentemente da molécula de DNA a amplificar? Registos/Observações: Pista 1 Conceitos: Desenho experimental: Material biológico DNA alfa-C5 DNA beta-A7 Par de primers 1 Par de primers 2 Pista 1 Pista 2 Pista 2 7 ALA CONCEPTUAL
  8. 8. ALA CONCEPTUAL ALA METODOLÓGICA Teoria: Princípios: amplificado está dependente do número Conclusões: de ciclos de temperatura que se efectua? Registos/Observações: Pista 1 Conceitos: Desenho experimental: Material biológico DNA alfa-C5 DNA beta-A7 Par de primers 1 Par de primers 2 Pista 1 Pista 2 Pista 2 8 A quantidade de DNA

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