Dna forense

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Dna forense

  1. 1. Histórico - A Descoberta do DNA Experiência Clássica com ervilhas • Unidade de transferência da hereditariedade ou Gene • Recessividade e Dominância • Heterozigose e Homozigose • Genótipo e Fenótipo • Gregor Mendel – 1864
  2. 2. Histórico - A Descoberta do DNA 1868 – Friedrich Mischer Purificou uma nova substância do núcleo de células que chamou de Nucleína. Trabalhou com Glóbulos Brancos isolados do pus de feridas contidas em curativos de hospital.
  3. 3. Histórico - A Descoberta do DNA 1909 – Theodor Lavene: O DNA como uma composição de 4 Nucleotídeos. A T G C Caracterizou quimicamente os diferentes tipos de Ácidos Nucléicos. Mostrou que o DNA era formado por unidades monoméricas chamada de nucleotídeo em um esqueleto baseado em fosfato e açucar.
  4. 4. Histórico - A Descoberta do DNA 1928 – Frederick Griffith e o ensaio com bactérias patogênicas. Cepas R (Rough) e S (Smooth) de Streptococcus pneumoniae Agente transformante
  5. 5. Histórico - A Descoberta do DNA 1943 – Avery, McCarty e McCleod. O Agente transformador é o DNA.
  6. 6. Histórico - A Descoberta do DNA 1950 – Erwin Chargaff e a proporção de Bases Nitrogenadas. A=T; C=G Após inúmeros estudos da composição do DNA em diversos tecidos e varias espécies, concluiu que a ocorrência das quatro bases no DNA obedece às relações A = T e C = G. Esta regra é conhecida como “Regra de Chargaff” Org. Tecido Guanina Citosina Timina 26,0 E. Coli Adenina 23,9 24,9 25,2 Rato Osso 28,6 28,4 21,4 21,5 Homem Figado 30,3 30,3 19,5 19,9 Homem Semen 30,7 31,2 19,3 18,8
  7. 7. Histórico - A Descoberta do DNA 1951 – Rosalim Franklin e a Difração de raios X.
  8. 8. Histórico - A Descoberta do DNA 1951 – Rosalim Franklin e a Difração de raios X. Padrão de difração em formato de X é típico de estruturas heicoidais. O fotografia revelou ainda que havia um padrão de repetição na estrutura e em séries regulares. Que o esqueleto Fosfato-açucar estaria voltada para fora e as bases voltadas para o interior da molécula.
  9. 9. Histórico - A Descoberta do DNA 1953 – Watson e Crick com uso de modelos e dedução lógica teorizam a Estrutura do DNA. 1962 – Watson, Crick e Wilkins são premiados com o prêmio Nóbel pela descoberta da estrutura do DNA e sua Importância para a transferência da informação entre os seres vivos.
  10. 10. GANHADORES DO NOBEL EM 1962 Francis Crick (1916 –2004) James Watson (1928 ) Maurice Wlkins (1916-2004) Rosalin Franklin (1920-1958) MLA style: "The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1962". Nobelprize.org. Nobel Media AB 2013. Web. 7 Nov 2013. <http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1962/>
  11. 11. ESTRUTURA E FUNÇÃO DO DNA
  12. 12. A estrutura do DNA Dupla hélice Parte externa formada por um esqueleto de Fosfato-Açucar alternados. Parte interna contendo as bases nitrogenadas. 3 Bilhões de Pares de bases.
  13. 13. DUPLICAÇÃO DO DNA • A estrutura do DNA bem como o pareamento complementar de Bases revelaram o segredo da hereditariedade. • Acontece que o duplo filamento de DNA, durante a divisão celular se separa, e cada uma funciona como um molde para fabricaçao de duas novas moléculas de DNA.
  14. 14. Cromossomos Estrutura condensada do DNA encontrada no núcleo da célula. Cromossomos Autossômicos 22 pares Cromossomos Sexuais 1 par XX Mulher XY Homem
  15. 15. Cromossomos O Conjunto de Cromossomos é resultado da fusão de dois gametas (óvulo com espermatozóide).
  16. 16. GENE 1 GENE 2 LOCUS
  17. 17. GENE 1 GENE 2 GENE 3 GENE 4 GENE 1 GENE 2 GENE 3 GENE 4 GENE 1 GENE 2 GENE 3 GENE 4 GENE 1 GENE 2 GENE 3 GENE 4
  18. 18. DNA FINGERPRINTING E OS POLIMORFISMOS
  19. 19. DNA fingerprinting e os polimorfismos • RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism • Se baseia nas diferenças de sítio de clivagem do DNA por enzimas de restrição. • Foi a primeira técnica utilizada para análise de DNA. • Utilizada no mapeamento do genoma humano e em testes de paternidade. Alec Jeffrey
  20. 20. DNA fingerprinting e os polimorfismos • RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism • Se baseia nas diferenças de sítio de clivagem do DNA por enzimas de restrição. • Foi a primeira técnica utilizada para análise de DNA. • Utilizada no mapeamento do genoma humano e em testes de paternidade. Alec Jeffrey
  21. 21. PROJETO GENOMA HUMANO 1990 - Cria-se o consórcio público do projeto genoma humano, formado por Instituições científicas de 20 países. Conhecer a sequência de pares de bases ao longo da cadeia de DNA. Permitiu avanços na área da medicina CLONAGEM ENGENHERIA GENÉTICA TRANSGENIA
  22. 22. POLIMORFISMOS • Polimorfismos de Sequência- Substituição, Deleção, Adição de Bases • SNPs – Single Nucleotide Polymorphism • ATCT C CCAT – Alelo 1 • ATCT G CCAT – Alelo 2 • Polimorfismos de tamanho • STRs – Short Tandem Repeats ACCT ACCT ACCT – 3 repetições ACCT ACCT ACCT ACCT – 4 repetições
  23. 23. DNA MITOCONDRIAL As Mitocôndrias São organelas encontradas no citoplasma da célula. Atuam fornecedo energia para as reações químicas produzindo ATP. Seu número varia entre 500 até 10000 unidades por célula. Apresentam DNA em forma circular. Capacidade duplicativa. Apresentam genes similares aos encontrados em bactérias.
  24. 24. DNA MITOCONDRIAL Herança Matrilinear Durante a fecundação apenas o núcleo do espermatozóide entra no óvulo. Logo, todos os indivíduos de uma mesma linhagem materna apresentam o mesmo DNAmt. Valiosa ferramenta para identificação de restos mortais. Não é um exame individualizador.
  25. 25. PRIMEIRO CASO CRIMINAL AO USAR O EXAME DE DNA • Dois casos de estupro seguido de homicídio: um Dawn Ashworth e Lynda Mann, ambas de 15 anos de idade. • Um principal suspeito foi interrogado mas liberado por falta de provas. Seu nome era Colin Pitchfork. • Um homem foi preso e confessou um dos assassinatos. • Resolveram realizar o teste de DNA que acabou inocentando o rapaz preso. • Decidiram coletar amostras de toda a população masculina. Cerca de 4500 pessoas foram submetidas a coleta de sangue.
  26. 26. PRIMEIRO CASO CRIMINAL AO USAR O EXAME DE DNA • Pithfork trocou sua amostra de sangue o que o deixou livre de ser pego. • Entretanto uma denuncia anônima dizia ter ouvido em um PUB que Pitchfork teria trocado a amostra. • Foi o suficiente para ser preso e o teste de DNA foi refeito, dando resultado positivo.
  27. 27. POPULARIZAÇÃO DO EXAME DE DNA • As Séries televisivas
  28. 28. POPULARIZAÇÃO DO EXAME DE DNA • Casos de repercussão • O.J. SIMPSON • Acusado de ter assassinado sua ex mulher Nicole Brown e seu amigo Ronald Goldman em 1994. • Mais de 20 milhões de pessoas assistiram o julgamento pela TV. • 45 amostras de sangue no total ligavam O.J. à cena do crime.
  29. 29. POPULARIZAÇÃO DO EXAME DE DNA
  30. 30. POPULARIZAÇÃO DO EXAME DE DNA – CASO O.J. SIMPSON Luvas encontradas na casa de O. J. Simpson continha perfil genético de Nicole. Manchas de sangue encontradas no carro de Simpson continha perfil genético de Nicole. Fibras e cabelos
  31. 31. POPULARIZAÇÃO DO EXAME DE DNA – CASO O.J. SIMPSON Porque houve a absolvissão mesmo com a evidência do DNA forense incriminando O. J. Simpson? O Exame era novidade nos tribunais. Falta de prática na coleta e manuseio do vestígio biológico. Falta de padronização dos exames. Resultados estatísticos muitas vezes difíceis de entender. Simpson após receber o veridicto.
  32. 32. Perícia Criminal em Local do Crime – COLETA E PRESERVAÇÂO DE AMOSTRAS A resolulção de crimes depende da associação dos vestígios materiais encontrados no local de crime.
  33. 33. Materiais biológicos que podem conter DNA Fluídos corporais – • Suor, sangue, • saliva, sêmen, • urina, secreção vaginal. Restos mortais • Dentes e ossos. Fios de cabelos, pelos, unhas.
  34. 34. Vestígios potenciais para busca de DNA Objetos pessoais • óculos, boné, sapato, sandálias, escova, etc. .. Objetos descartados • Guardanapo, Garrafas plásticas, Palito de dente, cigarro, etc... Armas manuseadas • Barra de ferro, porrete, faca, espeto de churrasco, etc...
  35. 35. Métodos gerais de busca – Como encontrar? Vestígios latentes Necessitam de técnicas específicas para torná-las visíveis. Testes preliminares Indicam ou classificam a natureza de um vestígio biológico. Testes confirmatórios Confirmam a natureza de um vestigio.
  36. 36. MÉTODOS DE BUSCA – Luz Forense Se baseia no fenômeno da fluorescência de certas substâncias ao incindir uma luz sobre elas. Alguns materiais refletem um comprimento de onda enquanto absorvem outros.
  37. 37. Fluídos corporais Impressões digitais Pêlos e fibras
  38. 38. MÉTODOS DE DETECÇÃO – LUZ FORENSE Comportamento espectral da absorção do sangue seco. • Espectro de fotoluminescência de semen seco.
  39. 39. MÉTODOS DE BUSCA – Testes preliminares para sangue Vestígio comum em crimes contra a vida e relativamente frequente em crimes contra o patrimônio. A presença de sangue pode ser de muito valor em determinadas ocasiões. A análise do padrão de dispersão de sangue pode fornecer indícios sobre a dinâmica do ocorrido. Tendência em ocultar tal vestígio.
  40. 40. Teste de Fluorescência/Luminescência
  41. 41. Teste de Flourescência/Luminescência Um dos testes mais antigos. Criada em 1928. Na presença de H 2O2 sofre uma reação de oxidação tendo o Fe presente na hemoglobina como catalisador. A sensibilidade chega a PPB (Parte Por Bilhão). Capaz de detectar sangue após 6 anos.
  42. 42. Teste de Flourescência/Luminescência BLUE STAR FORENSIC Apresenta maior intensidade de brilho Maior tempo de duração. Pode-se obter a visualização em condições de penunbra. Não degrada o DNA.
  43. 43. Testes de coloração Teste da Benzidina (Adler Ascarelli) Reação de oxidação da Benzidina em meio ácido, que resulta na formação de um produto intermediário de cor azul.
  44. 44. Testes de coloração Teste da Benzidina (Adler Ascarelli) Passo 1: Adiciona uma solução de benzidina diluída com ácido acetico sobre a mancha. Passo 2: Em seguinda pinga-se uma gota de Peróxido de Hidrogênio.
  45. 45. Testes de coloração Teste da Fenolftaleína (Kastle-Meyer) Oxidação da Fenoftaleína em solução alcalina com mudança de cor para Rosa.
  46. 46. Testes Imunocromatográficos
  47. 47. Fatores que afetam a análise do DNA. • Coletar de maneira correta afim de minimizar a degradação do DNA: • Sangue Líquido: Suabe, Seringa Degradação Calor Umidade Luz Solar Substâncias químicas
  48. 48. Fatores que afetam a análise do DNA. • Coletar de maneira correta afim de minimizar a degradação do DNA: • Sangue Líquido: Suabe, Seringa Degradação Calor Umidade Luz Solar Substâncias químicas
  49. 49. Fatores que afetam a análise do DNA. • Coletar de maneira correta afim de minimizar a degradação do DNA: • Degradação Calor Umidade Luz Solar Substâncias químicas Sangue em objetos removíveis: Acondicionamento em sacos plástico ou de papel.
  50. 50. Fatores que afetam a análise do DNA. • Coletar de maneira correta afim de minimizar a degradação do DNA: • Sangue Seco: Suabe ou raspagem. Degradação Calor Umidade Luz Solar Substâncias químicas
  51. 51. Fatores que afetam a análise do DNA. • Degradação Calor Umidade Luz Solar Substâncias químicas Coletar de maneira correta afim de minimizar a degradação do DNA: • Sêmen em camisinha: Acondicionamento ou suabe.
  52. 52. Os marcadores STRs São extremamente populares em análises de DNA forense devido a sua análise ser baseada em PCR e a funcionarem com pouca quantidade de DNA molde ou mesmo com amostras degradadas. Os métodos de análise de microssatélites são facilmente automatizados, e envolvem detecção por fluorescência, o que permite que o analista colete dados destes marcadores rapidamente. Os STRs são altamente discriminativos entre indivíduos não relacionados e mesmo entre estreitamente aparentados.
  53. 53. Etapas do Exame de DNA AMOSTRAGEM O vestígio é analisado no Contexto do Local do Crime. EXTRAÇÃO As Amostras são submetidas a processos químico e físico que permitem o isolamento do DNA dos demais componentes. QUANTIFICAÇÃO Uma Reação de PCR em tempo real permite estimar a quantidade de DNA presente.
  54. 54. Etapas do Exame de DNA AMPLIFICAÇÃO Regiões específicas do DNA são replicadas milhares de vezes. ELETROFORESE CAPILAR O produto da PCR, fragmentos de DNA, são separados por tamanho e visualizados sob forma de picos (eletroferograma).
  55. 55. Extração do DNA Servem para separar o DNA de outros componentes celulares e outros contaminantes. Extração Orgânica. Extração por chelex. Extração por Papel FTA.
  56. 56. Extração do DNA Extração Diferencial. Utilizado em casos de crimes sexuais em que a amostra contém células masculinas e femininas em uma mistura. Azoospermia. Uso de camisinha.
  57. 57. Amplificação por PCR Permite realizar milhões de cópias de DNA em poucas horas. Primer – Se ligam ao DNA em locais específicos. DNA Polimerase – Adiciona os nt a cadeia pelo pareamento complementar Envolve o aquecimento e resfriamento da amostra.
  58. 58. Amplificação por PCR Permite realizar milhões de cópias de DNA em poucas horas. Primer – Se ligam ao DNA em locais específicos. DNA Polimerase – Adiciona os nt a cadeia pelo pareamento complementar Envolve o aquecimento e resfriamento da amostra.
  59. 59. PCR em Tempo real. Termociclador
  60. 60. Eletroferograma

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