CARINA ALVES Proteção de Penaeus monodon contra a Síndrome da Mancha Branca Vírus por Vacinação Oral.pdf
1. Proteção de Penaeus monodon
contra a Síndrome da Mancha
Branca
Vírus por Vacinação Oral
Discente: Carina Alves Santos
Professor: Kleber
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
curso : Aquacultura
Disciplina:Carcinicultura (ZOO 018)
2.
3. INTRODUÇÃO
O vírus da síndrome da mancha branca (WSSV) ocorre em todo o mundo e causa alta
mortalidade e considerável prejuízo econômico além dos prejuízos à carcinicultura.
Nenhum tratamento adequado contra este vírus está disponível.
O vírus da síndrome da mancha branca (WSSV) pertence a um novo vírus
família, o Nimaviridae,
São elipsóides a baciliformes, partículas envelopadas
com um apêndice distinto em forma de cauda em uma extremidade e pode ser
encontrados em todo o corpo do camarão infectado.
contém um nucleocapsídeo com uma aparência estriada típica
e cinco proteínas principais e pelo menos 13 proteínas secundárias
Causa até 100% de mortalidade em 7 a 10 dias
em fazendas comerciais de camarão
4. A ideia de vacinar o camarão, ou invertebrados em geral, parece ser inviável
por serem assume-se que falta uma resposta imune adaptativa e depende
apenas nas respostas imunes inatas
Para investigar se a proteção contra WSSV poderia ser
induzida em camarão por vacinação, uma vacina de subunidade foi gerada
com duas proteínas estruturais principais do envelope de WSSV,
VP19 e VP28
Uma estratégia de vacinação oral foi adotada porque a injeção
nas vacinações não são praticamente viáveis na carcinicultura.
5. OBJETIVOS
Como foi demonstrado que os camarões que sobrevivem a uma infecção
por WSSV têm maior taxas de sobrevivência após reintrodução
subseqüente, investigamos o potencial da vacinação oral de camarões com
vacinas de subunidade consistindo em proteínas do envelope do virião
WSSV.
Camarões Penaeus monodon foram alimentados com pellets de ração
revestido com bactérias inativadas superexpressando duas proteínas do
envelope WSSV, VP19 e VP28.
O início e a duração da proteção observada foram mais investigadas
desafiando
camarão em diferentes momentos após a vacinação.
6. MATERIAIS E MÉTODOS
Camarões Penaeus monodon saudáveis foram importados como pós-larva da Malásia e
mantido em um sistema de recirculação na instalação De Haar vissen na Universidade de
Wageningen.
Cada remessa foi testada para a presença de WSSV, baculovírus monodon, vírus da cabeça
amarela, vírus da síndrome de Taura,e vírus da necrose hipodérmica e hematopoiética
infecciosa por PCR
Antes de cada experimento, os camarões foram transferidos para um sistema experimental
localizado
no Laboratório de Virologia da Universidade de Wageningen e abastecido em frascos de 180
litros aquários
Cada um equipado com um sistema de filtro individual , aquecedores a 28 (+/-)1°C e aeração
contínua.
Todos os experimentos foram realizadas em água do mar artificial (Instant Ocean, Aquarium
Systems) em um salinidade de aproximadamente 20 ppt.
7. Nos experimentos de vacinação, grupos
de 15 camarões
foram vacinados alimentando pellets de
alimentos revestidos por 7 dias,
conforme indicado na Tabela1.
Para o experimento 1, a vacinação foi
seguida diretamente por uma imersão de
7 horas
desafio em água do mar contendo
WSSV de uma diluição predeterminada
conforme descrito acima.
Para o experimento 2, os quatro grupos
foram subdivididos em três grupos iguais
subgrupos após os 7 dias de vacinação, que
foram posteriormente desafiados em
3, 14 e 21 dias após a vacinação percentual
de sobrevivência, calculado como (1 grupo
de mortalidade/grupo de controle vacinado
mortalidade) 100
Experimentos de vacinação
8. FIGO. 2. Relação
tempo-mortalidade do
experimento de vacinação 1.
Taxas cumulativas de
mortalidade de camarões dos
grupos experimentais
vacinado com VP19 (⏺),
VP28 (🔹), VP19 mais VP28 (
∗), pET mais
pMAL (◼ ), controle positivo
(▲) e controle negativo (Χ )
conforme indicado
na Tabela 1 são plotados
contra o tempo após o desafio.
Linhas marcadas
com um asterisco são
significativamente diferentes do
pET mais pMAL
e grupos de controle positivo.
13. RESULTADOS
Produção e purificação de proteínas
Os dois principais WSSV proteínas de envelope VP19 e VP28 foram
selecionadas para uso como vacinas de subunidade.
Expressões múltiplas foram realizadas em E.coli, com quadros de leitura abertos
completos e parciais e MBPe fusões de tags His6.
A maior expressão de VP28 foi obtido em fusão com a tag His6 quando o N-terminal
domínio hidrofóbico foi omitido.
A expressão para VP19 foi geralmente mais baixo e mais alto em fusão com
MBP. Bandas correrespondendo às proteínas de fusão foram observadas no
esperado
alturas (Fig. 1, pistas 1 e 2)
14. FIGO. 1. Gel SDS-PAGE corado com Coomassie
de E. coli superexpresso
VP19 em pMAL-c2, VP28 em pET28a, pMAL-C2
vazio e vazio
pET28a. Pista M, marcadores de tamanho
(kilodaltons).
Pista 1, MBP-VP19 ex-pressão.
Pista 2, expressão de His6-VP28.
Pista 3, expressão de pMAL-C2.
Pista 4, expressão de pET28a. Os números do
lado esquerdo indicam a posições dos
marcadores, e setas indicam o MBP-VP19 e His6 -
Produtos de superexpressão VP28.
15. Experimentos de vacinação. (i) Experimento 1: VP19 e VP28 vacinação.
Neste experimento, o potencial vacinal de Proteínas do envelope WSSV VP19,
VP28 e uma mistura de ambas
proteínas via administração oral foi testada.
Quatro grupos de 15 camarão foram vacinados conforme indicado na Tabela 1,
diretamente seguido de um desafio de imersão.
A relação de mortalidade deste experimento é mostrada na Fig. 2. A grupo
controle positivo e o grupo vacinado com uma mistura dos vetores pMAL-C2 e
pET28a vazios mostraram uma mortalidade nativa de 67% e 77%,
respectivamente
O grupo vacinados com VP19 também mostraram uma alta mortalidade
cumulativa de 83%, indicando que nenhuma proteção poderia ser obtida com
este proteína.
16. No entanto, a vacinação com VP28 isoladamente ou mistura de VP28 e VP19
resultou em menor mortalidade de 30% e 50% em relação ao grupo vacinado
com o vetores vazios (valores relativos de sobrevivência de 61% e 31%,
respectivamente).
Essa mortalidade foi significativamente menor para o grupo VP28-grupo
vacinado em comparação com o pMAL-C2/pET28a e grupos de controle
positivo. Sobreviventes selecionados aleatoriamente foram verificados quanto à
presença de WSSV, e todos testaram negativo.
17. (ii) Experimento 2: início e duração da vacinação com VP28.
Como o primeiro experimento demonstrou que a vacinação com VP28 resultou em maior
sobrevivência após desafio WSSV, a natureza dessa proteção foi analisada mais adiante.
Camarão foram vacinados com a proteína do envelope VP28 do WSSV e três
grupos de controle foram incluídos, conforme indicado na Tabela 1. Após a vacinação
cinação, os quatro grupos foram subdivididos em três sub- grupos para desafio subsequente em três
pontos de tempo diferentes.
O primeiro desafio foi 3 dias após a interrupção da vacinação, e a relação tempo-mortalidade resultante
é mostrada na Fig. 3a.
O grupo pET apresentou uma mortalidade cumulativa de 85% e o grupo de controle positivo uma
mortalidade de 75%.
significativamente menor mortalidade cumulativa (30%) foi observada no grupo
alimentados com VP28, resultando em sobrevida relativa de 64% e 59% com-
comparados aos grupos pET e controle positivo, respectivamente.
18. Para o segundo desafio, 7 dias após a vacinação, o grupo alimentados com PET e o
grupo de controle positivo atingiram mortalidades de 100% e 93%, respectivamente
(Fig. 3b)
O VP28 grupo de vacinação mostrou uma mortalidade significativamente menor de
23%, resultando em valores relativos de sobrevivência de 77% e 75% em comparação com os
grupos pET e controle positivo, respectivamente.
Vinte e um dias após as vacinações, o terceiro desafio foi realizada. Desta vez, os grupos pet e
controles positivos atingiram mortalidades cumulativas de 80 e 70%, respectivamente (Fig. 3c).
O efeito positivo da alimentação de VP28 foi reduzido e esse grupo atingiu uma mortalidade
cumulativa de 50% (não significativa significativamente diferente), resultando em valores relativos
de sobrevivência de 29% e 38% em comparação com os grupos de pET e controle positivo,
respectivamente.
Os grupos de controle negativo não apresentaram mortalidade.
Sobreviventes selecionados aleatoriamente de todos os grupos foram testados para
WSSV, e todos testaram negativo
19. DISCUSSÃO
O estudo discute a possibilidade de usar proteínas como uma forma de estimular a resposta imune
em camarões, visando a proteção contra o WSSV (Vírus da Síndrome da Mancha Branca).
A vacinação oral foi escolhida como o método prático de entrega da vacina. O desafio com o WSSV foi
realizado por imersão, pois isso permitiu um melhor controle da pressão de desafio. As proteínas
VP28 e VP19, presentes no envelope do WSSV, foram selecionadas para uso nas vacinas de
subunidades.
As proteínas bacterianas foram escolhidas para expressar as proteínas e como veículo de entrega do
antígeno, devido à sua produção estabelecida e acessível. No entanto, nenhuma das vacinas
contendo VP28 proporcionou proteção contra o WSSV, indicando a necessidade de uma abordagem
mais específica.
Quando uma mistura de VP19 e VP28 foi usada, uma menor taxa de sobrevivência foi observada em
comparação com o grupo vacinado apenas com VP28, sugerindo uma possível resposta dependente
da dose
Estudos adicionais são necessários para determinar se a alta proteção observada após a
vacinação com VP28 pode ser prolongada ou aprimorada através de esquemas de
vacinação mais longos ou otimização da quantidade de vacina
20. Estudos adicionais são necessários para determinar se a alta proteção
observada após a vacinação com VP28 pode ser prolongada ou
aprimorada através de esquemas de vacinação mais longos ou otimização
da quantidade de vacina.
Além disso, experimentos com outros vírus de camarões podem fornecer
mais informações sobre os processos envolvidos na resposta imune.
No geral, o estudo indica que a vacinação oral de camarões contra o WSSV
é possível e abre caminho para o desenvolvimento de estratégias práticas
de controle de patógenos em invertebrados, como o WSSV.
