Aplicação da biotecnologia na cultura
              do milho:
 impacto sobre organismos não-alvo


          Fernando Hercos Valicente
Plantas transgênicas
• Resistência a pragas
  – Bacillus thuringiensis

• Tolerância a herbicidas
• Perfil nutritivo melhorado
• Tempo de armazenamento
  aumentado
Bacillus thuringiensis
• Natural do solo, insetos mortos, filoplano,
  água, resíduos de grãos etc
• Bactéria Gram positiva, forma esporos e,
  produz cristal proteíco durante a fase de
  esporulação e ou estacionária
Bacillus thuringiensis
B.t. tolworthi




Cepa 344
Isolamento
• Microscopia de contraste de fase
• Colônias com cristais foram reisoladas
cry   1   Aa1    cry   2    Aa1
      1   Aa2          2    Aa2
      1   Aa3          :     :
      :    :
                       2    Aa11
cry   1   Aa15
                       :     :
      1   Ab1
                       2    Ae1
      :    :
                       :     :
cry   1   Ai1
                 cry   3    Aa1
      1   Ba1
                       :     :
      1   Ba2
                       :     :
      :    :
cry   1   Bg1    cry   9    Aa1
cry   1   Ca2          :     :
          Cb1    cry   27   Aa1
      :    :           :     :
cry   1   La1    cry   70   Aa1
Genes cry
• cry1, cry2, cry9 – Lepidopteros

• cry3, cry7 e cry8 – Coleopteros

• cry5, cry12, cry13 e cry14 – Nematóides

• cry2, cry4A, cry10, cry11, cry17, cry19,
 cry24, cry25, cry27, cry29, cry30, cry32,
 cry39 e cry40 - Dipteros
Bacillus thuringiensis
• Um isolado normalmente sintetiza entre 1 e
  5 toxinas na forma de um ou vários cristais.




                    cristal
Modo de ação
                 Lepidopteros




Especificidade
Plantas GM e organismos não alvo

 • Parasitóides:   • Predadores:
Parasitóides

• Parasitóides: normalmente pertencem às
  ordens Hymenoptera e Diptera

• Hymenoptera: vespas, abelhas, formigas
  etc
• Diptera: moscas e mosquitos
Parasitóides

• Tipos de parasitismos:
  – Conhecer a espécie que se trabalha –
    taxonomia
  – Endo e Ectoparasitóides
  – Endo – desenvolvem-se dentro do corpo da
    lagarta
  – Ecto – na parte externa.
Parasitóides
• É um organismo normalmente menor do que o
  hospedeiro, somente um indivíduo pode matar o
  hospedeiro. Exige somente um hospedeiro para
  completar o seu ciclo de vida. O adulto tem
  vida livre. A maioria dos parasitóides
  pertencem a cinco ordem de insetos, mas a
  grande maioria dentro das ordens Diptera e
  Hymenoptera.
Trissolcus basalis




              Braconidae
Bioensaios
• Observar sempre a qualidade do
  hospedeiro – no caso de alimentar o
  hospedeiro com toxinas Bt

• Usar o inseto taxonomicamente correto

• Se não houver possibilidade, usar um grupo
  taxonomicamente próximo.
Anaphes flavipes

                                 Parasitóides de ovos:
                                Observar se os ovos são
                                      saudáveis.




Spodoptera: ovos estéreis
são esverdeados
Peristenus sp
Predadores
• Organismo de vida livre que durante todo o
  ciclo de vida, mata suas presas, normalmente
  é maior do que a mesma. Necessita de mais do
  que uma presa para completar seu ciclo de
  desenvolvimento.      Mantideos,     aranhas,
  percevejos etc. Os predadores variam em
  relação ao aparelho bucal: mastigador
  (Coleoptera) e picador sugador (Hemiptera).
  Sugam as presas e normalmente injetam
  toxinas.
Predadores
•   Coleoptera
•   Dermaptera
•   Diptera
•   Hemiptera
•   Hymenoptera
•   Mantodea
•   Neuroptera
•   Orthoptera
•   Thysanoptera
Influência do aparelho
  bucal do predador
 Tipo de alimentação
Neuroptera
aparelho bucal mastigador

                            Coleoptera
Bioensaios
• Observar sempre a qualidade da presa
  a ser oferecida ao predador

• O presa não pode estar debilitada

• No caso de toxinas Bt, realizar
  bioensaios para determinar sub doses
  para contaminar, porém não matar os
  hospedeiros.
Coleoptera
Carabidae
Pentatomidade - ninfa




Coleoptera
Staphilinidae
Brasil: projetos em andamento
• UNESP/Jaboticabal: Podisus e
  Trichogramma
• Diamantina/MG: Podisus e formigas
• UFLA/Lavras/MG: Chrisoperla
• Harmonia sp e Hypodamia sp
• UFV/MG: várias espécies

• Teste com DIPEL e Agree
• Toxinas: Cry1Ab, 1Ac, 1Ba, 1Ca, 1Da, 1Ea, 2A e 9A
• Milho Bt- Herculex, MON810 etc
Supputius cincticeps (Heteroptera:
                      Pentatomidae)
Eucalipto
Soja
Algodão

UFV
Podisus distinctus (Heteroptera:
                     Pentatomidae)
Eucalipto
Podisus nigrispinus (Heteroptera:
                     Pentatomidae)
Soja
Algodão
eucalipto
Brontocoris tabidus (Heteroptera:
                     Pentatomidae)
eucalipto
Pragas controladas pelos percevejos
                       predadores




Alabama     argillacea    (Lepidoptera,   Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera,
Noctuidae) praga do algodoeiro            Noctuidae) praga da soja




Thyrinteina   arnobia    (Lepidoptera:      Spodoptera frugiperda (Lepidoptera:
Geometridae) praga do Eucalipto             Noctuidae) praga do milho
Polistes simillimus




               List of preys                 Culture              Autors
Lepidoptera
    Spodoptera frugiperda (J. E. Smith)       Milho         Prezoto et al. 1994
    Spodoptera latifascia Walker, 1856        Milho        Prezoto and Machado
                                                                   1999
    Helicoverpa Zea (Bod., 1850)              Milho        Prezoto and Machado
                                                                   1999
    Diatraea saccharalis                  Cana-de-açúcar    Prezoto et al. 1994
    Elasmopalpus lignosellus              Cana-de-açúcar    Prezoto et al. 1994
    Heliothis virescens                     Macieira        Prezoto et al. 1994
    Anticarsia gemmatalis                     Soja          Prezoto et al. 39
                                                                           1994
    Chlosyne lacinia saundersii              Girassol       Prezoto et al. 1994
Polybia platycephala




List of preys                             Culture              Autors
Lepidoptera
    Spodoptera frugiperda (J. E. Smith)   Milho                Prezoto et al. 2005
    Mocis latipes                         cana-de-açúcar       Prezoto et al. 2005
    Alabama argillacea (Hubner)           Tomate, algodoeiro   Prezoto et al. 2005

                                                                             40
Parasitóides de pupas
 Trichospilus diatraeae (Hymenoptera: Eulophidae)




 Hospedeiros naturais, preferencialmente lepidópteros




  Thyrinteina arnobia   Spodoptera frugiperda   Plutella xylostella   Oxydia vesulia
       Eucalipto              Polifaga             Cruciíferas         Abacateiro
 Palmistichus elaeisis (Hymenoptera: Eulophidae)
                         




   Hospedeiros naturais




Dione juno juno Euselasia eucerus   Hispoleptis sp. Sabulodes sp.
   Maracujá        Eucalipto         Dendezeiro       Eucalipto
Parasitoides de ovos
 Trichogramma sp. (Hymenoptera: Trichogrammatidae), hábito
  polífago, especialmente de lepidópteras




             Trichogramma pretiosum                      Trichogramma galloi
 Hospedeiros naturais (ovos de famílias de Lepidoptera)




 Diatraea saccharalis   Anticarsia gemmatalis   Spodoptera frugiperda   Helicoverpa zea
 Telenomus sp. (Hymenoptera: Scelionidae)




                     Telenomus sp.
 Hospedeiros naturais (mais especificos)




    Anticarsia gemmatalis
                            Parasitando ovos de percevejos da Soja
Processo de liberação comercial
Study of Bt toxins or Bt isolates x Coccinelidaes
Coccinelidae species:
         Harmonia sp
         Hypodamia sp
They feed on artificial diet and need Anagasta eggs to lay fertile
eggs. If it is a Bt toxin, e.g cry1Ab, it will be mixed with artificial
diet, and insects will be allowed to feed for 72h. After this period
insects will be fed on artificial diet + Anagasta eggs.
Comment: You could consider to provide the test diet for a period of
time to every of the ladybird larval stages. Thus you increase
exposure to the test substance. We have done this with Adalia
bipunctata using sucrose solution instead of artificial diet (simply
because there is no diet available for this species) (Alvarez-Alfageme
et al. 2011).
Diet will be weighed and also the amount of the Bt toxin (µg of Bt
toxin/ml).
Comment: I like this idea. It would allow you to really quantify the
amount of diet that was consumed and thus the dose of Cry protein
that was ingested. Make sure that you run a control where diet is
provided without addition of a ladybird. I believe that the diet will
change in weight during the exposure period (it may dry out). You
need to correct for this weight loss.
Treatments when Bt toxin is used:
T1- ¼ f Bt toxin (µg of Bt toxin/ml) + diet and Anagasta eggs after 72h
T2 – ½ Bt toxin (µg of Bt toxin/ml) + diet and Anagasta eggs after 72h
T3- 1 Bt toxin (µg of Bt toxin/ml) + diet and Anagasta eggs after 72h
T4- 2X Bt toxin (µg of Bt toxin/ml) + diet and Anagasta eggs after 72h
T5- diet + and Anagasta eggs after 72h
These treatments will be performed with immature and all the life
history will be recorded (mainly the period in each instar). When they
become adults, all reproductive capacity will be evaluated and couples
will be isolated as follow:
Female fed on Bt + male fed on Bt
Female fed on Bt + male (from Control)
Female (Control) + male fed on Bt
Female (Control) + male (Control)
Comments: You could consider to terminate the experiment when the
adults emerge and use adult dry weight as the final measurement
endpoint. Adult weight is an indicator for fecundity.
Obrigado!

Biossegurança embrapa 2012_fernando

  • 1.
    Aplicação da biotecnologiana cultura do milho: impacto sobre organismos não-alvo Fernando Hercos Valicente
  • 2.
    Plantas transgênicas • Resistênciaa pragas – Bacillus thuringiensis • Tolerância a herbicidas • Perfil nutritivo melhorado • Tempo de armazenamento aumentado
  • 3.
    Bacillus thuringiensis • Naturaldo solo, insetos mortos, filoplano, água, resíduos de grãos etc • Bactéria Gram positiva, forma esporos e, produz cristal proteíco durante a fase de esporulação e ou estacionária
  • 4.
  • 6.
  • 7.
    Isolamento • Microscopia decontraste de fase • Colônias com cristais foram reisoladas
  • 10.
    cry 1 Aa1 cry 2 Aa1 1 Aa2 2 Aa2 1 Aa3 : : : : 2 Aa11 cry 1 Aa15 : : 1 Ab1 2 Ae1 : : : : cry 1 Ai1 cry 3 Aa1 1 Ba1 : : 1 Ba2 : : : : cry 1 Bg1 cry 9 Aa1 cry 1 Ca2 : : Cb1 cry 27 Aa1 : : : : cry 1 La1 cry 70 Aa1
  • 11.
    Genes cry • cry1,cry2, cry9 – Lepidopteros • cry3, cry7 e cry8 – Coleopteros • cry5, cry12, cry13 e cry14 – Nematóides • cry2, cry4A, cry10, cry11, cry17, cry19, cry24, cry25, cry27, cry29, cry30, cry32, cry39 e cry40 - Dipteros
  • 12.
    Bacillus thuringiensis • Umisolado normalmente sintetiza entre 1 e 5 toxinas na forma de um ou vários cristais. cristal
  • 13.
    Modo de ação Lepidopteros Especificidade
  • 14.
    Plantas GM eorganismos não alvo • Parasitóides: • Predadores:
  • 15.
    Parasitóides • Parasitóides: normalmentepertencem às ordens Hymenoptera e Diptera • Hymenoptera: vespas, abelhas, formigas etc • Diptera: moscas e mosquitos
  • 16.
    Parasitóides • Tipos deparasitismos: – Conhecer a espécie que se trabalha – taxonomia – Endo e Ectoparasitóides – Endo – desenvolvem-se dentro do corpo da lagarta – Ecto – na parte externa.
  • 17.
    Parasitóides • É umorganismo normalmente menor do que o hospedeiro, somente um indivíduo pode matar o hospedeiro. Exige somente um hospedeiro para completar o seu ciclo de vida. O adulto tem vida livre. A maioria dos parasitóides pertencem a cinco ordem de insetos, mas a grande maioria dentro das ordens Diptera e Hymenoptera.
  • 18.
  • 19.
    Bioensaios • Observar semprea qualidade do hospedeiro – no caso de alimentar o hospedeiro com toxinas Bt • Usar o inseto taxonomicamente correto • Se não houver possibilidade, usar um grupo taxonomicamente próximo.
  • 20.
    Anaphes flavipes Parasitóides de ovos: Observar se os ovos são saudáveis. Spodoptera: ovos estéreis são esverdeados
  • 21.
  • 23.
    Predadores • Organismo devida livre que durante todo o ciclo de vida, mata suas presas, normalmente é maior do que a mesma. Necessita de mais do que uma presa para completar seu ciclo de desenvolvimento. Mantideos, aranhas, percevejos etc. Os predadores variam em relação ao aparelho bucal: mastigador (Coleoptera) e picador sugador (Hemiptera). Sugam as presas e normalmente injetam toxinas.
  • 24.
    Predadores • Coleoptera • Dermaptera • Diptera • Hemiptera • Hymenoptera • Mantodea • Neuroptera • Orthoptera • Thysanoptera
  • 25.
    Influência do aparelho bucal do predador Tipo de alimentação
  • 26.
  • 28.
    Bioensaios • Observar semprea qualidade da presa a ser oferecida ao predador • O presa não pode estar debilitada • No caso de toxinas Bt, realizar bioensaios para determinar sub doses para contaminar, porém não matar os hospedeiros.
  • 31.
  • 32.
  • 33.
    Brasil: projetos emandamento • UNESP/Jaboticabal: Podisus e Trichogramma • Diamantina/MG: Podisus e formigas • UFLA/Lavras/MG: Chrisoperla • Harmonia sp e Hypodamia sp • UFV/MG: várias espécies • Teste com DIPEL e Agree • Toxinas: Cry1Ab, 1Ac, 1Ba, 1Ca, 1Da, 1Ea, 2A e 9A • Milho Bt- Herculex, MON810 etc
  • 34.
    Supputius cincticeps (Heteroptera: Pentatomidae) Eucalipto Soja Algodão UFV
  • 35.
    Podisus distinctus (Heteroptera: Pentatomidae) Eucalipto
  • 36.
    Podisus nigrispinus (Heteroptera: Pentatomidae) Soja Algodão eucalipto
  • 37.
    Brontocoris tabidus (Heteroptera: Pentatomidae) eucalipto
  • 38.
    Pragas controladas pelospercevejos predadores Alabama argillacea (Lepidoptera, Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera, Noctuidae) praga do algodoeiro Noctuidae) praga da soja Thyrinteina arnobia (Lepidoptera: Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Geometridae) praga do Eucalipto Noctuidae) praga do milho
  • 39.
    Polistes simillimus List of preys Culture Autors Lepidoptera Spodoptera frugiperda (J. E. Smith) Milho Prezoto et al. 1994 Spodoptera latifascia Walker, 1856 Milho Prezoto and Machado 1999 Helicoverpa Zea (Bod., 1850) Milho Prezoto and Machado 1999 Diatraea saccharalis Cana-de-açúcar Prezoto et al. 1994 Elasmopalpus lignosellus Cana-de-açúcar Prezoto et al. 1994 Heliothis virescens Macieira Prezoto et al. 1994 Anticarsia gemmatalis Soja Prezoto et al. 39 1994 Chlosyne lacinia saundersii Girassol Prezoto et al. 1994
  • 40.
    Polybia platycephala List ofpreys Culture Autors Lepidoptera Spodoptera frugiperda (J. E. Smith) Milho Prezoto et al. 2005 Mocis latipes cana-de-açúcar Prezoto et al. 2005 Alabama argillacea (Hubner) Tomate, algodoeiro Prezoto et al. 2005 40
  • 41.
  • 42.
     Trichospilus diatraeae(Hymenoptera: Eulophidae)  Hospedeiros naturais, preferencialmente lepidópteros Thyrinteina arnobia Spodoptera frugiperda Plutella xylostella Oxydia vesulia Eucalipto Polifaga Cruciíferas Abacateiro
  • 43.
     Palmistichus elaeisis(Hymenoptera: Eulophidae)   Hospedeiros naturais Dione juno juno Euselasia eucerus Hispoleptis sp. Sabulodes sp. Maracujá Eucalipto Dendezeiro Eucalipto
  • 44.
  • 45.
     Trichogramma sp.(Hymenoptera: Trichogrammatidae), hábito polífago, especialmente de lepidópteras Trichogramma pretiosum Trichogramma galloi  Hospedeiros naturais (ovos de famílias de Lepidoptera) Diatraea saccharalis Anticarsia gemmatalis Spodoptera frugiperda Helicoverpa zea
  • 46.
     Telenomus sp.(Hymenoptera: Scelionidae) Telenomus sp.  Hospedeiros naturais (mais especificos) Anticarsia gemmatalis Parasitando ovos de percevejos da Soja
  • 47.
  • 57.
    Study of Bttoxins or Bt isolates x Coccinelidaes Coccinelidae species: Harmonia sp Hypodamia sp They feed on artificial diet and need Anagasta eggs to lay fertile eggs. If it is a Bt toxin, e.g cry1Ab, it will be mixed with artificial diet, and insects will be allowed to feed for 72h. After this period insects will be fed on artificial diet + Anagasta eggs. Comment: You could consider to provide the test diet for a period of time to every of the ladybird larval stages. Thus you increase exposure to the test substance. We have done this with Adalia bipunctata using sucrose solution instead of artificial diet (simply because there is no diet available for this species) (Alvarez-Alfageme et al. 2011). Diet will be weighed and also the amount of the Bt toxin (µg of Bt toxin/ml). Comment: I like this idea. It would allow you to really quantify the amount of diet that was consumed and thus the dose of Cry protein that was ingested. Make sure that you run a control where diet is provided without addition of a ladybird. I believe that the diet will change in weight during the exposure period (it may dry out). You need to correct for this weight loss.
  • 58.
    Treatments when Bttoxin is used: T1- ¼ f Bt toxin (µg of Bt toxin/ml) + diet and Anagasta eggs after 72h T2 – ½ Bt toxin (µg of Bt toxin/ml) + diet and Anagasta eggs after 72h T3- 1 Bt toxin (µg of Bt toxin/ml) + diet and Anagasta eggs after 72h T4- 2X Bt toxin (µg of Bt toxin/ml) + diet and Anagasta eggs after 72h T5- diet + and Anagasta eggs after 72h These treatments will be performed with immature and all the life history will be recorded (mainly the period in each instar). When they become adults, all reproductive capacity will be evaluated and couples will be isolated as follow: Female fed on Bt + male fed on Bt Female fed on Bt + male (from Control) Female (Control) + male fed on Bt Female (Control) + male (Control) Comments: You could consider to terminate the experiment when the adults emerge and use adult dry weight as the final measurement endpoint. Adult weight is an indicator for fecundity.
  • 59.