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Carregado porMargarida Fernandes
Artigo biopat-final
Este documento apresenta os resultados de um estudo que avaliou 16 marcadores imuno-histoquímicos em 209 tumores pulmonares primários para ajudar na diferenciação dos tipos histológicos. Os resultados mostraram que a citoqueratina 5 e P63 são marcadores sensíveis para carcinomas de células escamosas, enquanto o fator de transcrição tireoidiano 1 e a napsina A são marcadores para adenocarcinomas. A imuno-histoquímica pode ajudar na classificação dos tumores pulmonares.
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- 1. Docente: Dr. JoséCamacho Discentes: Ana Débora Sá, Ana Filipa Silva, Ana Francisca Correia, Ana Margarida Fernandes, Ana Patrícia Nunes, André Santos, Bárbara Ferreira Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa Curso de Mestrado Integrado em Medicina Módulo IV – Biopatologia 2014/2015 TURMA P1
- 2. INTRODUÇÃO TEÓRICA Carcinoma Primário Metástase Carcinoma small cell Carcinomanon-small cell • Adenocarcinoma • Carcinoma large-cell • Carcinoma de células escamosas • Carcinoma adenoescamoso • Carcinoma sarcomatóide • ... Tipos de Cancro do Pulmão
- 3. Carcinoma small cell •Raro em não-fumadores • Ao microscópio vemos células pequenas preenchidas quase exclusivamente pelo núcleo • • Cresce mais rapidamente e espalha-se para outras partes do corpo mais rapidamente que os carcinomas non-small • Responde a quimioterapia • Distribui-se normalmente como massas peri- Carcinoma small cell. A. As células tumorais estão densamente distribuídas, são pequenas, com pouco citoplasma e ausência de nucléolo. B. A forma fusiforme é uma característica proeminente.
- 4. Carcinoma non-small cell CARCINOMADE CÉLULAS ESCAMOSAS • Mostra queratinização e / ou pontes intercelulares que surgem a partir do epitélio brônquico • É normalmente encontrado próximo do centro do pulmão • Ocorre quase sempre em fumadores (90%) Carcinoma de células escamosas. A. Diferenciação escamosa; pontes intercelulares distintas. B. Diferenciação escamosa refletida por camadas de queratina.
- 5. Carcinoma non-small cell ADENOCARCINOMA •Subtipo de cancro do pulmão mais comum • Desenvolve-se em indivíduos fumadores ou não-fumadores • Possui diversos subtipos, entre eles o carcinoma bronquioalveolar • Distribuição mais periférica Carcinoma bronquioalveolar, subtipo mucinoso. Existe uma proliferação monotona do epitélio mucoso ao longo das paredes alveolares, com uma transição abrupta do tumor para as paredes alveolares normais.
- 6. CARCINOMA LARGE-CELL • Éum carcinoma indiferenciado sem características de carcinoma de células pequenas e sem diferenciação escamosa ou glandular. • Este também apresenta subtipos, entre eles o carcinoma neuroendócrino large-cell • Quase todos os subtipos predominam em fumadores, excepto no carcinoma do tipo linfoepitelioma Células tumorais grandes com citoplasma abundante, núcleo grande, cromatina nuclear vesicular e nucléolo proeminente. Sem diferenciação glandular ou escamosa. Carcinoma non-small cell
- 7. CARCINOMA ADENOESCAMOSO • Mostracomponentes tanto de carcinoma de células escamosas como de adenocarcinoma, com cada um compreendendo pelo menos 10% do tumor. Carcinoma adenoescamoso. O tumor consiste num carcinoma de células escamosas (esquerda) e um adenocarcinoma (direita). Carcinoma non-small cell
- 8. CARCINOMA SARCOMATÓIDE • Grupopouco diferenciado dos carcinomas non-small cell que contêm um componente sarcomatoso. • 5 Subgrupos: ∙ Carcinoma pleomórfico; ∙ Carcinoma de células fusiformes; ∙ Carcinoma de células gigantes; ∙ Carcinosarcoma; ∙ Blastoma pulmonar. Carcinoma non-small cell
- 9. Metástases Pulmonares • Origináriosde tecidos extra pulmonares • Os tumores que mais originam metástases no pulmão são: mama, cólon, estômago, pâncreas, rim, melanoma, próstata, fígado, tiróide, supra- renal, genital masculino, genital feminino • Normalmente encontram-se na periferia e têm bordos discretos Metástase pulmonar de um carcinoma da próstata corado com um antigénio especifico da próstata (PSA). Normalmente, PSY não é expresso em tumores pulmonares primários.
- 10. Immunohistochemistry in the DifferentialDiagnostics of Primary Lung Cancer An Investigation Within the Southern Swedish Lung Cancer Study Hans Brunnström, MD, PhD, Leif Johansson, MD, PhD, Karin Jirström, MD, PhD, Mats Jönsson, PhD, Per Jönsson, MD, PhD, and Maria Planck, MD, PhD KEY WORDS: Adenocarcinoma; CK5; Cytokeratin; Estrogen receptor; Large-cell carcinoma; Napsin A; Neuroendocrine; P63; Squamous cell carcinoma; TTF-1
- 11. Abstract • OBJETIVOS: avaliarse, através da imuhistoquímica (IHQ), conseguimos avaliar diferentes tipos de cancro do pulmão • MÉTODOS: Foram avaliadas 16 diferentes marcadores IHQ em 209 preparações de cancros primários de pulmão cirurgicamente tratados, incluindo 121 adenocarcinomas, 65 carcinomas de células escamosas, 15 carcinomas large-call, 5 carcinomas adenoescamosos, e 1 carcinoma small-cell, usando a técnica tissue microarray.
- 12. • RESULTADOS: • Citoqueratina5 (CK5) e P63 foram ambas positivas em 97% dos carcinomas de células escamosas, com o primeiro sendo positivo em apenas 2 carcinomas de células não-escamosas. • Thyroid transcription factor 1 (TTF1) e napsin A foram ambas positivas em 88% e 87% dos adenocarcinomas, respectivamente, com 94% dos adenocarcinomas sendo positivos com pelo menos 1 marcador. • O receptor de estrogénio foi positivo em 15% dos adenocarcinomas. • CONCLUSÕES: CK5, TTF1 e napsin A são marcadores sensitivos para carcinomas de células escamosas e adenocarcinomas do pulmão Abstract
- 13. INTRODUÇÃO TISSUE MICROARRAY (TMA) •Trata-se de agrupar um grande número de amostras teciduais em um único bloco de parafina, permitindo o estudo de expressão de marcadores moleculares em larga escala. VANTAGENS: • Representa de forma eficiente diferentes áreas dos tumores e distintos níveis de corte • Possibilidade de repetição das experiências • Estudo de um grande número de amostras simultaneamente • Economia de tempo e custo
- 14. MATERIAIS E MÉTODOS SOUTHERNSWEDISH LUNG CANCER STUDY • É um estudo prospectivo em curso com início em 2005 • OBJECTIVO: obter inúmeros materiais de pacientes que permitem análises moleculares de alto rendimento para um melhor diagnóstico, classificação, prognóstico e tratamento do cancro do pulmão
- 15. MATERIAIS E MÉTODOS •Pacientes com suspeita ou histologicamente confirmados de cancro de pulmão primário antes do tratamento cirúrgico • Recolhidas amostras de sangue pré e pós operatório, tecido fresco congelado do tumor e tecido pulmonar normal • Casos excluídos: • Pacientes tratados com terapia neoadjuvante (radiação pré-operatória e/ou quimioterapia) • Lesão benigna ou pré-maligna • Tumor in situ, • Tumor não epitelial • Metástase • A taxa de inscrição foi de cerca de 25% de todos os cancros de pulmão tratados cirurgicamente devido a razões logísticas, terapia neoadjuvante, achado incidental de tumor
- 16. MATERIAIS E MÉTODOS-CASOS • Todos os casos de cancro epitelial não carcinoides primários invasivos do Southern Swedish Lung Cancer Study de 2005 a 2011 foram incluídos. • Utilizados cortes corados com H&E, com ácido periódico de Schiff e/ou a marcação por IHQ para marcadores neuroendócrinos • Casos foram reclassificados quando necessário e os diagnósticos revistos foram confirmados por um segundo patologista
- 17. MATERIAIS E MÉTODOS-TMA CONSTRUCTION • Ressecções pulmonares foram fixados em formol 4% aquoso neutro por 48 horas • Tecido tumoral foi embebido em parafina e descongelado anteriormente excepto em 1 caso no qual todo o tecido do tumor tinha sido congelado instantaneamente • Foram retirados 3 TMA cores de cada tumor; cada core com 1mm de diâmetro • Secções consecutivas de 4 μm de
- 18. MATERIAIS E MÉTODOS-TMA CONSTRUCTION • Células tumorais presentes em todos os 2 ou 3 núcleos • todos os casos: +300 células tumorais viáveis em cada secção e, • na maioria dos casos: +1.000 células • EXCEPÇÕES: • não havia células tumorais em qualquer um dos núcleos de TMA (1 caso) • células tumorais presentes nas secções de apenas um dos três núcleos TMA (1 caso)
- 19. MATERIAIS E MÉTODOS-IHC COLORAÇÃO E AVALIAÇÃO COLORAÇÕES IHC: • Cytokeratin (CK) clone AE1 / AE3 / PCK26 (CKAE1 / 3) • CK clone MNF116 (CKMNF) • CK5, CK7, CK20 • P63 • Estrogenreceptor (ER) • Progesteronereceptor (PGR) • Mammaglobin (MAGLO) • gross cysticdiseasefluid protein-15 (GCDFP-15) • Synaptophysin (SYNAP) • Chromogranin A (CHROMA) • CD56 • Thyroid transcription factor 1 (TTF1), • Napsin A (NAPA), • Caudal-typehomeobox 2 protein (CDX2).
- 20. • Casos commenos de 1% das células tumorais viáveis positivas foram classificadas como negativas • 1% ou mais, mas menos do que 10% de células positivas, como 1+ • 10% ou mais como 2+ MATERIAIS E MÉTODOS- IHC COLORAÇÃO E AVALIAÇÃO
- 21. RESULTADOS 207 casos 88 homens 119mulheres 68,8 ± 8,3 anos 209 tumores caracterizados
- 22. Tipo histológico dos209 tumores: • 121 adenocarcinomas • 65 carcinomas de células escamosas • 15 carcinomas de células grandes • 5 carcinomas adenoescamosos • 2 carcinomas sarcomatóides • 1 carcinoma de células pequenas. RESULTADOS
- 23. RESULTADOSRESULTADOS Coloração H&E ColoraçãoIHC para ER Coloração IHC para TTF1 Coloração IHC para NAPA ADENOCARCINOMA ACINAR
- 24. Coloração IHC para CK7 ColoraçãoIHC para CDX2 Coloração IHC para CK20 RESULTADOS Coloração H&E ADENOCARCINOMA MUCINOSO
- 25. Coloração H&E ColoraçãoIHC para CK7 Coloração IHC para CK5 Coloração IHC para P63 RESULTADOS CARCINOMA ESCAMOSO
- 26. RESULTADOS Coloração H&E Coloração H&E Coloração IHC para CHROMA ColoraçãoIHC para CHROMA CARCINOMA LARGE-CELLS COM COMPONENTE NÃO- NEUROENDÓCRINA CARCINOMA LARGE-CELLS COM COMPONENTE NEUROENDÓCRINA
- 27.
- 28. RESULTADOS- BROAD CYTOKERATINS •Em alguns casos a intensidade da coloração foi menor para CMNF do que para CK AE1/3 em três casos menos de 10% • Todos os tumores foram positivos para CK AE1/3 e CMNF 1 carcinoma espinocelular 2 carcinoma neuroendócrino de células grandes
- 29. ADENOCARCINOMAS Componente glandular dos carcinomas adenoescamosos Positivospara CK7 (10% ou mais das células) 2 ADENOCARCINOMAS Positivos para CK20 Um deles expressa CDX2 (<10% das células) 1 ADENOCARCINOMA MUCINOSO Positivo para CK20 e CDX2 (< 10% das CK7, CK20, e CDX2 RESULTADOS- BROAD CYTOKERATINS
- 30. CK7, CK20, e CDX2 12 ADENOCARCINOMAS Positivospara CDX2 Negativos para CK20 CARCINOMA LARGE-CELLS NÃO-NEUROENDÓCRINO Positivo para CK7, CK20, e CDX2 (10% ou mais das células) RESULTADOS- BROAD CYTOKERATINS 3 CARCINOMAS LARGE- CELLS Negativos para CK7 e CDX2 Positivos para CK20
- 31. CK5 e P63 1CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS Negativo para CK5 e P63 Positivo para apenas CK5 (<10%) 63 CASOS + A COMPONENTE ESCAMOSAS DE TODOS OS CARCINOMAS ADENOESCAMOSOS Positivos para os CK5 e P63 1 CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS RESULTADOS- BROAD CYTOKERATINS 1 CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS Positivo para apenas CK5
- 32. CK5 e P63 1ADENOCARCINOMA 1 CARCINOMA DE LARGE- CELLS Positivo para CK5(1% -2% das células). Positivo para P63 RESULTADOS- BROAD CYTOKERATINS
- 33. • Receptor deEstrogénio (ER): • ≥10% das células em 13% dos carcinomas de células escamosas. • 1% das células em 15% dos adenocarcinomas • ≥ 10% das células em 7% dos adenocarcinomas • Receptor de Progesterona (PGR): • ≥ 10% das células em 1 dos casos de adenocarcinoma Nenhum tumor foi positivo para ER ou PGR! RESULTADOS- MARCADORES PARA O CANCRO DA MAMA
- 34. Para qualquer marcador neuroendócrinofoi observada: 8% dos casos de carcinomas de células escamosas 12% dos casos de adenocarcinomas – dos quais 3 casos foram positivos para 2 marcadores! Em todos os casos de carcinomas com características neuroendócrinas pelo menos 1 marcador neuroendócrino foi positivo! Marcadores Neuroendócrinos: SNYAP, CHROMA E CD56! RESULTADOS- MARCADORES NEUROENDÓCRINOS
- 35. 9 Carcinomas neuroendócrinoslarge-cell 1 Positivo apenas para SYNAP 5 positivos para 2 dos 3 marcadores neuroencócrinos 3 Positivos – SYNAP, CHROMA e CD56 Carcinoma large-cell com componente neuroendócrina. A com H&E e B com IHC para RESULTADOS- MARCADORES PARA CARCINOMAS NEUROENDÓCRINOS LARGE-CELL
- 36. Em 98 destes 108casos (90.7%) pelo menos 10% das células foram positivas para ambos os marcadores! Negativos para os 2 marcadores 6% dos adenocarcinomas Positivo para ambos os marcadores Positivos para apenas 1 marcador 3 positivos apenas para NAPA 3 positivos apenas para TTF1 5% dos adenocarcinomas, dos quais: 89% dos adenocarcinomas RESULTADOS- MARCADORES TTF1 E NAPSIN-A
- 37. Adenocarcinom as Mucinosos Invasivos (7): -3 Positivos para TTF1 e NAPA. -1 Positivo apenas para NAPA. Componente Glandular dos Carcinomas Adenoescamos os (5): - Negativo para TTF1 e NAPA. - 1 Positivo para ambos. Carcinomas não- endócrinos large- cell (7): - 3 Positivos para TTF1 e para NAPA. - 1 Positivo só para NAPA. - 3 Negativos Carcinomas Neuroendócrinos de large-cell (9): - 4 Positivos só para TTF1. - Todos foram Negativos para NAPA. RESULTADOS- MARCADORES TTF1 E NAPSIN-A
- 38. • Foram os3 positivos para CKAE1/3, CKMNF e CK7 • Carcinoma Small-Cell: Positivo para TTF1 e para todos os marcadores neuroendócrinos. • 1 Carcinoma Sarcomatóide – Positivo para ER e NAPA. • 1 Carcinoma Sarcomatóide – Positivo para P63, TTF1 e NAPA em <10% das células. Porém o número de casos de estudo foi muito reduzido para tirar conclusões! RESULTADOS- CARCINOMAS SARCOMATÓIDES E DE SMALL-CELL
- 39. DISCUSSÃO • Grande quantidadede amostras • Tecido verificado • Curto intervalo de tempo • Diagnósticos baseados em espécimes cirúrgicos Mais fidedigno Viabilidade do tecido Diagnósticos mais fiáveis – biópsia
- 40. DISCUSSÃO - Revisão CASOSREVISTOS Adenocarcinomas Carcinomas adenopavimentosos Carcinoma de pequenas células Carcinomas neuroendócrinos de grandes células
- 41. DISCUSSÃO - Factores •Tempo em formol • Anticorpo • Cutoff Ressecções pulmonares são fixas durante mais tempo do que amostras de biópsia Importantes Tipo de amostra Biópsia – positividade focal ?
- 42. DISCUSSÃO • CK5 –Mais específico que P63 • Combinação não é mais informativa • Positividade distinta de zonas de queratinização para CK5 carcinoma de células pavimentosas Em carcinomas de células pavimentosas
- 43. DISCUSSÃO • CK5+ Diagnóstico de carcinoma de células pavimentosas • TTF1 e NAPA • Marcadores sensíveis para adenocarcinomas • Sensibilidade mais baixa para carcinomas large-cell • TTF1- Casos de carcinomas de células pavimentosas •Investigações prévias – 1 caso TTF1+ ( cerca 10%)
- 44. DISCUSSÃO • Tumores primáriosTTTF1+ outros órgãos • Apenas um estudo incluindo metástases • Clone SPT24 casos reportados de metástases de origem colorectal Tumores não-pulmonares TTF1+ (C. 8G7G3/1)
- 45. DISCUSSÃO • NAPA+ Carcinomas de células renais e cancro da tiroide •Negativo em metástases de adenocarcinoma (poucos casos examinados) • NAPA- Carcinomas neuroendócrinos •Permite diferencia-los de adenocarcinomas • Marcadores positivos neuroendócrinos não descartam adenocarcinomas (até 10% A, CCP foram positivos)
- 46. DISCUSSÃO Percentagem (ER) CloneEstudo 15% SP1 Neste estudo 18% 1D5 Lau et al 27% SP1 Gomez-Fernandez et al 8% 1D5 Gomez-Fernandez et al • PGR, MAGLO e GCDFP-15 raramente positivos para ER; • GCDFP-15 positivos para pequeno número de adenocarcinomas do pulmão; Amostras de metástases de cancro da mama no pulmão F. de coloração +
- 47. DISCUSSÃO Calcular c/ precisão especificidade e valores preditivos •Corte não seletivo de tumores pulmonares (cancro primário e metástases) • Metástases pulmonares consecutivas (porque os parâmetros estatísticos baseiam-se na Fr de diferentes tumores) • Não há estudos com material não seletivo de tumores pulmonares: Muitas metástases não são cirurgicamente tratadas Não são verificadas com biópsia no contexto clínico; • Perfil IHC pode diferir: Metástase pode perder expressão imunohistoquimica Tumores com um certo perfil de IHC podem ser mais propícios a
- 48. DISCUSSÃO CK5 (sensível eespecifico) Carcinoma de células pavimentosas TTF1 (sensível) Adenocarcinoma do pulmão Adição de NAPA Adenocarcinoma do pulmão CK20 + (TTF1 - NAPA -) Adenocarcinoma do pulmão (casos raros) CK7 + Adenocarcinoma do pulmão
- 49. Referências Bibliográficas BRUNNSTRÖM,H.; E OUTROS. (2013). Immunohistochemistry in the Differential Diagnostics of Primary Lung Cancer - An Investigation Within the Southern Swedish Lung Cancer Study. American Society for Clinical Pathology ou American Journal Clinical Pathology??? TRAVIS, W. D.; E OUTROS. (2004). Tumours of the Lung. In TRAVIS, W. D. Pathology and Genetics of Tumours of the Lung, Pleura, Thymus and Heart. (WHO Classification of Tumours). Lyon. IARCPress. Capítulo I, p.9 – 124.
Notas do Editor
- #15 EXPLICAR ESTUDO PROSPECTIVO?? The Southern Swedish Lung Cancer Study é um estudo prospectivo e em curso que começou no final de 2005. A prospective study watches for outcomes, such as the development of a disease, during the study period and relates this to other factors such as suspected risk or protection factor(s). The study usually involves taking a cohort of subjects and watching them over a long period. The outcome of interest should be common; otherwise, the number of outcomes observed will be too small to be statistically meaningful (indistinguishable from those that may have arisen by chance). All efforts should be made to avoid sources of bias such as the loss of individuals to follow up during the study. Prospective studies usually have fewer potential sources of bias and confounding than retrospective studies. O objectivo global é obter inúmeros materiais de pacientes que permitem análises moleculares de alto rendimento para um melhor diagnóstico, classificação, prognóstico e tratamento do cancro do pulmão. O estudo, realizado em conformidade com a Declaração de Helsinki, foi aprovado pelo comitê de ética regional de Lund, Suécia (DNR 2004/762 e 2008/702).
- #16 O estudo inclui prospectivamente pacientes com suspeita ou histologicamente confirmados de cancro de pulmão primário antes do tratamento cirúrgico no Hospital Universitário de Skåne, Lund. Após consentimento informado por escrito, são recolhidas amostras de sangue pré e pós operatório, tecido fresco congelado do tumor e tecido pulmonar normal (mas não ainda analisados neste estudo). Embora todos os pacientes que foram questionados aceitaram participar do estudo, a taxa de inscrição foi de cerca de 25% de todos os cancros de pulmão tratados cirurgicamente devido a razões logísticas, terapia neoadjuvante, achado incidental de tumor, e assim por diante. Além disso, neste artigo, embora incluídos na Southern Swedish Lung Cancer Study, casos com tumor carcinóide não foram analisados. Os pacientes que foram tratados com terapia neoadjuvante (isto é, radiação pré-operatória e / ou quimioterapia) não estão incluídos no estudo. Além disso, se o espécime cirúrgico revela uma lesão benigna ou pré-malignas, o tumor in situ, um tumor não epitelial (por exemplo, linfoma ou tumor mesenquimal), ou metástase (ou seja, não é um cancro de pulmão epitelial invasivo primário), o caso é excluído.
- #18 Como parte do processo de diagnóstico de rotina do Departamento de Patologia em Lund, as ressecções pulmonares foram fixados em formol 4% aquosa neutra por 48 horas (lobos e os pulmões foram preenchidos com formaldeído via infusão brônquica e (sleeveexcisions) excisões via injeção no parênquima usando uma seringa), e o tecido do tumor foi incorporado em parafina. Todo o tecido do tumor utilizado neste estudo foi descongelado anteriormente excepto em 1 caso no qual todo o tecido do tumor tinha sido previamente congelado instantaneamente. Tissue microarray núcleos-3 a partir de cada tumor, e cada um núcleo de 1 mm de diâmetro foram retirados de um tumor primário viável. Secções consecutivas de 4 μm de espessura a partir das construções de TMA foram coradas com convencional (para avaliação da representação do tumor e a presença de células não tumorais e das estruturas em cada núcleo) e coradas de IHC. Num caso, não havia células de tumor em qualquer um dos núcleos de TMA, e secções de tecidos completos adicionais foram corados. Noutro caso, as células de tumor estavam presentes nas secções de apenas um dos três núcleos TMA, enquanto que no resto dos casos, as células de tumor estavam presentes em todos os 2 ou 3 núcleos (todos os casos, mais do que 300 células tumorais viáveis em cada secção e, na maioria dos casos, mais do que 1.000 células).
- #19 Como parte do processo de diagnóstico de rotina do Departamento de Patologia em Lund, as ressecções pulmonares foram fixados em formol 4% aquosa neutra por 48 horas (lobos e os pulmões foram preenchidos com formaldeído via infusão brônquica e (sleeveexcisions) excisões via injeção no parênquima usando uma seringa), e o tecido do tumor foi incorporado em parafina. Todo o tecido do tumor utilizado neste estudo foi descongelado anteriormente excepto em 1 caso no qual todo o tecido do tumor tinha sido previamente congelado instantaneamente. Tissue microarray núcleos-3 a partir de cada tumor, e cada um núcleo de 1 mm de diâmetro foram retirados de um tumor primário viável. Secções consecutivas de 4 μm de espessura a partir das construções de TMA foram coradas com convencional (para avaliação da representação do tumor e a presença de células não tumorais e das estruturas em cada núcleo) e coradas de IHC. Num caso, não havia células de tumor em qualquer um dos núcleos de TMA, e secções de tecidos completos adicionais foram corados. Noutro caso, as células de tumor estavam presentes nas secções de apenas um dos três núcleos TMA, enquanto que no resto dos casos, as células de tumor estavam presentes em todos os 2 ou 3 núcleos (todos os casos, mais do que 300 células tumorais viáveis em cada secção e, na maioria dos casos, mais do que 1.000 células).
- #20 As construções seccionais TMA foram coradas com os seguintes colorações IHC: CITOCERATINA (ALTO PESO MOLECULAR) Expressão em epitélio escamoso, ductal (células ductais de mama, pâncreas, ductos biliares etc.), outros epitélios simples e neoplasias correspondentes. Utilizado na detecção de células basais da próstata para diagnóstico diferencial entre carcinoma e hiperplasia (citoceratina 5, 6 e 10). CITOCERATINA (BAIXO PESO MOLECULAR) Expressão em células epiteliais não escamosas, como adenocarcinoma de ovário, trato gastrointestinal, e nas neoplasias correspondentes, é utilizada em combinação com as citoceratinas de alto peso molecular (citoceratinas 8 e 20). cytokeratin (CK) clone AE1 / AE3 / PCK26 (CKAE1 / 3), ? Marcadores epiteliais? CK clone MNF116 (CKMNF), ? Marcadores epiteliais? CK5, Marcador de epitélio escamoso normal e neoplásico CK7, Marcador de epitélios glandulares e transicionais. CK20, Marcador de células de epitélio gastrointestinal, células de Merkel e urotélio ??? P63, Marcador de células mioepiteliais. Estrogenreceptor = RECEPTOR DE ESTROGÉNIO (ER), Permite determinar pacientes com neoplasias hormônio-dependentes Progesteronereceptor = RECEPTOR DE PROGESTERONE (PGR), Permite determinar pacientes com neoplasias hormôniodependentes Mammaglobin = MAMAGLOBINA ? (MAGLO), ?? Mamaglobina (10 kD) consiste numa glicoproteína associada à mama distantemente relacionada com família de secretoglobinas que inclui uteroglobina e lipofilina humanas. O mRNA de mamaglobina está presente em níveis elevados em linhas celulares de cancro da mama humano que mostraram ser um marcador sensível de cancro da mama1,2,3. Quando combinada com outros marcadores limitados à mama tais como GCDFP-15, é obtida uma sensibilidade global para o carcinoma da mama de 84%4 . Antimamaglobina também pode ser usado para determinar a origem mamária no contexto de carcinoma metastático ?? gross cysticdiseasefluid protein-15 = FLUIDO BRUTO DOENÇA CÍSTICA-PROTEÍNA-15 ?? (GCDFP-15), ?? proteína-15 do fluido da doença cística global (GCDFP-15) é uma das quatro principais proteínas encontradas no fluido cístico obtido de doentes com alterações fibroquísticas da mama. GCDFP-15 é um marcador de diferenciação glandular apócrina em epitélios mamários benignos e malignos.1 Esta proteína apresenta uma distribuição ampla nas glândulas apócrinas em toda a parte dos tecidos axilares e perianais, bem como nas glândulas salivares sublinguais e submaxilares. A principal aplicação para este produto de anticorpo é a identificação de carcinoma da mama no cenário metastático ou a análise de fluido. Para além dos carcinomas da mama, os principais tipos de tumores que expressam GCDFP-15 foram carcinomas das glândulas salivares e glândulas sudoríparas. ??? sinaptofisina (SYNAP), Proteína ligadora do cálcio, presente em vesículas pré-sinápticas, com expressão em neurônios e grânulos neurossecretórios de neoplasias neuroendócrinas de medular adrenal, hipófise, tireóide, pâncreas etc., e tumores correspondentes, como neuroblastoma, feocromocitoma, carcinoma medular de tireóide, carcinóides etc. cromogranina A (CHROMA), Proteína componente dos grânulos secretórios de células endócrinas e neuronais com expressão na diferenciação neuroendócrina, presente em tumores de ilhota pancreática, adenoma pituitário, carcinoma medular de tireóide, tumor de Merkel, paraganglioma, tumor de pequenas células do pulmão e PNET. A cromogranina A (CgA) é produzida por tumores neuroendócrinos, que incluem tumores carcinoides. É, provavelmente, o marcador tumoral mais sensível para os tumores carcinoides. CD56, Marcador de neoplasias neuroendócrinas e alguns linfomas T, além de células NK fator de transcrição da tiróide 1 (TTF1), Marcador de carcinomas de pulmão e tireóide, e neoplasias neuroendócrinas napsina A (NAPA), Napsin A é uma proteinase aspártica funcional que é expressa no parênquima pulmonar normal em pneumócitos do tipo II e em túbulos convolutos e proximais do rim. Está presente nos lisosomas de pneumócitos do tipo II e macrófagos alveolares (provavelmente devido a fagocitose) e em menor grau, em acinares pancreáticos e ductos. Está expressa no citoplasma e é extremamente positiva em até 80% dos adenocarcinomas pulmonares primários. caudal-typehomeobox 2 protein = TIPO CAUDAL HOMEOBOX 2 DE PROTEÍNA ?? (CDX2). Útil na determinação de sítio primário/identificação do adenocarcinoma de origem intestina ??? Regula o desenvolvimento e a diferenciação do intestino delgado e grosso e é expressa no núcleo das células epiteliais de todo o trato intestinal na vida embrionaria e pos-natal A utilização das citoqueratinas CK7 e CK20 oferece ainda a oportunidade de estabelecer se a lesão é primária pulmonar (CK7+, CK20-) ou metastática do trato digestivo (CK7-, CK20+). Todos os anticorpos e soluções são utilizados nos procedimentos de diagnóstico de rotina no Departamento de Patologia. Todas as lâminas foram coradas pela Ventana Bench-mark Ultra (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ). Foi utilizado tecido de controlo para as colorações IHC em cada slide (exceto para as colorações de IHC para o qual eram esperados muitos tumores ou conhecidas como positivas e poderia ter sido usado como um controlo interno). Detalhes sobre as colorações encontram-se na Tabela 1. O estado dos marcadores de IHC foi avaliada em cada caso (HB). Um cuidado especial foi tomado para assegurar local correto de positividade (eg, citoplasmática ou nuclear, dependendo da coloração IHC) e também para não interpretar epitélio normal, reativo ou metastático que ficou aprisiondo; macrófagos; ou necrose tumoral como coloração positiva. Casos com menos de 1% das células tumorais viáveis positivos foram classificadas como negativas, 1% ou mais, mas menos do que 10% de células positivas como 1+, e 10% ou mais como 2+.
- #21 Anticorpos, clones, provedores e protocolos de coloração estão representadas na tabela 1. EXPLICAR TABELA Dar alguns exemplos! TABELA 1: Especificações para o uso de colorações/anticorpos imuno-histoquímicas Legenda: CC1, Ventana celular Condicionado 1 (EDTA, pH 8); CC2, Ventana celular Condicionado 1 (citrato, pH 6); CDX2, tipo caudal homeobox 2 de proteína; CHROMA, cromogranina A; CK AE1/3, cytokeratin clone AE/AE3/PCK 26; CMNF, cytokeratin clone MNF116; CK5, cytokeratin 5; CK7, cytokeratin 7; CK20, cytokeratin 20; ER, receptor de estrógeno; GCDFP-15, fluido bruto doença cística-proteína-15; MAGLO, mamaglobina; NAPA, napsina A; P1, Ventana Protease 1; PGR, receptor de progesterona; RTU, pronto a usar; SYNAP, sinaptofisina; TTF1, fator de transcrição da tireóide 1. (a) Para SYNAP e CHROMA, também foram utilizados nervos periféricos como tecido de controle, mas não sobre os slides do presente estudo. O estado dos marcadores de IHC foi avaliada em cada caso (HB). Um cuidado especial foi tomado para assegurar local correto de positividade (eg, citoplasmática ou nuclear, dependendo da coloração IHC) e também para não interpretar epitélio normal, reativo ou metastático que ficou aprisiondo; macrófagos; ou necrose tumoral como coloração positiva. (DIZER??) Casos com menos de 1% das células tumorais viáveis positivos foram classificadas como negativas, 1% ou mais, mas menos do que 10% de células positivas como 1+, e 10% ou mais como 2+.
- #22 No total, 207 casos foram investigados neste estudo. Houve 88 (43%) homens e 119 (57%) mulheres, e a média ± SD idade no momento da cirurgia foi de 68,8 ± 8,3 anos. Dois casos, cada um tinha dois tumores simultâneos (2 adenocarcinomas e um carcinoma de células escamosas, acrescido de um adenocarcinoma, respectivamente???). Assim, o número total de tumores caracterizados era 209. Além disso, um caso tinha um carcinoma large-cell, com duas populações distintas – um com células grandes e citoplasma eosinófilo e pálido e outro com características neuroendócrinas – e essas populações foram estudados separadamente.
- #23 O tipo histológico dos 209 tumores foi a seguinte: 121 (58%) adenocarcinomas, 65 (31%) carcinomas de células escamosas, 15 (7%) carcinomas de células grandes, ( Dos 15 carcinomas de células grandes, 9 tiveram características histológicas neuroendócrinas, incluindo um que era a combinação de um neuroendócrino de células grandes com um carcinoma não neuroendócrino) 5 (2%) carcinomas adenoescamosos, 2 (1%) carcinomas sarcomatóides (carcinoma de célula gigante e carcinoma pleomórfico, respectivamente), 1 (0,5%) carcinoma de células pequenas.
- #24 Na imagem 1, 2, 3 e 4, vários resultados de coloração IHC são mostrados para alguns casos típicos ou interessantes. IMAGEM 1: Adenocarcinoma acinar com fraco positivo para receptor de estrogênio (ER). Coloração H&E (A), e coloração imuno-histoquímica para ER (B), factor de transcrição da tiróide 1 (C), e napsina A (D) (100 ×; todas as imagens do mesmo tecido núcleo microarray). (http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1806-37132009000400012) (http://www.sergiofranco.com.br/bioinforme/index.asp?cs=AnatomiaPatologica&ps=imunoHistoquimica) Napsin A é uma proteinase aspártica funcional que é expressa no parênquima pulmonar normal em pneumócitos do tipo II e em túbulos convolutos e proximais do rim. Está presente nos lisosomas de pneumócitos do tipo II e macrófagos alveolares (provavelmente devido a fagocitose) e em menor grau, em acinares pancreáticos e ductos. Está expressa no citoplasma e é extremamente positiva em até 80% dos adenocarcinomas pulmonares primários. Os carcinomas de células escamosas e carcinomas de células pequenas do pulmão são caracteristicamente negativas para a napsin A. Os adenocarcinomas, incluindo os da mama, pâncreas, tracto biliar e cólon raramente apresentam coloração com a anti-napsin A.1-5 O adenocarcinoma pulmonar com diferenciação entérica (PAED) é um caso especial no qual essencialmente nenhum destes casos são etiquetados pelo anticorpo de napsin A
- #25 IMAGEM 2: Adenocarcinoma mucinoso (com menor crescimento acinar) com positividade focal para o tipo caudal homeobox 2 de proteína (CDX2) e citoqueratina 20 (CK20). Coloração H&E (A) e coloração imuno-histoquímica para citoqueratina 7 (B), CDX2 (C), e CK20 (D). (100 ×; todas as imagens do mesmo tecido núcleo microarray). (http://morfoudec.blogspot.pt/2009/07/cdx2-proteina-caudal-homeobox-2.html)
- #26 IMAGEM 3: Carcinoma escamoso positivo para citoqueratina 7 (CK7). Coloração H&E (A) e coloração imuno-histoquímica para CK7 (B), citoqueratina 5 (C), e P63 (D). Observe também a positividade CK7 distinta no epitélio alveolar preso ??? (por exemplo, no canto superior esquerdo das imagens) (100 ×; todas as imagens do mesmo tecido núcleo microarray).
- #27 IMAGEM 4: Carcinoma de células grandes com uma componente neuroendócrina (A, B) e outra não-neuroendócrina (C,D). Coloração H&E (A e C) e coloração imuno-histoquímica para cromogranina A (B e D) (100 ×; A, B e C, D a partir do mesmo tecido núcleo microarray). CROMOGRANINA A A cromogranina A (CgA) é produzida por tumores neuroendócrinos, que incluem tumores carcinoides. É, provavelmente, o marcador tumoral mais sensível para os tumores carcinoides.
- #28 Na tabela 2, os resultados das manchas de IHC (imuno-histoquimica) são mostrados para cada um dos tipos de tumores mais prevalentes. EXPLICAR TABELA dar alguns exemplos ?? Não sei se vou ser eu! TABELA 2 Frequência (percentagem) dos cancros do pulmão positiva para diferentes colorações imuno-histoquímicas (IHQ) (a) Legenda: CDX2, tipo caudal homeobox 2 de proteína; CHROMA, cromogranina A; CKAE1/3, cytokeratin clone AE1/AE3/PCK26; CMNF, cytokeratin clone MNF116; CK5, cytokeratin 5; CK7, cytokeratin 7; CK20, cytokeratin 20; ER, receptor de estrógeno; GCDFP-15, fluido bruto doença cística-proteína-15; MAGLO, mamaglobina; NAPA, napsina A; PGR, receptor de progesterona; SYNAP, sinaptofisina; TTF1, fator de transcrição da tireóide 1. (a) Os valores são apresentados como 1% ou mais/10% ou mais de célilas tumorais positivas a menos que indicado de outra forma (b) Inclui um carcinoma de células grandes ambos com uma população de células de tumor não-neuroendócrino e outra população de células de tumor neuroendócrino
- #29 Todos os tumores foram positivos para CK AE1/3 e CMNF, no entanto para o último, em três casos menos de 10% das células tumorais foram positivas (1 carcinoma espinocelular e 2 carcinoma neuroendócrino de células grandes). Em alguns outros casos, a intensidade da coloração foi menor para CMNF do que para CK AE1 / 3, apesar de ambos os marcadores terem sido positivos em todas ou na maioria das células tumorais.
- #30 Em todos os adenocarcinomas e no componente glandular de todos os carcinomas adenoescamosos, 10% das células, ou mais, foram positivas para CK7 (na maioria dos casos, todas as células tumorais eram positivos para CK7). Dos 2 adenocarcinoma, que foram predominantemente positivos para CK20, 1 também expressa CDX2 (<10% das células), enquanto que 1 adenocarcinoma mucinoso invasivo apresentou células positivas para ambos (CK20 e CDX2) (ambos <10%).
- #31 Além disso, havia 12 outros adenocarcinomas onde CDX2 era positivo, mas CK20 era negativo. Num carcinoma de células grandes (não neuroendócrino), 10% ou mais das células foram positivas para CK7, CK20, e CDX2, enquanto outros três carcinomas de células grandes foram negativos para CK7 e CDX2 mas positivos para CK20.
- #32 Um caso de carcinoma de células escamosas foi negativo para CK5 e P63. Este foi um tumor escamoso pouco diferenciado com pontes intercelulares apenas esporádicas e discretas e uma grande área com queratinização em toda a secção do tumor corada por H&E (não representado no construto TMA). Num desses casos de carcinoma de células escamosas, que tinha um tumor pouco diferenciado com pontes intercelulares focais mas distintas e com queratinização, CK5 foi positivo em menos de 10% das células. ??? Um outro caso foi positivo para apenas CK5. Os outros 63 casos, bem como a componente escamosas de todos os carcinomas adenoescamosos, foram positivas para os CK5 e P63. Um adenocarcinoma e um carcinoma de células grandes tinham células CK5-positivo focais (cerca de 1% -2% das células do tumor em ambos os casos). Estes casos tiveram uma aparência um tanto “squamoidfocally”, mas há certas queratinizações ou pontes intercelulares que foram vistas nas seções coradas por H&E. No caso de carcinoma de células grandes, as células foram positivas também para P63, ao passo que vários outros adenocarcinomas e carcinomas de células grandes exibiram um número variável de células p63-positivos.???
- #33 Um adenocarcinoma e um carcinoma de células grandes tinham células CK5-positivo focais (cerca de 1% -2% das células do tumor em ambos os casos). Estes casos tiveram uma aparência um tanto “squamoidfocally”, mas há certas queratinizações ou pontes intercelulares que foram vistas nas seções coradas por H&E. No caso de carcinoma de células grandes, as células foram positivas também para P63, ao passo que vários outros adenocarcinomas e carcinomas de células grandes exibiram um número variável de células p63-positivos.???
- #44 É sugerido no artigo que a positividade para CK5 deveria ser suficiente para diagnósticar um carcinoma de células pavimentosas numa pequena amostra se as características do diagnóstico morfológico forem difíceis de detetar, usando a coloração convencional (dado que metástase de células não-pavimentosas CK5-positivas, tais como carcinoma do mesotélio ou urotélio, podem ser invalidadas). TTF1 e NAPA foram ambos marcadores sensíveis para adenocarcinoma neste estudo. Além disso, a combinação de ambos marcadores foi ainda mais sensível. No entanto, A sensibilidade do TTF1 e NAPA foi mais baixa para carcinomas com grandes células. TTF1 foi completamente negativo no caso dos carcinomas de células pavimentosas, neste estudo. Contudo, em investigações prévias, os responsáveis deste estudo apenas encontraram um único caso com uma significância focal de positividade para TTF1 (cerca de 10% de células numa secção inteira de um tumor; contudo, carcinomas de células pavimentosas não são examinados, com rotina, com TTF1). Caso um TTF1-positivo verificado numa biopsia de um carcinoma de células pavimentosas leve à consideração de um componente de adenocarcinoma, é necessário ser examinado.
- #45 Também, tumores primários TTF1-positivos noutros órgãos foram reportados mas apenas um estudo incluindo metástases mostrou tumores não-pulmonares TTF1-positivos (outros que não cancro da tiroide) no pulmão. Embora TTF1 clone 8G7G3/1 seja um marcador muito específico, o clone SPT24 é menos especifico, com mais casos reportados de metástases TTF1-positivas de origem colorectal.
- #46 À parte de cancro pulmonar, NAPA é principalmente positivo em carcinoma de células renais e em alguns casos de cancro da tiroide - nenhum caso de metástase de adenocarcinoma NAPA-positivo foi reportado no pulmão, embora não foram examinados muitos casos. NAPA foi negativo em células grandes de carcinomas neuroendocrinos neste estudo. Isto pode ser útil em diferenciar grandes células de carcinomas neuroendocrinos de adenocarcinomas, quando formações glandulares não são óbvias. De facto, embora não frequentemente encontrados em adenocarcinomas, marcadores positivos neuroendocrinos não descartam este diagnóstico porque até 10% de adenocarcinomas, carcinomas de células pavimentosas, e células grandes de carcinomas não-neuroendócrinos foram positivas para marcadores neuroendócrinos noutros estudos.
- #47 Neste estudo, 15% dos adenocarcinomas expressaram receptores de estrogénio (ER) avaliado com o cloneSP1. Num estudo realizado por Lau et al, 18% dos adenocarcinomas pulmonares foram positivos para ER avaliado com clone 1D5, enquanto num estudo realizado por Gomez-Fernandez et al, 27% dos adenocarcinomas pulmonares foram positivos para ER avaliado com o clone SP1 e apenas 8% para o clone 1D5. PGR, MAGLO e GCDFP-15 foram raramente positivos para ER, com GCDFP-15 conhecido por ser positivo apenas num pequeno número de adenocarcinomas do pulmão noutros estudos. Grandes amostras de metástases de cancro da mama no pulmão seriam de extrema importância para a análise da frequência de coloração positiva para estes quatro marcadores, para avaliar melhor os seus valores preditivo sem diagnósticos diferenciais de tumores pulmonares.
- #48 Para calcular com precisão a especificidade e os valores preditivos positivos e negativos de qualquer marcador IHC, é necessário um grupo/corte não seletivo de tumores pulmonares, incluindo cancro primário do pulmão e metástases pulmonares. Além disso, metástases pulmonares não consecutivas não são suficientes para calcular com precisão a especificidade e os valores preditivos porque esses parâmetros estatísticos baseiam-se na frequência relativa de diferentes tumores. Apesar de vários estudos sobre o cancro do pulmão terem incluído um número bastante grande de tumores primários noutros órgãos, apenas alguns têm incluído metástases pulmonares, e segundo o artigo, não há nenhum estudo com material não seletivo de tumores pulmonares (o que, infelizmente, seria praticamente impossível de alcançar, porque muitas metástases pulmonares não são cirurgicamente tratadas nem mesmo verificadas com biópsia no contexto clínico). No presente estudo, não temos casos de metástases pulmonares porque esta investigação é parte de um estudo prospetivo sobre cancro primário do pulmão, no entanto um dos objectivos deste grupo é apresentar tal estudo populacional no futuro. O perfil imunohistoquimico (IHC) num grupo/corte de metástases pulmonares pode diferir de um corte aparentemente semelhante de tumores primários num órgão diferente, porque é possível que a metástase perca expressão imunohistoquimica e que tumores com um certo perfil de IHC possam ser mais propícios a metástase.
- #49 Em resumo, no departamento do estudo em questão, CK5 é muito sensível e altamente específico para carcinoma de células pavimentosas e TTF1 é um marcador muito sensível para adenocarcinoma do pulmão. A adição de NAPA contribui para uma sensibilidade ainda mais elevada para os adenocarcinomas. Embora a positividade de CK20 possa ser vista em adenocarcinomas pulmonares (em combinação com coloração negativa para TTF1 e NAPA em casos raros) CK7 é sempre positivo.