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__________________________________________________________ Microbiologia
APONTAMENTOS
PERGUNTAS MAIS IMPORTANTES
1. Algumas descobertas são marcos na história da microbiologia. Cite exemplos.
• Anthony van Lunwenhok – foi o pai da microbiologia, já que foi ele o
responsável pela construção do instrumento – o microscópio – que tornou
possível a observação de seres minúsculos. Os quais observou, descreveu e
desenhou designando-os por “animáculos”;
• Lazarro Spallanzani – deu o primeiro passo para a destruição do conceito
de abiogénese (“geração espontânea”); revelou que carne quando fervida
não se alterava já que o calor destruía o microorganismo;
• Louis Pasteur – veio demonstrar com os seus frascos com pescoço de
cisne, que não existia “geração espontânea”, mas sim que os
microorganismos provinham de outros pré-existentes nas poeiras do ar –
teoria da biogénese; descobre que existem microorganismos que necessitam
de O2 para viver (bactérias anaeróbias); inventa um processo de
esterilização dos alimentos – pasteurização; isolou o parasita responsável
pela doença do bicho-da-seda e demonstrou a possibilidade de eliminar a
doença; descobriu que a acção das bactérias altera a composição químicas
dos produtos dos caldos, através da fermentação (transformam os hidratos
de carbono em álcool e ácidos orgânicos) e da putrefacção (decomposição
das proteínas, com formação de produtos de cheiro nauseabundo);
demonstra serem as fermentações o resultado de actividades microbianas;
• Conh e Tyndal – descobriram que existem formas de vida resistentes ao
calor (esporos termorresistentes) e dão nascimento a um novo método de
esterilização – tindalização;
• Joseph Lister – desenvolve trabalhos sobre antissepsia e descobre que os
vapores de ácido carbónico reduzem a infecção no pós-operatório;
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___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________
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• Robert Koch – fez a 1.ª demonstração directa do papel desempenado por
uma bactéria no desenvolvimento de uma doença – o Bacillus anthracis – e
a doença que este agente produzia (carbúnculo); isola o Mycobacterium
tuberculosis (bacilo de Koch), agente causador da tuberculose; define um
conjunto de princípios relacionados com o que estudou – Postulados de
Koch:
• Um microorganismo específico está sempre associado a um caso de
doença;
• O microorganismo suspeito deve ser isolado e capaz de crescer em
laboratório;
• A inoculação da cultura deve ser capaz de produzir a mesma doença
num animal susceptível;
• O mesmo microorganismo deve ser isolado a partir do animal
doente;
Desvantagens dos Postulados de Koch:
• Há microorganismos que não crescem em meios de cultura;
• Presentemente conhecem-se microorganismos que apenas são
patogénicos para o Homem, não produzindo doença em animais –
vírus da hepatite C, Treponema pallidum, Mycobacterium leprae;
• James Watson – descobre a es6rutura do DNA;
• Alexander Fleming – descobriu a penicilina e a lisozina.
2. Cite as principais diferenças entre procarióticas e eucarióticas e cite exemplos de
uns e de outros.
Um ser eucariota apresenta nas suas células um núcleo individualizado
envolvido por uma membrana nuclear, onde se encontra inserido o DNA. No citoplasma
existem vários organelos – ribossomas, cloroplastos, mitocôndrias, retículo
endoplasmático, aparelho de Golgi, vacúolos, flagelos e citoesqueleto – que
desempenham funções específicas. As células eucarióticas são maiores e mais
complexas, o seu genoma é maior e possuem mecanismos muito mais elaborados que a
células procarióticas. Exemplos: animais, plantas, fungos, algas e protozoários.
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Os procariotas apresentam células sem núcleo individualizado e estão
organizadas em ribossomas e parede celular. Exemplos: eubactérias e arqueobactérias.
3. As bactérias podem ser classificadas em Gram positivas e Gram negativas de
acordo com a parede celular. Explique.
A parede celular confere protecção mecânica (impede a lise da célula bacteriana
em meio hipotónico), confere forma à bactéria e determina o comportamento ao Gram.
O diferente comportamento das bactérias ao Gram deve-se ao facto dos dois
grupos bacterianos (Gram + e Gram -) apresentarem parede celular química e
estruturalmente diferente.
A parede celular das bactérias Gram + não apresenta lípidos (excepto nos
géneros Mycobacterium, Corynebacterium e Nocardia) e apresenta elevada
concentração de peptidoglicano (50-90% do peso da parede).
Enquanto que a parede das bactérias Gram – apresenta um elevado teor em
lípidos e baixa concentração de peptidoglicano (10% do peso da parede).
3.1 Outros métodos de coloração podem ser utilizados, Cite um exemplo e explique.
Há bactérias que não são visíveis na coloração de Gram, apesar de terem uma
parede do tipo gram + complexa. Por isso recorre-se a outros processos de coloração,
por exemplo, Ziehl-Neelsen. Os BAAR após a coloração com fucsina de Ziehl,
concentrada e a quente, resistem à descoloração com o soluto de Ebner (álcool mais
ácido clorídrico).
4. Quais as funções das seguintes estruturas:
a) Retículo endoplasmático.
É constituído por um labirinto intracelular de cisterna, limitado por
membranas. Divide-se em retículo endoplasmático rugoso (cisterna revestida por
ribossomas) e retículo endoplasmático liso (não tem ribossomas).
O retículo endoplasmático rugoso é o responsável pela síntese de todas as
proteínas secretadas para o exterior das células, das proteínas das membranas e
das enzimas lisossómicas.
O retículo endoplasmático liso é muito abundante nas células hepáticas e
musculares. Tem como funções a biossíntese de lípidos, a degradação de drogas
e compostos tóxicos (desintoxicação) e o armazenamento de cálcio.
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b) Aparelho de Golgi.
É constituído por um conjunto de cisternas e vesículas que modificam,
acondicionam e distribuem as proteínas e lípidos produzidos pelo retículo
endoplasmático. É no aparelho de Golgi que se produzem as glicoproteínas.
c) Pili.
Os pili são estruturas filamentosas de natureza proteica, só visíveis na
microscopia electrónica e que permitem o contacto entre bactérias de sexo
diferente.
5. As bactérias são identificadas por características morfológicas e propriedades
bioquímicas. Cite algumas.
Em relação às propriedades morfológicas podemos dividir as bactérias em cocos
e bacilos. Podemos ainda verificar a presença/ausência de cápsula.
Em relação às propriedades químicas temos a classificação pela composição
química da membrana (colorações)
6. Em que característica se baseia a classificação dos vírus?
O vírus é uma entidade potencialmente patogénica cujo genoma são ácidos
nucleicos que se replicam no interior de células vivas usando o equipamento de síntese
celular e que sintetizam partículas que transmitem o genoma a outras células.
Os principais critérios usados na classificação de vírus são:
• Tipo e estrutura do genoma – com DNA ou RNA; DNA de cadeia linear
ou circular, de cadeia simples ou dupla; RNA de cadeia dupla ou simples;
• Estrutura – icosaédrica, helicoidal ou mista;
• Tipo de hospedeiro – vertebrado, invertebrado, plantas, fungos ou
bactérias.
7. Quais são as fases do ciclo viral?
O ciclo viral é um ciclo infeccioso que inclui diversas fases distintas:
• Absorção – o vírus adsorve-se aos receptores da membrana da célula;
• Penetração – translocação da partícula para o interior da célula;
• Descapsidação – perda da cápsula no citoplasma ou no núcleo celular;
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• Fase sintética – síntese dos componentes virais e replicação do genoma
viral;
• Montagem e extrusão – os componentes dos vírus são montados em
partículas mais ou menos complexas; são posteriormente transportados para
o exterior sem entrar em contacto com o citoplasma.
7.1 Quais os marcadores de infecção no VHB?
• HBsAg – indica infectividade do sangue;
• HBsAc – anticorpo contra o antigénio de superfície; fornece imunidade,
não está presente nos indivíduos portadores; imunidade após infecção ou
após vacinação;
• HBeAg – antigénio da nucleocopside; indica transmissibilidades;
• HBeAc – anticorpo do HbeAg; indica baixa transmissibilidade;
• HBcAg – antigénio do core;
• HBcAc – anticorpo do antigénio do core; aparece na fase inicial.
8. Cite três vantagens da flora normal para o hospedeiro.
A flora comensal serve de barreira de defesa contra as infecções. Os
microorganismos da flora comensal impedem a colonização da sua área de residência
por outras bactérias, mantendo assim o equilíbrio entre as diversas populações.
A flora comensal do intestino grosso ajuda à fermentação doa alimentos.
9. A disseminação da flora normal para locais estéreis do organismo pode ocorrer
em várias situações. Cite três exemplos.
Esta disseminação pode ocorrer por alteração do pH, por desidratação, por má
higiene e devido a defeitos congénitos.
10. Cite quatro estratégias adoptadas pelos microorganismos para maximizar a sua
sobrevivência no hospedeiro.
Para escaparem aos mecanismos de defesa do hospedeiro, os microorganismos
aderem ao hospedeiro, disseminam (invadem) para outros locais, mantém-se no local da
primeira interacção com o hospedeiro pois há características favoráveis ao seu
desenvolvimento, induzem lesão ou utilizam toxinas para facilitar o seu ciclo de vida.
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11. A densidade dos microorganismos no trato digestivo aumenta do estômago até
ao intestino grosso. Explique.
O tracto gastrointestinal é onde reside a maioria da flora do organismo.
No estômago há pouca flora devido à existência de pH muito ácido (suco
gástrico).
No intestino delgado também há pouca flora devido à acção conjunta do suco
gástrico, da bílis e do suco pancreático.
No entanto é no intestino grosso que reside a maior parte da flora do organismo,
já que aí o pH é mais alcalino devido à fermentação dos alimentos, o que permite que
cresçam abundantemente bactérias.
12. O que entende por sistema de defesa inato.
Os mecanismos de defesa inatos (imunidade inata) estão sempre presentes num
indivíduo saudável e não são específicos, são efectivos contra a maioria dos
microorganismos e constituem a 1.ª linha de defesa do organismo. É o caso das barreiras
físicas (pele), as células fagocitárias ou as moléculas com actividade antimicrobiana.
13. Quais são as vantagens da existência de diferentes classes de imunoglobulinas?
Podemos classificar os anticorpos (imunoglobulinas) em:
• IgA – surgem na fase aguda da doença e a sua detecção permite um
diagnóstico mais precoce;
• IgM – surgem no início da resposta humural e perduram até ao fim da fase
aguda da doença; revelam um contacto recente com o antigénio específico;
• IgG – na convalescença as IgG substituem as IgM e podem ficar com os
títulos residuais toda a vida.
14. Os plasmídeos podem conter genes de virulência. Diga o que sabe.
As bactérias têm na sua constituição plasmídeos.
São sequências de DNA, onde estão codificadas as resistências às drogas, a
síntese de enzimas que originam a resistência à droga.
Assim possuem resistências cromossómicas (naturais) e resistências mediadas
por plasmídeos (adquiridas).
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Por exemplo, as enzimas β-lactamases são codificadas por plasmídeos, e vão
inibir a acção dos fármacos antibióticos do grupo β-lactâmicos, utilizados para destruir
todas as bactérias.
15. O que são doenças transmitidas por vectores? Dê exemplos.
São doenças transmitidas por artrópodes (moscas, mosquitos, carraças), que
podem actuar como reservatórios (se há multiplicação do agente, o que é essencial ao
ciclo de vida do parasita) ou serem passivos (apenas transmitem).
Por exemplo a transmissão das Ricktesias.
16. Defina infecção hospitalar.
Infecção hospitalar é a infecção adquirida pela passagem ou permanência no
Hospital, e que pode infectar tanto os utentes como os profissionais de saúde.
As vias de transmissão são:
• Doente  Doente;
• Meio  Doente;
• Material  Doente;
• Profissional de saúde  doente;
• Comunidade  Doente;
• Material  Profissional de saúde;
• Meio  Profissional de saúde.
17. Defina esterilização.
Esterilização é o processo mediante o qual todas as formas de vida – bactérias,
fungos e vírus – contidos em líquidos, utensílios, instrumentos e substâncias são
completamente destruídos.
17.1 Cite limitações no uso do óxido de etileno.
Vantagens:
• Não detiora os objectos cortantes nem os termo-sensíveis;
• Eficaz sobre bactérias e esporos;
• Tem grande capacidade de penetração.
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Desvantagens:
• Ciclos de esterilização longos;
• Deixa resíduos tóxicos em alguns materiais;
• Necessita de arejamento;
• Mais caro que os outros métodos;
• Instalação perigosa.
18. Defina desinfecção.
É o processo físico ou químico, pelo qual os agentes patogénicos ou micróbios
causadores da doença são destruídos.
18.1 Quais os critérios usados na escolha de um antisséptico?
Antissépticos são substâncias químicas que actuando sobre os tecidos vivos
destroem os microorganismos ou impedem o seu crescimento.
Os critérios usados na sua escolha são:
• Factores físicos – ter em conta o pH, a temperatura e a luz do local;
• Factores químicos – não devemos juntar substâncias desconhecidas;
• Factores microbiológicos – a eficácia depende do número e da natureza
dos gérmens.
19. A que normas gerais devem obedecer a colheita e transporte de produtos
biológicos para a cultura de microorganismos?
A colheita deve obedecer às seguintes normas:
• O produto biológico deve ser colhido no local que, no momento da
infecção, oferece maior possibilidade de se isolar o agente infeccioso;
• A colheita deve ser feita antes do início de cada terapêutica;
• A colheita deve ser feita com material estéril (seringa, agulha, bisturi) e
para contentor estéril (tubo de ensaio, frasco);
• A colheita deve ser adequada e suficiente (expectoração sem saliva);
• Os produtos devem ser colhidos para um meio de transporte que mantenha
a viabilidade do microorganismo.
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20. Defina microbiologia e microorganismo.
Microbiologia é a ciência que estuda os seres vivos de dimensões microscópicas
bem como outros que têm durante a sua evolução ovos ou formas larvares
microscópicas.
A microbiologia inclui áreas como a bacteriologia, a virologia, a parasitologia e
a micologia.
Microorganismo é um organismo, vegetal ou animal, com dimensões
microscópicas.
21. O que é uma estirpe?
Estirpe são descendentes de uma colónia pura.
22. Em que consiste a técnica de coloração de Gram?
Consiste em:
• Corante primário (Violeta Cristal);
• Mordente (Soluto de Lugol);
• Descorante (Etanol);
• Corante de contraste (Fucsina básica).
As bactérias Gram + fixam o corante primário (Violeta de Cristal) adquirindo a
cor arroxeada.
As bactérias Gram – fixam o corante de contraste (Fucsina básica) corando de
vermelho.
23. O que é o peptidoglicano?
É um macropolímero em forma de saco, presente em todas as paredes celulares
bacterianas, rígido e insolúvel em água. É constituído por 2 a.a. a N-acetilglucosamina
(NAG) e o ácido N-acetilmurâmico (NAM).
24. Como é constituída a parede celular das bactérias Gram +?
É constituída por peptidoglicano, ácidos teicóicos e teicurónicos. Estes ácidos
estão associados ao peptidoglicano mas não conferem rigidez.
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25. Caracterize os ácidos teicóicos e teicurónicos.
Os ácidos teicóicos contém vestígios de glicerol e ribitol, são solúveis na água e
localizam-se em toda a espessura da membrana.
Os ácidos teicurónicos (as moléculas) substituem os ácidos teicóicos quando as
bactérias crescem em meios pobres em fósforo por conterem galactosamina mais ácido
glucónico.
Tanto os ácidos teicóicos, como os ácidos teicurónicos são responsáveis pela
carga – da superfície dos bacilos Gram +, atraem Mg2+
e Ca2+
e reduzem as repressões
electrostáticas no polímero conferindo estabilidade estrutural.
26. O que são autolisinas?
São enzimas que actuam durante o crescimento bacteriano (enzimas hidrolíticas
dos peptidoglicanos), ligando a parede bacteriana para que a bactéria possa crescer. Se
houver algum descontrolo dessa lise leva a bactéria ao suicídio.
27. Qual a composição química da parede celular das bactérias Gram -?
É constituída por lipopolissacarídeos (LPS), fosfolípidos, proteínas, porinas,
autolisinas e peptidoglicano.
28. Como actuam os antibióticos sobre a membrana exterior das bactérias?
Os antibióticos atravessam a membrana exterior das bactérias por 2 processos:
via hidrofílica (através de porinas) e via hidrofóbica (através da bicamada fosfolipídica).
29. O que são as cápsulas?
São estruturas que envolvem a parede celular de algumas bactérias, retém água e
impedem a dissecação da bactéria, Conferem grande virulência (cápsula
antifagocitária).
30. Caracterize as seguintes estruturas intracitoplasmáticas:
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• Granulações metacromáticas – constituem reserva de fósforo essencial
para a síntese de ácidos nucleicos e fosfolípidos da bactéria; estão presentes
no agente da difteria e podem visualizar-se pela coloração de Albert;
• Vacúolos de gás – estão presentes em arqueobactérias e bactérias
fotossintéticas; funcionam como reservatório de azoto, permitindo às
bactérias flutuar na água;
• Grânulos de glicogénio – são polímeros de glucose; funcionam como
material de reserva energética e coram pelo reagente de Lugol;
• Grânulos de lípidos – funcionam como material energético de reserva e
coram com o negro de Sudão;
• Ribossomas – encontram-se dispersos no citoplasma bacteriano; são muito
abundantes; são os locais de síntese proteica e são constituídos por
proteínas e ácidos nucleicos;
• Endosporos – permitem a modificação de células vegetativas em esporos;
impedem a dissecação celular, formam resistência em condições hostis tais
como radiações, detergentes, calor, antibióticos; preservam o material
genético em boas condições dando origem a células vegetativas.
• Nucleóide – local da célula onde se localiza o material genético – DNA;
não possui membrana nuclear nem aparelho mitótico e funciona como um
só cromossoma; é visível com corantes básicos e o DNA plasmídico pode
coexistir com o DNA cromossómico, na mesma célula.
31. O que são os flagelos?
São órgãos de locomoção, de natureza proteica e visíveis em microscopia óptica
com corantes.
32. O que são as fimbrias?
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São estruturas filamentosas de natureza proteica, visíveis após coloração
específica e que funcionam como órgão de aderência bacteriana a outras células, já que
contém a.a. apolares que lhes confere propriedades hidrófobas.
33. O que distingue a membrana externa da parede celular da membrana interior
(citoplasmática), nas bactérias Gram -?
O que distingue uma da outra é o facto da membrana externa ser constituída por
2 folhetos: folheto interno e folheto externo.
O folheto externo é rico em lipopolissacarídeos (LPS) que são uma molécula
permeável a compostos hidrofóbicos.
O folheto interno é rico em fosfolípidos.
34. Caracterize os seguintes organelos da célula eucariótica:
• Membrana plasmática – é capaz de isolar proteínas e ácidos nucleicos do
meio externo; é constituída por:
• Fosfolípidos, responsáveis pelo tal isolamento;
• Proteínas, que asseguram as permutas com o meio exterior;
• Esteróis, colesterol nos mamíferos e ergosterol nos fungos;
• Parede celular – é um invólucro protector que está ausente nos mamíferos
e em alguns protozoários e que se encontra nas células das algas, fungos e
alguns protozoários; é constituída por polissacarídeos (ao contrário da
célula procariótica que é constituída por peptidoglicano);
• Núcleo – possui um invólucro nuclear constituído por 2 membranas: a
membrana nuclear interna e a membrana nuclear externa; Estas 2
membranas delimitam a chamada cisterna perinuclear; através da cisterna
há transporte de DNA, RNAt e RNAr para o citoplasma e transporte de
enzimas, para replicação de DNA e síntese de RNA, do citoplasma para o
núcleo; no interior do núcleo encontra-se a informação genética da célula;
• Nucléolo – estrutura nuclear em número muito variável, cuja função é a
síntese de ribossomas;
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• Ribossomas – são constituídos por 2 subunidades: grande unidade e
pequena unidade; cada uma das quais é constituída por moléculas de RNAr;
o ribossoma é o local onde ocorre a síntese proteica e pode encontrar-se
livre no citoplasma ou associado ao retículo endoplasmático rugoso;
• Retículo endoplasmático – é constituído por um labirinto intracelular de
cisterna, limitado por membranas; divide-se em retículo endoplasmático
rugoso (cisterna revestida por ribossomas) e retículo endoplasmático liso
(não tem ribossomas); o retículo endoplasmático rugoso é o responsável
pela síntese de todas as proteínas secretadas para o exterior das células, das
proteínas das membranas e das enzimas lisossómicas; o retículo
endoplasmático liso é muito abundante nas células hepáticas e musculares.
Tem como funções a biossíntese de lípidos, a degradação de drogas e
compostos tóxicos (desintoxicação) e o armazenamento de cálcio;
• Aparelho de Golgi – é constituído por um conjunto de cisternas e vesículas
que modificam, acondicionam e distribuem as proteínas e lípidos
produzidos pelo retículo endoplasmático; é no aparelho de Golgi que se
produzem as glicoproteínas;
• Lisossomas – são “sacos intracelulares” que armazenam enzimas
hidrolíticas capazes de digerir todas as macromoléculas da célula; têm
como funções:
• Digerir moléculas vindas do exterior (endocitose);
• Destruição de componentes celulares obsoletos (autofagia);
• Degradação de microorganismos ou partículas nocivas à célula
(fagocitose);
• Mitocôndrias – fornecem à célula a energia necessária para todas as
reacções do metabolismo; têm como função produzir ATP a partir de
energia armazenada nos nutrientes orgânicos;
• Peroxissomas – são sáculos envolvidos por membranas que contém
enzimas que digerem ácidos gordos e a.a., e enzimas que catalisam a
degradação do peróxido de hidrogénio; a sua função é, pois, a β-oxidação
de ácidos gordos.
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• Citoesqueleto – é a estrutura responsável pela plasticidade, flexibilidade e
motilidade das células eucarióticas; desempenha o papel de “ossos” e
“músculos” da célula; é constituído por 3 grandes tipos de proteínas:
35. Quais os produtos biológicos que podemos usar para análise?
Podemos utilizar:
• Expectoração;
• Urina;
• Fezes;
• Corrimento vaginal ou uretral;
• Líquidos – ascítico, pleural e cafalorraquídeo;
• Secreções – nasais e faringeas;
• Sangue;
• Órgãos – biópsias.
36. O que é, e para que serve um meio de transporte?
É o recipiente onde se colocam as amostras biológicas com suspeita de que s
agentes infecciosos resistam mal fora do hospedeiro.
Os meios de transporte servem para assegurar a sobrevivência desses
microorganismos porque fornecem-lhes condições de pH, concentração proteica e
atmosféricas (CO2 e O2) ideais para manterem a sua viabilidade.
37. Como se pode identificar o agente infeccioso?
O agente infeccioso pode detectar-se:
• Directamente no produto biológico – detecção de antigénios e de
sequências genómicas;
• Após cultura do produto – caracterização bioquímica, antigénica,
genotípica e teste de sensibilidade aos antibióticos.
38. Quais são as técnicas utilizadas para a detecção directa de um microorganismo
num produto biológico?
Podemos utilizar as seguintes técnicas:
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• Exame microscópico directo;
• Detecção de antigénios específicos – evidenciados pelo uso de anticorpos
específicos;
• Detecção de sequências genómicas – com pesquisa de sequências de
nucleótidos específicos.
39. Onde é feita a cultura de bactérias, vírus, fungos e parasitas “in vitro”?
As bactérias, fungos e parasitas têm meios de cultura adequados que tornam
possível a sua multiplicação.
Os vírus e microorganismos intracelulares são cultivados em células do Homem,
de animais ou até de ovos embrionados, pois exigem um suporte celular para se
multiplicarem.
40. Como se detecta o crescimento das bactérias, vírus, fungos e parasitas nas
culturas?
O crescimento das bactérias, fungos e parasitas é detectado pelas colónias
bacterianas.
O crescimento dos vírus é detectado pelo efeito citopatogénico (ECP), ou por
técnicas alternativas (hemadsorção ou hemaglutinação).
41. O que são culturas incubadas?
São culturas que têm temperatura, humidade e atmosfera adequadas ao
desenvolvimento.
42. Como é feita a caracterização e identificação do microorganismo isolado?
A caracterização e identificação do microorganismo isolado é feita por:
• Caracterização morfológica – utiliza-se a técnica de coloração de Gram+;
• Caracterização bioquímica – reconhecimento da presença de enzimas e
produtos dos metabolismos; utiliza-se para bactérias e fungos;
• Caracterização antigénica – diferentes técnicas serológicas;
• Caracterização genotípica.
43. Qual o tipo de crescimento que podem apresentar os microorganismos?
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• Crescimento rápido – 18-24h;
• Crescimento fastidioso – mais de 24h.
44. Depois de cultivados os microorganismos o que se faz?
Após a cultura do microorganismo é feita a sua identificação através do teste de
sensibilidade aos antibióticos (TSA) ou antibiograma.
O TSA baseia-se na capacidade de um microorganismo se multiplicar “in vitro”
na presença de diferentes antibióticos.
Para efectuar o TSA podemos utilizar 2 métodos: método de diluição e método
de difusão.
45. Caracterize os métodos de diluição e de difusão.
• Método de diluição – consiste em “semear” uma suspensão bacteriana
num meio de cultura sólido ou líquido com um antibiótico em concentração
crescente; após incubação efectua-se a leitura e avaliação no caldo de
turvação; podemos assim avaliar a CMI (concentração mínima inibitória)
que inibe o crescimento bacteriano e a CMB (concentração mínima
bactericida) que leva à morte de 99,9% das bactérias;
• Método de difusão – consiste em utilizar um meio sólido em placa de Petri
no qual se semeia uma suspensão bacteriana; na superfície do meio solido
colocam-se discos de papel impregnados de vários antibióticos; após
incubação faz-se a leitura e avaliação do halo de inibição do crescimento
em volta do disco; caso forma halo diz-se que a bactéria é sensível (S) ao
antibiótico, se não formar halo diz-se que é resistente (R) ao antibiótico.
46. Caracterize o diagnóstico indirecto.
Numa fase avançada da doença nem sempre é possível isolar e identificar o
agente da infecção, pois a resposta imune do hospedeiro já o eliminou.
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Vamos então pesquisar, no hospedeiro, anticorpos específicos contra o
microorganismo que provocou a doença ou pesquisar antigénios específicos do
microorganismo.
47. Caracterize a resposta imune humural.
Está ligada à actividade dos linfócitos B. Estas células produzem anticorpos e
estes ligam-se especificamente aos antigénios que o organismo reconheceu com os seus
e quer eliminar.
Os anticorpos pesquisam-se no soro, plasma, urina e outros líquidos biológicos.
48. Defina diagnóstico serológico.
É a designação que se utiliza para a pesquisa de anticorpos ou antigénios
específicos, independentemente do produto onde é feita essa pesquisa.
49. O que é o título de um soro?
É o inverso da mais alta diluição do soro que deu um resultado positivo.
Por exemplo, se a diluição mais lata que deu positivo for 1/16, então o título do
anticorpo é 16.
50. Qual a importância de se estudar 2 soros – um na fase aguda da doença e outro
na fase de convalescença?
A presença de anticorpos por si só não confirma que o doente está infectado, por
isso é necessário avaliar a evolução do título de anticorpos específicos.
A recolha de um 1.º soro na fase aguda da doença e de um 2.º soro na fase de
convalescença (15 dias de intervalo) vai permitir avaliara a tal evolução do título de
anticorpos.
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OUTROS APONTAMENTOS
HISTÓRIA DA MICROBIOLOGIA
A microbiologia é a ciência que estuda os seres vivos de dimensões
microscópicas.
Áreas diversas como:
• Bacteriologia;
• Virologia;
• Parasitologia;
• Micologia.
A microbiologia surge quando é possível a observação de seres de dimensões
microscópicas.
1632-1723:
• Antony Van Lunwenhok:
• 1.º microscopista;
• Animáculos (bactérias e protozoários).
• Conceito de abiogénese – seres minúsculos desenvolvem-se a partir de
matérias em decomposição – teoria da geração espontânea.
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1626-1697:
• Francesco Redi:
• Os germens desenvolvem-se a partir da matéria orgânica exposta ao
ar e calor.
1729-1799:
• Lazzaro Spallanzani:
• 1.º passo para a destruição da teoria da geração espontânea (carne
quando fervida não se alterava);
• Georg Schroder;
• Theodor Van Dusch;
• Usam pela 1.ª vez algodão para tapar os recipientes.
1822-1895:
• Louis Pasteur:
• Teoria da biogénese – os microorganismos provinham de outros pré-
existentes em suspensão nas poeiras;
• Usa frascos de colo de cisne.
1820-1893:
• Jonh Tyndall:
• Câmara isenta de poeiras;
• Juntamente com F. Cohn descobrem os esporos termorresistentes;
• Tindalização (esterilização);
• Tyndall/Cohn/Pasteur – como resultado da actividade microbiana:
• Fermentação – Hidratos de Carbono Álcool + Ác. Orgânicos;
• Putrefacção – decomposição das Proteínas – produtos de odor
nauseabundo;
• Pasteur descobre que existem microorganismos que não necessitam de O2
(bactérias anaeróbias);
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• Os microorganismos podem provocar doenças nos homens e animais.
1705-1786:
• Verona e Penciz:
• Via de transmissão homem a homem.
1773-1856:
• Agostinho Bassi:
• O primeiro suporte para a teoria microbiana da doença (a doença do
bicho da seda era fúngica).
1839:
• Schönlein (Tinha favosa).
1827-1912:
• Joseph Lister:
• Trabalhos sobre antissepsia;
• Vapores de Ác. Carbónico – reduz a infecção no pós-operatório.
1843-1910:
• Robert Koch:
• Estudo do Bacillus anthracis (carbúnculo);
• A 1.ª demonstração directa do papel desenvolvido por uma bactéria
no desenvolvimento de uma doença;
• Postulados de Koch:
 Um microorganismo específico deve estar associado a cada
doença;
 O microorganismo suspeito deve ser isolado em cultura no
laboratório;
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 A inoculação daquela cultura deve ser capaz de produzir a
mesma doença num animal susceptível;
 O mesmo microorganismo deve ser isolado a partir do
animal doente.
• Pelo conhecimento actual:
• Nem todos os microorganismos podem ser cultivados no
laboratório (ex.: Treponema pallidum e Mycobacterium
leprae);
• Nem todos os microorganismos patogénicos para o Homem o
são para os animais (ex.: Vírus da Hepatite C).
1882:
• Robert Koch:
• Isola em cultura Mycobacterium tuberculosis (bacilo de Koch);
• Isto foi possível porque surgiram:
•Meios sólidos (gelatina);
•Richard Petri (placa de Petri).
Nos seguintes 30 a 40 anos:
• Pasteur e Koch descobrem, isolam e cultivam muitas das bactérias
conhecidas de hoje.
1892:
• Dimitri Ivanovski:
• Isola o 1.º Vírus “Mosaico do Tabaco”;
• Desenvolvimento das primeiras vacinas.
1749-1823:
• Eduard Jenner:
• Varíola;
• Pasteur e Chamberland:
• Difteria e Tétano;
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1854-1917:
• Emil Von Behringer:
• Kitasato;
• Paul Ehreich:
• Difteria.
1845-1916:
• Ellie Metchnikoff:
• Imunidade inespecífica;
• Descobre actividade bacteriana dos leucócitos (fagócitos) –
fagocitose.
1900:
• Walter Kud:
• Febre amarela transmitida por um mosquito.
1906:
• Fritz Schandin e Erich Hoffman;
• Treponema pallidum – Sífilis.
1921:
• Alexander Fleming:
• Descobre a lisozima (imunidade inespecífica).
1928:
• Descobre a penicilina (quimioterapia) – antibioterapia.
1933:
• Ernest Ruska e Max Knoll:
• Descobrem o microscópio electrónico;
• Chaton:
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• Descobre e divide os seres vivos em:
•Eucariótas;
•Procariótas.
1935:
• Gerard Domagk:
• Descobre a sulfonamida – antibioterapia.
1944:
• Oswald T. Avery, C. M. Mcleod e M. J. McCarty:
• Processos de transformação bacteriana que possibilitam a possibilidade
de transferência de material genético de uma para outra bactéria.
1953:
• James Watson e Francis Corick:
• Estudos de biologia molecular;
• Descoberta da estrutura do DNA.
1892:
• Câmara Pestana:
• Fundador da bacteriologia em Portugal;
• Director do Real Instituto Bacteriológico de Lisboa;
• Faleceu no Porto vítima da peste bubónica.
Durante as primeiras décadas do século XX os microbiologistas
desenvolveram um trabalho no sentido de:
• Estudar os microorganismos como fonte de doença;
• A resposta imunitária do hospedeiro;
• A pesquisa de novos antimicrobianos;
• Avançaram no estudo do metabolismo microbiano.
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A partir da década de 40 em trabalho com biólogos e bioquímicos – Biologia
Molecular e Genética, surgem como novas áreas de estudo e investigação.
TAXONOMIA MICROBIANA
Taxonomia – Classificação (“arrumação”).
A taxonomia tem como base a espécie (estirpes geneticamente semelhantes).
Estirpe – descendentes de uma colónia pura.
Outras características da espécie:
• Características morfológicas;
• Necessidades nutricionais.
Espécies agrupadas em Géneros
Géneros agrupados em Famílias
Famílias agrupadas em Ordens
Ordem agrupada em Classe
Classe agrupada em Filo ou Divisão
Filo agrupado em Reino
CLASSIFICAÇÃO DOS SERES VIVOS
1735 – Lineu:
Animalia
Reinos
Plantae
1886 – Ernest Haeckel:
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Acrescenta um reino – Protistas – seres de organização unicelular ou
multicelular sem diferenciação em tecidos (bactérias, protozoários, algas, bolores,
leveduras).
1940 – A microscopia electrónica – estudo da estrutura celular interna,
surgem:
Eucariótas
2 tipos
Procariótas
ORGANIZAÇÃO CELULAR EUCARIÓTA
• Núcleo com membrana nuclear;
• Aparelho mitótico;
• DNA associado a histonas;
• Ribossomas;
• Cloroplastos (vegetal);
• Mitocôndrias;
• Retículo endoplasmático;
• Aparelho de Golgi;
• Vacúolos (vegetal);
• Flagelos;
• Citoesqueleto;
• Parede celular (vegetal).
ORGANIZAÇÃO CELULAR PROCARIÓTA
• Ribossomas;
• Parede celular;
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CÉLULAS PROCARIÓTICAS
• Archaeobacteria – bactérias produtoras de metano, desenvolvem-se em
meio hiper salino ou em temperaturas elevadas (termofílicas);
• Eubactérias – todas as bactérias incluindo as patogénicas para o Homem,
bactérias do solo e da água.
CÉLULAS EUCARIÓTICAS
• Fungos;
• Algas;
• Protozoários;
• Plantas;
• Animais.
TAXONOMIA DE WHITTAKER (1969)
Divisão em cinco reinos:
• Plantae;
• Animalia;
• Protistas – protozoários e algas unicelulares (eucarióticas unicelulares);
• Fungi – bolores e leveduras;
• Monera ou Procaryotae – todas as bactérias procarióticas.
Critérios de classificação
• Tipo celular – procariota e eucariota;
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• Nível de organização – solitária ou colonial, unicelular ou multicelular;
• Tipos de nutrição – fotossíntese, digestão ou absorção.
Nesta classificação os microorganismos ficam em três grupos:
• Monera – bactérias e cianobactérias;
• Protistas – algas unicelulares e protozoários;
• Fungi – bolores e leveduras.
TAXONOMIA DE CARL WOSE (1977)
Os seres vivos são divididos em três domínios ou impérios:
• Eukarya – protozoários, algas, fungos, plantas e animais eucariótas;
• Archaea – bactérias metanogénicas, termofílicas e halofílicas;
• Bactéria – todas as bactérias patogénicas, as bactérias do solo e da água.
Esta nova designação baseia-se na composição bioquímica da membrana
(natureza dos lípidos, tipo molecular do RNA ribossómico – mRNA).
Baseado nestes estudos defende-se que os eucariótas e os procariótas têm origem
numa mesma forma ancestral comum, mas que evoluiriam de uma forma diferente.
MICROORGANISMOS PROCARIÓTAS
BACTÉRIAS PROCARIÓTAS
MORFOLOGIA
Cocos e bacilos. Replicação por divisão binária.
Agrupamentos
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• Cocos:
• Diplococos;
• Cadeia;
• Cacho;
• Tetrada.
• Bacilos:
• Isolados;
• Cadeia curta;
• Pleomorfismo:
•Curvilíneos;
•Fusiformes;
•Ondulados;
•Espiralados.
Dimensão
De 100nm a 1,5µm.
Tintagem (coloração de Gram)
Na microscopia óptica revelam-se com corantes.
A coloração de Gram tem valor taxonómico:
Corante primário – Violeta de Cristal;
Mordente – Soluto de Lugol;
Descorante – Etanol;
• Corante de contraste – Fucsina básica.
•Bactérias positivas ao Gram – fixam o Violeta de Cristal; Parede
•Bactérias negativas ao Gram – fixam a Fucsina básica. celular
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Parede celular
As Eubactérias possuem parede celular, com excepção das Mycoplasmas
(possuem apenas membrana celular).
A parede celular:
• Confere protecção mecânica – impede a lise da célula bacteriana em
meio hipotónico;
• Dá forma à bactéria;
• Determina o comportamento ao Gram
Peptidoglicano (Mucopeptideo ou Mureina)
Presente em todas as bactérias, com excepção das Archaeobactérias (parede
celular com pseudopeptidoglicano).
O peptidoglicano é o constituinte rígido da estrutura parietal.
Diferença de comportamento ao Gram
A existência de Gram + e Gram - deve-se a estrutura e química da parede
diferentes.
Diferenças mais relevantes
• Bactérias Gram +:
• Não têm lípidos, com excepção dos três géneros Mycobacterium,
Corynebacterium e Nocardia;
• Elevada concentração de peptidoglicano – 50-90% do peso da
parede.
• Bactérias Gram -:
• Elevado teor em lípidos;
• Baixa concentração em peptidoglicano – 10% do peso da parede.
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Composição química da parede celular bacteriana
Constituintes Gram + Gram -
Peptidoglicano + +/-
Ácidos Teicóicos/Teicurónicos + +/-
Polissacarídeos + -
Proteínas +/- +
Lipossacarídeos - +
Lípidos +/- +
Parede celular das bactérias Gram +
Constituição química
• Peptidoglicano;
• Outros heteropolímeros:
• Ácidos Teicóicos; ambos estão associados ao peptidoglicano
• Ácidos Teicurónicos. mas não conferem rigidez
Peptidoglicano
• Organização tridimensional universal;
• Macropolímero em forma de saco (muraina saculus);
• Rígido/insolúvel na água;
• Constituído por dois aminoácidos, com disposição linear alternada, ligados
por ligação glicosídica, que pode ser hidrolisada pela enzima lisozima
(acção mureínica):
• N-acetilglucosamina (NAG);
• Acido N-acetil muranico (NAM) – a cada molécula de NAM liga-se
um peptídeo (cadeia de 4 aminoácidos), através de uma ligação
amina.
Ácidos Teicóicos
• Contêm vestígios de glicerol e ribitol;
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• São solúveis na água;
• Localizam-se em toda a espessura da membrana;
• Formam-se ácidos lipoteicóicos quando uma porção de ácidos teicóicos
que contêm glicerol se liga ao glicopeptídeo do folheto exterior da
membrana citoplasmática. Atravessam a parede celular dos bacilos Gram +
e constituem os antigénios somáticos dos bacilos Gram +;
• A zona hidrófila dos ácidos teicóicos é acessível aos ácidos específicos, o
que provoca a sua presença na superfície celular.
Ácidos Teicurónicos
São as moléculas que substituem os ácidos teicóicos quando as bactérias
crescem em meios pobres em fósforo por conterem galactosamina mais ácido
glucorónico.
Ácidos Teicóicos e Ácidos Teicurónicos
São responsáveis pela carga negativa da superfície dos bacilos Gram +, atraindo
Mg2+
e Ca2+
.
Reduzem as repressões electrostáticas no polímero – conferem estabilidade
estrutural.
Lípidos
Estão presentes nos géneros:
• Mycobacterium;
• Nocardia;
• Corynebacteruium.
Estas bactérias têm lípidos de peso molecular elevado que torna a molécula
impermeável a vários compostos.
O comprimento da cadeia dos ácidos lipídicos tem valor taxonómico:
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• C 24 - C 40 – ácidos corionomicolicos;
• C 40 - C 60 – ácidos nocardicos;
• C 60 - C 80 – ácidos micolicos.
São estes que tornam a molécula impermeável a vários compostos.
Não são por isso visíveis na coloração de Gram, mas têm uma parede do tipo
Gram + complexa. Coram pela coloração Ziehl Neelsen com Fucsina concentrada e a
quente, resistindo à descoloração pelo reagente de Ebner (álcool mais acido clorídrico),
por isso são designadas Bacilos Álcool Ácido Resistentes (BAAR).
O polissacarídeo específico dos BAAR é a arabinogalactomanana.
Autolisinas endógenas
São enzimas muralíticas (tipo amidase).
Localizam-se na membrana citoplasmática. Durante o crescimento bacteriano
têm uma acção lítica fisiológica (hidrolisam selectivamente peptidoglicano em
determinadas partes da parede bacteriana para a entrada de novas unidades de
peptidoglicano.
A sua acção é controlada pelos ácidos lipoteicóicos e fosfolípidos. Se falharem
os mecanismos de repressão ou forem activados pelas β-lactamases, ocorre lise
bacteriana – morte.
Parede celular de bactérias Gram –
Constituição química
• Lipossacarídeos (LPS);
• Fosfolípidos;
• Proteínas;
• Porinas;
• Proteínas OMpA;
• Autolisinas;
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• Peptidoglicano.
Lipopolissacarídeo (LPS)
• Molécula mais característica dos Gram -;
• Principal endotoxina;
• Molécula anfílica:
• Polissacarídeo – hidrófilo;
• Lípido A – hidrófobo.
• Localização – folheto externo da membrana exterior;
• Os LPS estão ligados à membrana exterior pelo lípido A, e o polissacarídeo
fica virado para o exterior da célula, sendo responsável pela carga negativa
da bactéria. Esta hidrofilia torna a molécula impermeável à penetração de
compostos hidrófobos;
• Os LPS são os Antigénios Somáticos dos bacilos Gram -;
• A fracção lípido A é responsável nas infecções clínicas por bacilos Gram -,
pelo aparecimento no hospedeiro de febre, inflamação e choque séptico;
• Os LPS estão mais ou menos indirectamente envolvidos na activação de:
•Macrófagos;
•Linfócitos B;
•Linfócitos T;
•Sistema complemento;
•Sistema de coagulação.
Fosfolípidos
Localizam-se na membrana exterior no folheto interno. Quando se deslocam
para o folheto externo tornam as bactérias permeáveis a componentes hidrófobos.
Proteínas
Localizam-se na membrana exterior.
Nos Gram – a concentração de proteínas na parede celular é elevada:
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• Lipoproteínas;
• São as mais abundantes;
• Encontram-se livres ou ligadas ao peptidoglicano;
• O seu principal papel é conferir estabilidade à bactéria, podendo esta
sobreviver sem ela, mas lisam facilmente por diversos agentes.
• Proteínas OMpA;
• Porinas – Proteínas que se organizam em poros ou canais onde passam
substâncias hidrofílicas (nutrientes para a bactéria)
• Proteínas de transporte específico de substâncias na difusão através da
membrana exterior;
• Autolisinas (enzimas hidrolíticas) do peptidoglicano;
• Nas bactérias Gram – não se conhece:
• Natureza;
• Localização;
• Mecanismos de regulação.
• Enzimas – fosfolipase A e proteases.
Esquema da arquitectura molecular da parede celular das bactérias Gram -
CONSTITUIÇÃO
Parede celular
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Bactérias Gram -
Por microscopia electrónica verifica-se que é constituída por duas membranas:
• Membrana exterior;
• Membrana interior – membrana citoplasmática.
O espaço entre elas denomina-se espaço periplasmático.
A camada rígida R é formada pelo peptidoglicano.
Espaço periplasmático
• Composição – polipeptidossacarídeos;
• Consistência – gel;
• Espaço vital para as células bacterianas;
• Reservatório de β-lactamases;
• Enzimas degradativas;
• Enzimas de transporte – açucares e aminoácidos;
• Quimioreceptores.
Funções de permeabilidade
• Folheto externo (membrana externa) – LPS;
• Folheto interno (membrana externa) – fosfolípidos.
• Os antibióticos atravessam a membrana externa por dois processos:
• Via hidrofílica – porinas;
• Via hidrofóbica – bicamada fosfolipídica.
Canais de porinas (transmembranares)
• φ variável entre as bactérias;
• Difusão passiva de compostos hidrófilos:
Membrana citoplasmática
• Bicamada – permeabilidade selectiva:
• Permeável e moléculas lipófilas;
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• Impermeável a moléculas hidrófobas.
• Funções de biossíntese – peptidoglicano;
• Funções energéticas – metabolismo oxidativo.
Enterobactérias
A camada fosfolipídica é impermeável.
A membrana citoplasmática envolve o citoplasma celular.
Composição química:
• Bicamada de fosfolípidos;
• Proteínas.
Archaeobactérias
Composição química:
• Fosfolípidos;
• Proteínas;
• Lípidos especiais.
Cápsula
Estrutura que envolve a parede celular em algumas bactérias.
Por microscopia electrónica (tinta da china), verifica-se um halo transparente
que envolve a bactéria.
Natureza – polissacarídeo
Retém a água e impede a dissecação da bactéria.
Confere grande virulência – cápsula antifagocitária.
Estruturas intracitoplasmáticas
• Visíveis em microscopia óptica;
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• Colorações especiais;
• Estão presentes em algumas espécies.
Granulações metacromáticas (grânulos de volutina)
• Coloração de Albert – azul de metileno;
• Constituem reserva de fósforo essencial para a síntese de ácidos
nucleicos e Fosfolípidos da bactéria.
Vacúolos de Gaz
• Para as bactérias fotossintéticas;
• Reserva de azoto;
• Permite flutuar na água.
Grânulos de glicogénio
• Coram pelo reagente de lugol;
• Polímeros de glucose;
• Reserva energética.
Grânulos de lípidos
• Coram pelo reagente de negrão de sudão;
• Reserva.
Ribossomas
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• Dispersos no citoplasma bacteriano;
• Local de síntese proteica;
• Constituídos por proteínas e ácidos nucleicos.
Endosporos
• Permitem a passagem da morfologia vegetativa em esporos;
• Impede a dissecação celular – sobrevivência da bactéria por centenas ou
milhares de anos;
• Forma resistência em condições hostis como:
• Radiações;
• Detergentes;
• Calor;
• Antibióticos.
• Os esporos preservam o material genético, em boas condições, dando
origem a células vegetativas – fenómeno de germinação.
Nucleóide
• Local da célula onde se localiza o material genético – DNA (material
nuclear);
• Ausência de membrana nuclear;
• Aparelho mitótico;
• Tem um único cromossoma;
• Visível em microscopia óptica com corantes básicos;
• O DNA cromossómico pode coexistir com o DNA plasmídico.
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Mobilidade bacteriana
Flagelos
• Órgão de locomoção;
• Natureza proteica;
• Visíveis em microscopia óptica com corantes;
• A sua localização na bactéria tem valor taxonómico:
• Bactérias com flagelo polar – monótrico;
• Flagelos polares – anfítrico;
• Tufo de flagelos em um ou nos dois pólos – lofotricos;
• Distribuem-se em toda a superfície – peritrica
Outras espécies movem-se por contractura de um conjunto de fibras situadas no
periplasma – filamento axial – com mobilidade deslizante.
Pilis e fimbrias (apêndices bacterianos endocelulares que se projectam para o exterior
das células)
Pilis
• Estrutura filamentosa de natureza proteica;
• Visível só na microscopia electrónica;
• Permite o contacto entre células diferentes – conjugação.
Fimbrias
• Estrutura filamentosa de natureza proteica;
• Visível no microscópio electrónico ou por microscopia óptica após
coloração;
• Órgão de aderência bacteriana a outras células;
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• Reconhece receptores celulares nas superfícies epiteliais.
MICROORGANISMOS EUCARIOTAS
MORFOLOGIA E ULTRAESTRUTURAS
EUCARIOTAS
Organismos unicelulares e pluricelulares que possuem membranas internas, com
núcleo individualizado – existem espaços físicos com funções diferentes.
ORGANISMOS EUCARIOTAS
Fungos, algas e protozoários (parasitas).
ORGANISMOS EUCARIOTAS MAIS SIMPLES
Leveduras.
ORGANISMOS EUCARIOTAS UNICELULARES COMPLEXOS
Protozoários.
ORGANISMOS UNICELULARES EUCARIOTAS
Constituem metade da biomassa da Terra porque:
• São pequenos;
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• Têm divisão rápida;
• Consomem poucos nutrientes;
• Adaptam-se facilmente a diversos ambientes
Sucesso na sua evolução
As células eucariotas são mais complexas que as células procariotas.
O genoma é maior e possui mecanismos de regulação e de expressão,
genotipicamente mais elaborados.
O DNA encontra-se num compartimento próprio delimitado por membranas – o
núcleo.
No citoplasma há vários constituintes (organitos) delimitados por membranas
com funções especiais.
CONSTITUIÇÃO
MEMBRANA CITOPLASMÁTICA
Constituição:
• Fosfolípidos;
• Proteínas;
• Esteróis (mamíferos – colesterol).
PAREDE CELULAR
• Eucariotas sem parede celular – mamíferos e alguns protozoários;
• Eucariotas com parede celular – algas, fungos e alguns protozoários.
Constituição:
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• Peptidoglicano – o glicano nos protozoários é substituído por
polissacarídeos.
NÚCLEO
Possui invólucro nuclear constituído por duas membranas:
• Membrana nuclear externa;
• Membrana nuclear interna.
As duas membranas delimitam um espaço designado por cisterna perinuclear,
à qual está intimamente ligado o retículo endoplasmático.
Através da cisterna há transporte para o citoplasma de:
• RNA mensageiro;
• RNA de transferência;
• RNA ribossomal.
Transporte em sentido oposto:
• Enzimas para replicação do DNA;
• Enzimas de síntese do RNA.
MOLÉCULA DO DNA
Macromolécula que cabe no núcleo “enrolada” e que contém o património
genético das células.
O DNA é “encapotado” por proteínas – histonas.
DNA + histonas cromatina nuclear.
Heterocromatina – periferia nuclear, zona menos densa.
Eucromatina – interior do núcleo, zona menos densa – concentra os genes
activos e inactivos.
NUCLÉOLO
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Estrutura nuclear em número variável.
Função – síntese de ribossomas.
RIBOSSOMAS
Síntese proteica
No citoplasma são utilizadas todas as moléculas que permitem à célula crescer,
multiplicar-se, diferenciar-se e comunicar com as outras num organismo pluricelular.
Estas moléculas com esta função são na sua maioria proteicas.
As proteínas cuja estrutura e consequente função é determinada pela sequencia
de pares do respectivo gene.
Cada gene que codifica uma proteína é inicialmente copiado no núcleo por um
mecanismo designado transcrição dando origem a uma molécula de RNA mensageiro
(RNAm).
Estas quando transportadas para o citoplasma associam-se a ribossomas. Aqui
ligam-se a outras moléculas adaptadoras e denominam-se RNA de transferência (RNAt).
A sequência de nucleótidos de cada RNAm é traduzida numa sequência de
aminoácidos (proteína).
As proteínas têm na célula eucariota múltiplas funções:
• Enzimas que caracterizam reacções específicas;
• Transportadores de outras moléculas.
Grande parte das proteínas é sintetizada nos ribossomas localizados no citosol –
espaço do citoplasma entre os organitos celulares.
Outras proteínas são sintetizadas no ribossoma do retículo endoplasmático
(proteínas das membranas celulares, proteínas lisossomais, proteínas de secreção).
Muitos dos antibióticos usados actuam ao nível do RNAr – interagem com os
mecanismos do ribossoma.
Muitos interferem nas células procariotas, mas não nas eucariotas.
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Mas nas células eucariotas os ribossomas das mitocôndrias são semelhantes às
procariotas o que leva à intoxicação da célula.
RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO
• Labirinto intracelular constituído por cisternas limitadas por membranas;
• Retículo endoplasmático rugoso – cisterna revestida de ribossomas;
• Retículo endoplasmático liso – não tem ribossomas.
Retículo endoplasmático rugoso
Há síntese de:
• Proteínas secretadas para o exterior da célula;
• Proteínas das membranas;
• Enzimas lisossómicas.
No lúmen do retículo as proteínas sintetizadas nos seus ribossomas ligam-se a
um açúcar e transformam-se em glicoproteínas.
Retículo endoplasmático liso
É muito abundante nas células hepáticas e musculares.
Nas células hepáticas acumula-se no retículo liso:
• Enzimas de síntese de lipoproteínas;
• Enzimas de degradação das drogas e de outras substâncias tóxicas;
• Enzimas de síntese de hormonas esteróides – a partir do colesterol;
• Síntese de proteínas de transporte;
• Proteínas de sequestro de Ca – abundantes no músculo.
APARELHO DE GOLGI
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• Constituído por cisternas e vesículas;
• Intimamente ligado ao retículo endoplasmático, recebendo deste as
proteínas de secreção, onde sofrem modificações químicas.
No aparelho de Golgi é onde se produzem as glicoproteínas.
VIA DA SECREÇÃO
Exocitose – as vesículas libertam proteínas para o meio extracelular.
Um mecanismo de secreção regula o armazenamento de proteínas em grânulos
de secreção cuja exocitose só ocorre por um sinal exterior (ingestão de alimento).
Permite a digestão das LDL, fracção de colesterol, libertando o colesterol usado
como nutriente celular.
LISOSSOMAS
“Sacos” intracelulares que armazenam enzimas hidrolíticas (enzimas
lisossomáticas), activas em meio ácido:
• Proteases;
• Lipases;
• Fosfolipases;
• Fosfatases.
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL EM MICROBIOLOGIA
PESQUISA DE MICROORGANISMSOS INFECCIOSOS
PRODUTOS BIOLÓGICOS
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• Expectoração;
• Urina;
• Fezes;
• Corrimento vaginal ou uretral;
• Líquidos: ascítico, pleural e cefaloraquídeo;
• Secreções nasais e laríngeas;
• Tecidos – sangue;
• Órgãos – biopsias.
Para o isolamento dos microorganismos é preciso respeitar:
• Regras de colheita;
• Transporte;
• Processamento da amostra
COLHEITAS DAS AMOSTRAS BIOLÓGICAS
Isolar o agente da infecção implica colher a amostra no órgão ou sistema
infectado:
• Infecção urinária – urina;
• Infecção respiratória – secreções respiratórias;
• Infecção gastrointestinal – fezes;
• Meningite – LCR;
• Infecção cutânea:
• Exsudado de vesícula;
• Raspado de lesão.
Na ausência de sintomatologia sugestiva do local – várias colheitas de sangue.
Num pico febril – hemocultura.
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O local para a colheita pode variar no decurso da doença dependendo do ciclo
biológico do agente infeccioso.
Para o isolamento do agente responsável, deve-se:
• Colher a amostra antes de iniciar terapêutica – para não inibir o
crescimento “in vitro”;
• Colher com material estéril (seringa, zaragatoa, bisturi) para um
contentor estéril.
Para evitar contaminação com microrganismos, quando se colhe uma amostra
estéril, normalmente, sangue, líquido pleural, LCR, antes deve-se desinfectar a pele – a
flora da pele contamina a amostra.
A colheita deve ser adequada e suficiente para a analise:
• Expectoração sem saliva;
• Pús do fundo do abcesso.
Por vezes são necessárias várias colheitas em períodos diversos porque o
microorganismos tem uma presença intermitente.
Para manter alguns microrganismos viáveis é necessário enviar a amostra
em meio de transporte adequado, que forneça:
• pH adequado;
• Proteínas;
• Atmosfera (CO2);
Enviar o produto em contentores rotulados (identificação do doente, serviço e
cama).
CONSERVAÇÃO DOS PRODUTOS BIOLÓGICOS
Após recepção são trabalhados o mais rapidamente possível ou conservados no
frigorífico a 4ºC, salvo raras excepções.
IDENTIFICAÇÃO DO AGENTE INFECCIOSO
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• Directamente no produto biológico:
• Pesquisa de antigénios específicos;
• Observação microscópica da morfologia microbiana – raramente é
possível.
• Após cultura do produto:
• Caracterização bioquímica;
• Caracterização antigénica;
• Caracterização do genótipo;
• Teste da sensibilidade aos antibióticos – ajuda na identificação.
DIAGNÓSTICO DIRECTO NO PRODUTO BIOLÓGICO
• Exame microscópico directo;
• Bactérias, parasitas, fungos em exame a fresco ou em exame corado
permite:
• Diagnóstico dos parasitas pelas características morfológicas;
• Raras vezes serve para os fungos;
• Impossível para quase todas as bactérias.
• Detecção dos antigénios específicos, evidenciados pelo uso de anticorpos
específicos:
• Imunofluorescência – anticorpos marcados com corante fluorescente
para observação com microscopia fluorescente;
• Métodos imunoenzimáticos (ELISA) – pesquisa com anticorpos por
reacção colorimétrica;
• Reacção de aglutinação em látex – partículas de látex revestidas
com anticorpos específicos.
• Detecção de sequências genómicas, com pesquisa de nucleótidos
específicos:
• A pesquisa é feita directamente no produto biológico, com
extracção do genoma (DNA) – hibridação;
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• Após a extracção do genoma no produto biológico, amplia-se o
número de sequências específicas utilizando uma enzima, para
aumentar a sensibilidade da técnica.
DIAGNÓSTICO APÓS CULTURA DO PRODUTO
• Caracterização bioquímica:
• PCR (Polymerase Chain Reaction) – efectua-se com sondas
(sequências de nucleótidos complementares das sequências
específicas que pesquisamos) – hibridação (complementaridade de
base nucleótida);
• Caracterização antigénica:
• Diferentes técnicas serológicas;
• Reacção antigénio/anticorpo;
• Caracterização genotípica:
• Classificar os microorganismos de acordo com diferentes padrões de
sequência genómica – técnica de hibridação.
• Teste de sensibilidade aos antibióticos (antibiograma) – conhecer o
padrão de sensibilidade à terapêutica é fundamental porque têm surgido
bactérias muito resistentes. Existem várias técnicas para efectuar o TSA.
Este baseia-se na capacidade de um microorganismos se multiplicar “in
vitro” na presença de diferentes antibióticos:
• Método de difusão:
• Meio sólido em placa de Petri;
• Semeia-se uma suspensão bacteriana;
• Discos de papel impregnados de antibióticos;
• Após a incubação à temperatura adequado, faz-se a leitura –
mediação do halo de inibição do crescimento em volta do disco em
mm;
• Resultado:
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•Resistente – não forma halo;
•Sensível – forma halo.
• Método de diluição:
• Meio de cultura semi-sólido ou líquido;
• Antibiótico em concentração crescente;
• Suspensão bacteriana sempre igual;
• Leitura e avaliação no caldo de turvação, podendo avaliar:
•CMI (concentração mínima inibitória) que impede o
crescimento bacteriano;
•CMB (concentração mínima que leva à morte de 99% das
bactérias).
Cultura e isolamento
Bactérias, fungos, parasitas e vírus:
• Meios adequados que permitam a multiplicação bacteriana;
• Vírus e microorganismos intracelulares são cultivados em células do
Homem, animais ou embriões;
• Os produtos biológicos são semeados directamente nos meios de cultura;
• Algumas amostras antes de serem cultivadas têm de ser tratadas;
• As culturas de produtos biológicos com flora residente exigem meios
selectivos que favoreçam o crescimento dos microorganismos
potencialmente patogénicos;
• Culturas incubadas – atmosfera, humidade e temperatura adequadas;
• O tempo de incubação depende da capacidade de replicação:
• Crescimento rápido – 18-24h;
• Crescimento fastidioso – 48-72h;
• Anaeróbios estritos – 48-96h.
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• Colónias bacterianas são a forma de detecção do crescimento de fungos
e bactérias;
• Efeito citopatogénico (ECP) – um vírus em crescimento é detectado por
alterações morfológicas nas células infectadas.
DETECÇÃO DA RESPOSTA IMUNE ESPECÍFICA CONTRA O AGENTE
INFECCIOSO
Quando não é possível identificar o microorganismo recorre-se à técnica
imunológica que permite avaliar a resposta imune do hospedeiro infectado.
Os microorganismos são nos hospedeiros antigénios e induzem a resposta
específica imunohumoral e celular.
Detecção da resposta imunohumoral
Diagnóstico serológico
Pesquisa de anticorpos ou antigénios específicos.
A resposta humoral está ligada à actividade dos linfócitos B, estas células
produzem anticorpos e estes ligam-se especificamente aos antigénios que o organismo
não reconhece como seus e quer eliminar.
Os anticorpos pesquisam-se no soro, plasma, urina e outros líquidos biológicos.
Quantificação dos anticorpos
É determinante para efectuar o diagnóstico. As reacções antigénio/anticorpo
fazem-se em diluições seriadas do soro do doente.
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Título de anticorpo – é o inverso da mais alta diluição do soro que dá ainda
resultado positivo.
Só por si a presença de anticorpos específicos não afirma que o doente está
infectado mas é necessário avaliar a evolução do título de anticorpos específicos:
• 1.ª colheita de soro na fase de doença;
• 2.ª colheita de soro na fase de convalescença.
Estas duas colheitas efectuam-se com pelo menos 15 dias de intervalo.
Os anticorpos específicos surgem entre a 1.ª e 2.ª semana, após o contacto com o
microorganismo.
Atingem posteriormente o valor máximo e descem para valores basais.
Interpretação das provas serológicas
• Limitações;
• Resultados positivos;
• Falsos resultados positivos.
Reacção cruzada – acontece com testes muito sensíveis mas pouco específicos,
porque os antigénios usados são comuns a outros microorganismos.
Os resultados positivos devem sempre que possível ser confirmados por técnicas
mais específicas.
Devemos titular os anticorpos e determinar a classe para avaliar a possibilidade
da relação com a infecção aguda.
Resultados negativos
Se há grande suspeita de infecção deve repetir-se a colheita mais tarde, pois a
primeira colheita pode ter sido precoce, não há ainda anticorpos detectáveis.
Há pessoas imunocomprometidas, isto é, não respondem às infecções com
produção de anticorpos a um nível detectável.
Exemplos de pessoas imunocomprometidas:
• Doentes do foro oncológico;
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• Diabéticos;
• Cirróticos;
• Insuficientes renais;
• Doentes muito idosos.
Isto são doentes que têm uma patologia de base muito debilitante.
Resposta imunocelular
Depende da actividade dos linfócitos T que são responsáveis pela resposta
inflamatória local – intradermo-reacção (tumefacção limitada, zona quente). É a reacção
à inoculação intradérmica de antigénios de agentes infecciosos.
A reacção positiva da intradermo-reacção serve quando positiva para dizer que já
houve contacto anterior com o agente infeccioso.
Pessoas anérgicas (reacção infectiva)
• Pessoas sem contacto com o agente;
• Pessoas no início da infecção;
• Pessoas imunocomprometidas.
Decisão diagnóstica
Há microorganismos que são sempre considerados agentes patogénicos. A sua
identificação leva sempre ao início da terapêutica.
A identificação de um microorganismo tem muito significado se a amostra é
colhida em local estéril habitualmente.
A identificação de microorganismos em locais onde existe flora comensal é
analisada com cuidado – resposta imune.
Deve ainda ter-se nesse caso em atenção o número de microorganismos e é de
considerar se for elevada a presença, e verificar se há reacção serológica compatível.
Uma subida de título do 1.º soro para o 2.º soro indica infecção recente. Uma
manutenção do título ou baixa – índice de que houve contacto com o microorganismo
no passado mas agora ele não é causa de doença.
Determinação da classe de anticorpos
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Deve determinar-se sempre que possível a classe dos anticorpos que reagem
especificamente com o antigénio:
• IgM – surgem no início da infecção e persistem até cerca de dois meses
(fase aguda da doença) – revelam um contacto recente com o antigénio
específico (por vezes até um ano);
• IgG – na convalescença as IgG substituem as IgM e podem ficar com os
títulos residuais toda a vida;
• IgA – surgem logo no início da doença e permitem a sua detecção em
diagnóstico precoce.
Métodos utilizados para a detecção de anticorpos e antigénios
• Reacções imunoenzimáticas;
• Reacções de imunofluorescência;
• Reacções de aglutinação;
• Reacções de inibição de hemaglutinação;
• Reacções de imunodifusão;
• Reacções de fixação do complemento;
• Reacções de seroneutralização.
VÍRUS
CARACTERÍSTICAS VIRAIS
• Dimensão submicroscópica;
• Intracelular obrigatório;
• Contém informação genética num único tipo de ácido nucleico, DNA e
RNA;
• Partículas formadas por estruturas proteicas repetitivas e regulares
encerrando o ácido nucleico viral;
• Não têm metabolismo;
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• Não produzem energia.
DEFINIÇÃO DE VÍRUS
Entidade potencialmente patogénica cujo genoma são ácidos nucleicos que se
replicam no interior de células vivas usando o equipamento de síntese celular e que
sintetizem partículas que transmitem o genoma a outras células.
DUAS PROPRIEDADES ESSENCIAIS AOS VÍRUS
• Têm material genético próprio;
• Utilizam o equipamento bioquímico da célula infectada – parasitismo
genético.
FASE EXTRACELULAR
Partículas inertes produzidas na célula sobre o comando de vírus que levam a
informação genética viral para outras células.
DEFINIÇÃO VIRAL NA PERSPECTIVA DE BIOLOGIA MOLECULAR
(Rybicki)
Elemento unitário de uma linhagem contínua com história evolutiva
individualizada.
CRITÉRIO DE VIDA
• Capacidade de replicação;
• Transmissão de informação genética;
• Evolução.
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Ambiguidade na definição de biologia molecular:
• Plasmídeo – replicação autónoma, codifica proteínas e são
transmissíveis. Ao contrário dos vírus não têm fase extracelular;
• Viróides – são patogénicos das plantas com uma molécula de RNA, sem
genes e sem capside;
• Priões:
• Não têm ácido nucleico;
• Proteínas molecular mutada que forma agregados infecciosos.
CICLO VIRAL
Ciclo infeccioso que inclui diversas fases:
 Interacção do vírus com a célula:
• Adsorção à membrana da célula;
• Penetração na célula.
Segue-se a esta fase inicial o elipse viral – não se consegue detectar o
vírus. Corresponde ao período de síntese dos componentes para formar novas
partículas viras (enzimas, ácidos nucleicos e proteínas).
 Fase de maturação:
• Detectam-se após novos vírus com produção exponencial que se vão
libertar na fase final – extrusão;
• Pode ocorrer a morte celular entre 6 e 48 horas.
Este ciclo que leva à produção de novos vírus e morte da célula é o ciclo
infeccioso completo – ciclo lítico ou produtivo. Ocorre nas células permissivas.
CICLO ABORTIVO
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• Quando o vírus não consegue expressar todas as funções necessárias à
síntese de novos vírus, chamam-se a estes vírus defectivos;
• As células não são permissivas – ocorre a síntese de alguns compostos
mas não há produção final de vírus infecciosos.
INFECÇÃO LATENTE
Quando o genoma viral fica na célula muito tempo mas não há formação de
novos vírus.
MORFOLOGIA
As partículas virais são constituídas por:
• Cápsula proteica – encerra o nucleóide;
• Nucleóide – é constituído pelo ácido nucleico e proteínas virais;
• Nucleocapside – capside mais nucleóide;
• Invólucro – reveste alguns derivados da membrana celular.
FORMA/ESTRUTURA/DIMENSÃO
• Esféricos, bastonete rígido, filamento flexível;
• Icosaédrica (vinte faces triangulares), helicoidal;
• 20-45nm.
CLASSIFICAÇÃO E TAXONOMIA
Principais critérios usados:
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• Tipo e estrutura do genoma:
• DNA e RNA;
• DNA de cadeia linear ou circular, de cadeia simples ou dupla;
• RNA de cadeia dupla ou simples. Se a cadeia é simples pode ter uma
sequência igual ao RNAm ou RNA complementar;
• Genoma segmentado – dividido em mais do que uma molécula.
• Estrutura – icosaédrica, helicoidal, mista, com ou sem invólucro;
• Tipo de hospedeiro – vertebrados; invertebrados, plantas, fungos ou
bactérias.
Para estabelecer a diferença entre género e espécie acrescentam-se mais critérios
aos anteriores:
• Número e tipo de proteínas;
• Estratégia de replicação viral;
• Processo de transcrição;
• Propriedades físico-químicas;
• Relações antigénicas.
A classificação actual abrange 3600 vírus que constituem 75 famílias.
CLASSIFICAÇÃO DE VÍRUS DE VERTEBRADOS
Genoma Morfologia Família Exemplo
DNA
Cadeia dupla linear
Cadeia mista
Icosaédrica com
invólucro
Icosaédrica sem
invólucro
Herpes viridae Herpes
simples
Poxviridae Varíola
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RNA
Cadeia simples RNAm
Icosaédrica Picornaviridae Poliomielite
Icosaédrica Flaviridae Febre amarela
Icosaédrica Togaviridae Rubéola
Cadeia segmentada Helicoidal Orthomyxovirida
e
Gripe
Cadeia não segmentada Helicoidal Paramyxoviridae Sarampo
RNA-DNA Icosaédrica Retroviridae HIV
PROCESSO DE PRODUÇÃO DE VÍRUS
Inclui diversas fases:
• Absorção:
• Adsorção do vírus (proteínas) aos receptores da membrana celular
(proteínas ou polissacarídeos);
• O tipo de receptor é factor muito importante na susceptibilidade da
célula à infecção;
• Alguns vírus têm grande especialidade de hospedeiros.
• Penetração:
• Translocação da partícula para o citoplasma da célula;
• Fusão do invólucro do vírus com a membrana celular;
• Endocitose por endossomas mediada por receptores.
• Descapsidação – perda da cápsula, pode acontecer no citoplasma ou no
núcleo celular e pode ocorrer logo depois da penetração;
• Fase sintética – fase de síntese de componentes virais (enzimas
reguladoras ou estruturais) e a replicação do genoma viral;
• Montagem e extrusão:
• Os componentes do vírus recém-sintetizados são montados em
partículas mais ou menos complexas;
• O local de replicação pode ser o citoplasma ou o núcleo;
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• Excepção para os retrovírus cujas partículas imaturas ficam junto da
membrana celular onde adquire o invólucro e sai da célula por
gemulação;
• Excepção para os herpes, vírus de replicação nuclear, a maturação
faz-se entre os dois folhetos da membrana nuclear. Os vírus são
posteriormente transportados para o exterior pelo retículo
endoplasmático sem entrar em contacto com o citoplasma. O
invólucro é de natureza nuclear.
ESTRATÉGIA DO GENOMA VIRAL
Vários tipos de vírus e diversos genomas implicam diversos mecanismos de
expressão de informação genética e replicação do genoma.
A replicação viral tem sem excepção uma via comum.
O RNAm é traduzido em proteínas pelo equipamento das células:
• Ribossomas;
• RNAt.
De acordo com esta via, Baltimore classificou-os em grupos de estratégia.
CLASSIFICAÇÃO DE BALTIMORE (vírus dos vertebrados)
• Grupo I – vírus de DNA de cadeia dupla de replicação nuclear ou
citoplasmática. O genoma viral é transcrito em RNAm por enzimas
celulares ou enzimas virais. Decorre em duas fases:
• 1.ª fase – o DNA é transcrito em RNAm precoce e este é traduzido em
DNA – é a polimerase que replica o DNA viral;
• 2.ª fase – novo RNAm dito tardio é traduzido em outras proteínas do
vírus.
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• Grupo II – vírus com DNA de cadeia simples. O genoma é convertido
numa molécula de cadeia dupla (forma replicativa) que serve de molde
para a transcrição do RNAm e replicação que como nos vírus do grupo I
dá-se com enzimas celulares;
• Grupo III – vírus com RNA de cadeia dupla. O RNA viral dentro do
nucleóide é transcrito em RNA+
por uma polimerase presente na capside
viral. O RNA+
serve de RNAm e serve de molde para a síntese de RNA
viral de cadeia dupla – RNA-
;
• Grupo IV – nos vírus RNA+
, o RNA viral pode ser usado como RNAm
que codifica e replica RNA viral;
• Grupo V – nos vírus RNA-
este é transcrito em RNA complementar que
serve de RNAm. As células não têm RNA polimerases que usam RNA
como molde. Uma enzima deste tipo – transcriptase – está presente no
próprio vírus, sintetiza o RNA+
que é transcrito em RNA complementar;
• Grupo VI – retrovírus. O RNA é transcrito numa molécula de DNA de
cadeia dupla por uma enzima presente no vírus – a retranscriptase. Este
DNA é replicado e transcrito em RNAm por enzimas celulares como se
fosse DNA celular. Proteínas do vírus modificam a transcrição com
produção de RNA+
, que é encapsidado como RNA viral;
• Grupo VII – vírus com DNA de cadeia dupla (vírus da hepatite B). Em
zonas do genoma a cadeia é simples, esta é preenchida por enzimas
celulares. Uma RNA polimerase celular transcreve esta cadeia reparada
em RNAm e em RNA que cobre todo o genoma. Este RNA+
é o molde
para a síntese de um híbrido RNA-DNA à custa de uma transcriptase
reversa e o híbrido é convertido em RNA viral.
VÍRUS DA HEPATITE B (HBV)
Grupo – hepadnavirus.
Tipo do genoma – DNA circular.
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ANTIGÉNIOS IMPORTANTES
• HBsAg – Ag de superfície do vírus;
• HBeAg – Ag do invólucro ou nucleocapside;
• HBcAg – Ag do core.
O vírus localiza-se no sangue e pode disseminar-se, por replicação no tecido
linfóide, fígado e sangue.
Incubação – 1-3 meses.
Quando aumenta a lesão hepática aparecem os sintomas clínicos.
MARCADORES DA HEPATITE B
• HBsAg – indica infectividade do sangue;
• HBsAc – Ac contra o Ag de superfície. Fornece imunidade, não está
presente nos indivíduos portadores. Imunidade após infecção ou após
vacinação. Nunca está presente nos portadores;
• HBeAg – Ag da nucleocapside. Indica transmissibilidades;
• HBeAc – Ac do Ag do invólucro. Indica baixa transmissibilidade;
• HBcAg – Ag do core;
• HBcAc – Ac do Ag do core, que aparece na fase inicial.
MARCADORES SEROLÓGICOS
 Seroconvenção:
• HBeAg – desaparece;
_________________________ V Curso de Licenciatura _______________________
___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________
62
Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________
__________________________________________________________ Microbiologia
• Anti-HBe – aparece;
indica
• Replicação viral – evolução para cura.
 Reactivação da infecção:
• HBeAg – reaparece;
• 95% dos casos de infecção HBV evoluem para cura, HBsAg e
HBeAg – desaparecem. Surgem estes Ac:
• Anti-HBc;
• Anti-HBe;
• Anti-HBs.
• 5% é infocrónica.
 Hepatite activa, estão presentes – fase aguda:
• HBsAg;
• IgM anti-HBc.
 Hepatite crónica – após 6 meses determinam-se:
• No soro:
• HBsAg;
• IgM anti-Hbc.
• Em biopsia hepática:
• HBeAg – hepatite crónica nativa;
• Anti-HBe – H.C. mutante.
 Cura, podem desaparecer passado meses:
• Anti-HBs;
• Anti-HBe.
Vacinados contra VHB
_________________________ V Curso de Licenciatura _______________________
___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________
63
Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________
__________________________________________________________ Microbiologia
Películas sintetizadas.
Ficam nos imunizados anti-HBs.
Recém-nascidos
Mãe com imunidade de infecção antiga.
RN apresenta durante meses, porque atravessam a placenta:
• Anti-HBs;
• Anti-HBe.
GRÁFICO DE SEROLOGIA E MARCADORES DA HEPATITE B
PROPRIEDADES BIOLÓGICAS DAS PRINCIPAIS CLASSES DE
IMUNOGLOBULINAS EM HUMANOS
_________________________ V Curso de Licenciatura _______________________
___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________
64
Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________
__________________________________________________________ Microbiologia
Designação IgG IgA IgM IgD IgE
Principais características
Ig interna
mais
abundante
Protecção
das
superfícies
externas
Muito
eficiente na
bacteriemia
Principalment
e actua como
receptor nos
linfócitos
Inicia a inflamação,
elevada nas infecções
parasitárias, causa
síndromes alérgicas
Ligação ao antigénio ++ ++ ++ ++ ++
Fixação do complemento + - +++ + -
Passagem transplacentária ++ - - - -
Fixação a mastócitos e
basófilos homólogos
- - - - ++
Ligação a macrófagos e
polimorfos
+++ + - - +
RICKTESIAS
MORFOLOGIA
• Bacilos Gram -:
• Coram fracamente pelo Gram;
• Corante mais usado – Gimenez. Adquirem cor vermelha – visíveis no
microscópio óptico.
• Formas cocobacilares;
• Tamanho variável das diferentes estirpes – mais pequenas que as
restantes bactérias;
• Aeróbias obrigatórias;
• Imóveis;
• Crescimento lento – bactérias fastidiosas;
• Têm DNA e RNA;
• Parede celular bacteriana;
_________________________ V Curso de Licenciatura _______________________
___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________
65
Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________
__________________________________________________________ Microbiologia
• Equipamento enzimático complexo;
• Reproduzem-se por divisão binária;
• Organização celular – procariota;
• Intracelulares;
• Sensíveis a antibióticos de largo espectro – Cloranfenicol e Tetraciclina.
Morfologicamente e fisiologicamente as Ricktesias ficam entre as bactérias e os
vírus.
Desenvolvem-se obrigatoriamente em tecidos e células embrionárias –
citoplasma e por vezes no núcleo da célula do hospedeiro:
• Ciclo de vida;
• Transmissão.
RESERVATÓRIO
• Pequenos roedores – ratos caseiros;
• Pulgas, piolhos, carraças – artrópodes;
• Só acidentalmente no Homem e outros vertebrados – caprinos, outros.
CADEIA DE TRANSMISSÃO
• Multiplica-se no artrópode – reservatório;
• Transmite-se ao Homem ou a outros vertebrados por picada do artrópode
infectado – carraça, piolho, pulga;
• No caso da Coxiella burnetii o hospedeiro acidental pode ser infectado
directamente
Após multiplicação no interior da célula reservatório (infectada) as enzimas da
Ricktesia promovem a lise da parede celular do hospedeiro.
Quando libertas (vida extracelular) perdem rapidamente o poder infectante.
_________________________ V Curso de Licenciatura _______________________
___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________
66
Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________
__________________________________________________________ Microbiologia
Não sobrevivem à dissecação. Excepto Coxiella burnetii que é muito resistente –
assim pode haver contágio directo com o Homem. Esta não necessita de vectores –
artrópodes.
RESITÊNCIAAOS DESINFECTANTES
Com a Coxiella burnetii, a mais resistente, deve usar-se:
• Formaldeido 5%;
• Água oxigenada 5%.
ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO
• Difícil isolamento;
• Perigosa manipulação – câmara de classe III – perigo de transmissão
através de aerossóis infectados;
• Cultura em tecidos ou embriões – laboratório especializado.
SEROLOGIA – DIAGNÓSTICO PRESUNTIVO (rotina laboratorial)
Reacção de Weil Felix que utiliza antigénios homólogos da estirpe – Proteus
vulgaris – OX – 19; OX – 2; OX – K:
• Aglutinam com os anticorpos produzidos contra a Ricktesia (dos grupos
do Tifo e Febre);
• Reacção sempre negativa para a Coxiella burnetii – agente da febre;
INCUBAÇÃO DAS DOENÇAS
Agrupam-se de acordo com a morfologia, cultura e tipo de infecção. Provocam:
• Febre;
• Mialgias; Toxinas da
• Lesão cardíaca; Ricktesia
• Hemorragia.
_________________________ V Curso de Licenciatura _______________________
___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________
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Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________
__________________________________________________________ Microbiologia
RELAÇÕES PARASITA-HOSPEDEIRO
Parasitismo – se o microorganismo beneficia na relação com o hospedeiro em
detrimento deste.
Comensalismo – quando um é beneficiado e o outro não é prejudicado;
Mutualismo – quando ambos beneficiam.
equilíbrio
Floram comensal hospedeiro
Flora comensal – microorganismos residentes num local do hospedeiro sem
provocar doença – adaptação.
O hospedeiro fornece condições de residência aos microorganismos no local:
• Nutrientes;
• pH;
• Humidade;
• Temperatura.
adequadas ao crescimento bacteriano.
ZONAS DE COLONIZAÇÃO
• Cavidade bucal;
• Tracto gastrointestinal;
• Tracto respiratório superior – fossas nasais e nasofaringe;
• Pele.
_________________________ V Curso de Licenciatura _______________________
___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________
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  • 1. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia APONTAMENTOS PERGUNTAS MAIS IMPORTANTES 1. Algumas descobertas são marcos na história da microbiologia. Cite exemplos. • Anthony van Lunwenhok – foi o pai da microbiologia, já que foi ele o responsável pela construção do instrumento – o microscópio – que tornou possível a observação de seres minúsculos. Os quais observou, descreveu e desenhou designando-os por “animáculos”; • Lazarro Spallanzani – deu o primeiro passo para a destruição do conceito de abiogénese (“geração espontânea”); revelou que carne quando fervida não se alterava já que o calor destruía o microorganismo; • Louis Pasteur – veio demonstrar com os seus frascos com pescoço de cisne, que não existia “geração espontânea”, mas sim que os microorganismos provinham de outros pré-existentes nas poeiras do ar – teoria da biogénese; descobre que existem microorganismos que necessitam de O2 para viver (bactérias anaeróbias); inventa um processo de esterilização dos alimentos – pasteurização; isolou o parasita responsável pela doença do bicho-da-seda e demonstrou a possibilidade de eliminar a doença; descobriu que a acção das bactérias altera a composição químicas dos produtos dos caldos, através da fermentação (transformam os hidratos de carbono em álcool e ácidos orgânicos) e da putrefacção (decomposição das proteínas, com formação de produtos de cheiro nauseabundo); demonstra serem as fermentações o resultado de actividades microbianas; • Conh e Tyndal – descobriram que existem formas de vida resistentes ao calor (esporos termorresistentes) e dão nascimento a um novo método de esterilização – tindalização; • Joseph Lister – desenvolve trabalhos sobre antissepsia e descobre que os vapores de ácido carbónico reduzem a infecção no pós-operatório; _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 1
  • 2. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia • Robert Koch – fez a 1.ª demonstração directa do papel desempenado por uma bactéria no desenvolvimento de uma doença – o Bacillus anthracis – e a doença que este agente produzia (carbúnculo); isola o Mycobacterium tuberculosis (bacilo de Koch), agente causador da tuberculose; define um conjunto de princípios relacionados com o que estudou – Postulados de Koch: • Um microorganismo específico está sempre associado a um caso de doença; • O microorganismo suspeito deve ser isolado e capaz de crescer em laboratório; • A inoculação da cultura deve ser capaz de produzir a mesma doença num animal susceptível; • O mesmo microorganismo deve ser isolado a partir do animal doente; Desvantagens dos Postulados de Koch: • Há microorganismos que não crescem em meios de cultura; • Presentemente conhecem-se microorganismos que apenas são patogénicos para o Homem, não produzindo doença em animais – vírus da hepatite C, Treponema pallidum, Mycobacterium leprae; • James Watson – descobre a es6rutura do DNA; • Alexander Fleming – descobriu a penicilina e a lisozina. 2. Cite as principais diferenças entre procarióticas e eucarióticas e cite exemplos de uns e de outros. Um ser eucariota apresenta nas suas células um núcleo individualizado envolvido por uma membrana nuclear, onde se encontra inserido o DNA. No citoplasma existem vários organelos – ribossomas, cloroplastos, mitocôndrias, retículo endoplasmático, aparelho de Golgi, vacúolos, flagelos e citoesqueleto – que desempenham funções específicas. As células eucarióticas são maiores e mais complexas, o seu genoma é maior e possuem mecanismos muito mais elaborados que a células procarióticas. Exemplos: animais, plantas, fungos, algas e protozoários. _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 2
  • 3. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia Os procariotas apresentam células sem núcleo individualizado e estão organizadas em ribossomas e parede celular. Exemplos: eubactérias e arqueobactérias. 3. As bactérias podem ser classificadas em Gram positivas e Gram negativas de acordo com a parede celular. Explique. A parede celular confere protecção mecânica (impede a lise da célula bacteriana em meio hipotónico), confere forma à bactéria e determina o comportamento ao Gram. O diferente comportamento das bactérias ao Gram deve-se ao facto dos dois grupos bacterianos (Gram + e Gram -) apresentarem parede celular química e estruturalmente diferente. A parede celular das bactérias Gram + não apresenta lípidos (excepto nos géneros Mycobacterium, Corynebacterium e Nocardia) e apresenta elevada concentração de peptidoglicano (50-90% do peso da parede). Enquanto que a parede das bactérias Gram – apresenta um elevado teor em lípidos e baixa concentração de peptidoglicano (10% do peso da parede). 3.1 Outros métodos de coloração podem ser utilizados, Cite um exemplo e explique. Há bactérias que não são visíveis na coloração de Gram, apesar de terem uma parede do tipo gram + complexa. Por isso recorre-se a outros processos de coloração, por exemplo, Ziehl-Neelsen. Os BAAR após a coloração com fucsina de Ziehl, concentrada e a quente, resistem à descoloração com o soluto de Ebner (álcool mais ácido clorídrico). 4. Quais as funções das seguintes estruturas: a) Retículo endoplasmático. É constituído por um labirinto intracelular de cisterna, limitado por membranas. Divide-se em retículo endoplasmático rugoso (cisterna revestida por ribossomas) e retículo endoplasmático liso (não tem ribossomas). O retículo endoplasmático rugoso é o responsável pela síntese de todas as proteínas secretadas para o exterior das células, das proteínas das membranas e das enzimas lisossómicas. O retículo endoplasmático liso é muito abundante nas células hepáticas e musculares. Tem como funções a biossíntese de lípidos, a degradação de drogas e compostos tóxicos (desintoxicação) e o armazenamento de cálcio. _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 3
  • 4. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia b) Aparelho de Golgi. É constituído por um conjunto de cisternas e vesículas que modificam, acondicionam e distribuem as proteínas e lípidos produzidos pelo retículo endoplasmático. É no aparelho de Golgi que se produzem as glicoproteínas. c) Pili. Os pili são estruturas filamentosas de natureza proteica, só visíveis na microscopia electrónica e que permitem o contacto entre bactérias de sexo diferente. 5. As bactérias são identificadas por características morfológicas e propriedades bioquímicas. Cite algumas. Em relação às propriedades morfológicas podemos dividir as bactérias em cocos e bacilos. Podemos ainda verificar a presença/ausência de cápsula. Em relação às propriedades químicas temos a classificação pela composição química da membrana (colorações) 6. Em que característica se baseia a classificação dos vírus? O vírus é uma entidade potencialmente patogénica cujo genoma são ácidos nucleicos que se replicam no interior de células vivas usando o equipamento de síntese celular e que sintetizam partículas que transmitem o genoma a outras células. Os principais critérios usados na classificação de vírus são: • Tipo e estrutura do genoma – com DNA ou RNA; DNA de cadeia linear ou circular, de cadeia simples ou dupla; RNA de cadeia dupla ou simples; • Estrutura – icosaédrica, helicoidal ou mista; • Tipo de hospedeiro – vertebrado, invertebrado, plantas, fungos ou bactérias. 7. Quais são as fases do ciclo viral? O ciclo viral é um ciclo infeccioso que inclui diversas fases distintas: • Absorção – o vírus adsorve-se aos receptores da membrana da célula; • Penetração – translocação da partícula para o interior da célula; • Descapsidação – perda da cápsula no citoplasma ou no núcleo celular; _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 4
  • 5. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia • Fase sintética – síntese dos componentes virais e replicação do genoma viral; • Montagem e extrusão – os componentes dos vírus são montados em partículas mais ou menos complexas; são posteriormente transportados para o exterior sem entrar em contacto com o citoplasma. 7.1 Quais os marcadores de infecção no VHB? • HBsAg – indica infectividade do sangue; • HBsAc – anticorpo contra o antigénio de superfície; fornece imunidade, não está presente nos indivíduos portadores; imunidade após infecção ou após vacinação; • HBeAg – antigénio da nucleocopside; indica transmissibilidades; • HBeAc – anticorpo do HbeAg; indica baixa transmissibilidade; • HBcAg – antigénio do core; • HBcAc – anticorpo do antigénio do core; aparece na fase inicial. 8. Cite três vantagens da flora normal para o hospedeiro. A flora comensal serve de barreira de defesa contra as infecções. Os microorganismos da flora comensal impedem a colonização da sua área de residência por outras bactérias, mantendo assim o equilíbrio entre as diversas populações. A flora comensal do intestino grosso ajuda à fermentação doa alimentos. 9. A disseminação da flora normal para locais estéreis do organismo pode ocorrer em várias situações. Cite três exemplos. Esta disseminação pode ocorrer por alteração do pH, por desidratação, por má higiene e devido a defeitos congénitos. 10. Cite quatro estratégias adoptadas pelos microorganismos para maximizar a sua sobrevivência no hospedeiro. Para escaparem aos mecanismos de defesa do hospedeiro, os microorganismos aderem ao hospedeiro, disseminam (invadem) para outros locais, mantém-se no local da primeira interacção com o hospedeiro pois há características favoráveis ao seu desenvolvimento, induzem lesão ou utilizam toxinas para facilitar o seu ciclo de vida. _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 5
  • 6. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia 11. A densidade dos microorganismos no trato digestivo aumenta do estômago até ao intestino grosso. Explique. O tracto gastrointestinal é onde reside a maioria da flora do organismo. No estômago há pouca flora devido à existência de pH muito ácido (suco gástrico). No intestino delgado também há pouca flora devido à acção conjunta do suco gástrico, da bílis e do suco pancreático. No entanto é no intestino grosso que reside a maior parte da flora do organismo, já que aí o pH é mais alcalino devido à fermentação dos alimentos, o que permite que cresçam abundantemente bactérias. 12. O que entende por sistema de defesa inato. Os mecanismos de defesa inatos (imunidade inata) estão sempre presentes num indivíduo saudável e não são específicos, são efectivos contra a maioria dos microorganismos e constituem a 1.ª linha de defesa do organismo. É o caso das barreiras físicas (pele), as células fagocitárias ou as moléculas com actividade antimicrobiana. 13. Quais são as vantagens da existência de diferentes classes de imunoglobulinas? Podemos classificar os anticorpos (imunoglobulinas) em: • IgA – surgem na fase aguda da doença e a sua detecção permite um diagnóstico mais precoce; • IgM – surgem no início da resposta humural e perduram até ao fim da fase aguda da doença; revelam um contacto recente com o antigénio específico; • IgG – na convalescença as IgG substituem as IgM e podem ficar com os títulos residuais toda a vida. 14. Os plasmídeos podem conter genes de virulência. Diga o que sabe. As bactérias têm na sua constituição plasmídeos. São sequências de DNA, onde estão codificadas as resistências às drogas, a síntese de enzimas que originam a resistência à droga. Assim possuem resistências cromossómicas (naturais) e resistências mediadas por plasmídeos (adquiridas). _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 6
  • 7. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia Por exemplo, as enzimas β-lactamases são codificadas por plasmídeos, e vão inibir a acção dos fármacos antibióticos do grupo β-lactâmicos, utilizados para destruir todas as bactérias. 15. O que são doenças transmitidas por vectores? Dê exemplos. São doenças transmitidas por artrópodes (moscas, mosquitos, carraças), que podem actuar como reservatórios (se há multiplicação do agente, o que é essencial ao ciclo de vida do parasita) ou serem passivos (apenas transmitem). Por exemplo a transmissão das Ricktesias. 16. Defina infecção hospitalar. Infecção hospitalar é a infecção adquirida pela passagem ou permanência no Hospital, e que pode infectar tanto os utentes como os profissionais de saúde. As vias de transmissão são: • Doente  Doente; • Meio  Doente; • Material  Doente; • Profissional de saúde  doente; • Comunidade  Doente; • Material  Profissional de saúde; • Meio  Profissional de saúde. 17. Defina esterilização. Esterilização é o processo mediante o qual todas as formas de vida – bactérias, fungos e vírus – contidos em líquidos, utensílios, instrumentos e substâncias são completamente destruídos. 17.1 Cite limitações no uso do óxido de etileno. Vantagens: • Não detiora os objectos cortantes nem os termo-sensíveis; • Eficaz sobre bactérias e esporos; • Tem grande capacidade de penetração. _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 7
  • 8. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia Desvantagens: • Ciclos de esterilização longos; • Deixa resíduos tóxicos em alguns materiais; • Necessita de arejamento; • Mais caro que os outros métodos; • Instalação perigosa. 18. Defina desinfecção. É o processo físico ou químico, pelo qual os agentes patogénicos ou micróbios causadores da doença são destruídos. 18.1 Quais os critérios usados na escolha de um antisséptico? Antissépticos são substâncias químicas que actuando sobre os tecidos vivos destroem os microorganismos ou impedem o seu crescimento. Os critérios usados na sua escolha são: • Factores físicos – ter em conta o pH, a temperatura e a luz do local; • Factores químicos – não devemos juntar substâncias desconhecidas; • Factores microbiológicos – a eficácia depende do número e da natureza dos gérmens. 19. A que normas gerais devem obedecer a colheita e transporte de produtos biológicos para a cultura de microorganismos? A colheita deve obedecer às seguintes normas: • O produto biológico deve ser colhido no local que, no momento da infecção, oferece maior possibilidade de se isolar o agente infeccioso; • A colheita deve ser feita antes do início de cada terapêutica; • A colheita deve ser feita com material estéril (seringa, agulha, bisturi) e para contentor estéril (tubo de ensaio, frasco); • A colheita deve ser adequada e suficiente (expectoração sem saliva); • Os produtos devem ser colhidos para um meio de transporte que mantenha a viabilidade do microorganismo. _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 8
  • 9. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia 20. Defina microbiologia e microorganismo. Microbiologia é a ciência que estuda os seres vivos de dimensões microscópicas bem como outros que têm durante a sua evolução ovos ou formas larvares microscópicas. A microbiologia inclui áreas como a bacteriologia, a virologia, a parasitologia e a micologia. Microorganismo é um organismo, vegetal ou animal, com dimensões microscópicas. 21. O que é uma estirpe? Estirpe são descendentes de uma colónia pura. 22. Em que consiste a técnica de coloração de Gram? Consiste em: • Corante primário (Violeta Cristal); • Mordente (Soluto de Lugol); • Descorante (Etanol); • Corante de contraste (Fucsina básica). As bactérias Gram + fixam o corante primário (Violeta de Cristal) adquirindo a cor arroxeada. As bactérias Gram – fixam o corante de contraste (Fucsina básica) corando de vermelho. 23. O que é o peptidoglicano? É um macropolímero em forma de saco, presente em todas as paredes celulares bacterianas, rígido e insolúvel em água. É constituído por 2 a.a. a N-acetilglucosamina (NAG) e o ácido N-acetilmurâmico (NAM). 24. Como é constituída a parede celular das bactérias Gram +? É constituída por peptidoglicano, ácidos teicóicos e teicurónicos. Estes ácidos estão associados ao peptidoglicano mas não conferem rigidez. _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 9
  • 10. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia 25. Caracterize os ácidos teicóicos e teicurónicos. Os ácidos teicóicos contém vestígios de glicerol e ribitol, são solúveis na água e localizam-se em toda a espessura da membrana. Os ácidos teicurónicos (as moléculas) substituem os ácidos teicóicos quando as bactérias crescem em meios pobres em fósforo por conterem galactosamina mais ácido glucónico. Tanto os ácidos teicóicos, como os ácidos teicurónicos são responsáveis pela carga – da superfície dos bacilos Gram +, atraem Mg2+ e Ca2+ e reduzem as repressões electrostáticas no polímero conferindo estabilidade estrutural. 26. O que são autolisinas? São enzimas que actuam durante o crescimento bacteriano (enzimas hidrolíticas dos peptidoglicanos), ligando a parede bacteriana para que a bactéria possa crescer. Se houver algum descontrolo dessa lise leva a bactéria ao suicídio. 27. Qual a composição química da parede celular das bactérias Gram -? É constituída por lipopolissacarídeos (LPS), fosfolípidos, proteínas, porinas, autolisinas e peptidoglicano. 28. Como actuam os antibióticos sobre a membrana exterior das bactérias? Os antibióticos atravessam a membrana exterior das bactérias por 2 processos: via hidrofílica (através de porinas) e via hidrofóbica (através da bicamada fosfolipídica). 29. O que são as cápsulas? São estruturas que envolvem a parede celular de algumas bactérias, retém água e impedem a dissecação da bactéria, Conferem grande virulência (cápsula antifagocitária). 30. Caracterize as seguintes estruturas intracitoplasmáticas: _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 10
  • 11. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia • Granulações metacromáticas – constituem reserva de fósforo essencial para a síntese de ácidos nucleicos e fosfolípidos da bactéria; estão presentes no agente da difteria e podem visualizar-se pela coloração de Albert; • Vacúolos de gás – estão presentes em arqueobactérias e bactérias fotossintéticas; funcionam como reservatório de azoto, permitindo às bactérias flutuar na água; • Grânulos de glicogénio – são polímeros de glucose; funcionam como material de reserva energética e coram pelo reagente de Lugol; • Grânulos de lípidos – funcionam como material energético de reserva e coram com o negro de Sudão; • Ribossomas – encontram-se dispersos no citoplasma bacteriano; são muito abundantes; são os locais de síntese proteica e são constituídos por proteínas e ácidos nucleicos; • Endosporos – permitem a modificação de células vegetativas em esporos; impedem a dissecação celular, formam resistência em condições hostis tais como radiações, detergentes, calor, antibióticos; preservam o material genético em boas condições dando origem a células vegetativas. • Nucleóide – local da célula onde se localiza o material genético – DNA; não possui membrana nuclear nem aparelho mitótico e funciona como um só cromossoma; é visível com corantes básicos e o DNA plasmídico pode coexistir com o DNA cromossómico, na mesma célula. 31. O que são os flagelos? São órgãos de locomoção, de natureza proteica e visíveis em microscopia óptica com corantes. 32. O que são as fimbrias? _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 11
  • 12. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia São estruturas filamentosas de natureza proteica, visíveis após coloração específica e que funcionam como órgão de aderência bacteriana a outras células, já que contém a.a. apolares que lhes confere propriedades hidrófobas. 33. O que distingue a membrana externa da parede celular da membrana interior (citoplasmática), nas bactérias Gram -? O que distingue uma da outra é o facto da membrana externa ser constituída por 2 folhetos: folheto interno e folheto externo. O folheto externo é rico em lipopolissacarídeos (LPS) que são uma molécula permeável a compostos hidrofóbicos. O folheto interno é rico em fosfolípidos. 34. Caracterize os seguintes organelos da célula eucariótica: • Membrana plasmática – é capaz de isolar proteínas e ácidos nucleicos do meio externo; é constituída por: • Fosfolípidos, responsáveis pelo tal isolamento; • Proteínas, que asseguram as permutas com o meio exterior; • Esteróis, colesterol nos mamíferos e ergosterol nos fungos; • Parede celular – é um invólucro protector que está ausente nos mamíferos e em alguns protozoários e que se encontra nas células das algas, fungos e alguns protozoários; é constituída por polissacarídeos (ao contrário da célula procariótica que é constituída por peptidoglicano); • Núcleo – possui um invólucro nuclear constituído por 2 membranas: a membrana nuclear interna e a membrana nuclear externa; Estas 2 membranas delimitam a chamada cisterna perinuclear; através da cisterna há transporte de DNA, RNAt e RNAr para o citoplasma e transporte de enzimas, para replicação de DNA e síntese de RNA, do citoplasma para o núcleo; no interior do núcleo encontra-se a informação genética da célula; • Nucléolo – estrutura nuclear em número muito variável, cuja função é a síntese de ribossomas; _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 12
  • 13. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia • Ribossomas – são constituídos por 2 subunidades: grande unidade e pequena unidade; cada uma das quais é constituída por moléculas de RNAr; o ribossoma é o local onde ocorre a síntese proteica e pode encontrar-se livre no citoplasma ou associado ao retículo endoplasmático rugoso; • Retículo endoplasmático – é constituído por um labirinto intracelular de cisterna, limitado por membranas; divide-se em retículo endoplasmático rugoso (cisterna revestida por ribossomas) e retículo endoplasmático liso (não tem ribossomas); o retículo endoplasmático rugoso é o responsável pela síntese de todas as proteínas secretadas para o exterior das células, das proteínas das membranas e das enzimas lisossómicas; o retículo endoplasmático liso é muito abundante nas células hepáticas e musculares. Tem como funções a biossíntese de lípidos, a degradação de drogas e compostos tóxicos (desintoxicação) e o armazenamento de cálcio; • Aparelho de Golgi – é constituído por um conjunto de cisternas e vesículas que modificam, acondicionam e distribuem as proteínas e lípidos produzidos pelo retículo endoplasmático; é no aparelho de Golgi que se produzem as glicoproteínas; • Lisossomas – são “sacos intracelulares” que armazenam enzimas hidrolíticas capazes de digerir todas as macromoléculas da célula; têm como funções: • Digerir moléculas vindas do exterior (endocitose); • Destruição de componentes celulares obsoletos (autofagia); • Degradação de microorganismos ou partículas nocivas à célula (fagocitose); • Mitocôndrias – fornecem à célula a energia necessária para todas as reacções do metabolismo; têm como função produzir ATP a partir de energia armazenada nos nutrientes orgânicos; • Peroxissomas – são sáculos envolvidos por membranas que contém enzimas que digerem ácidos gordos e a.a., e enzimas que catalisam a degradação do peróxido de hidrogénio; a sua função é, pois, a β-oxidação de ácidos gordos. _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 13
  • 14. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia • Citoesqueleto – é a estrutura responsável pela plasticidade, flexibilidade e motilidade das células eucarióticas; desempenha o papel de “ossos” e “músculos” da célula; é constituído por 3 grandes tipos de proteínas: 35. Quais os produtos biológicos que podemos usar para análise? Podemos utilizar: • Expectoração; • Urina; • Fezes; • Corrimento vaginal ou uretral; • Líquidos – ascítico, pleural e cafalorraquídeo; • Secreções – nasais e faringeas; • Sangue; • Órgãos – biópsias. 36. O que é, e para que serve um meio de transporte? É o recipiente onde se colocam as amostras biológicas com suspeita de que s agentes infecciosos resistam mal fora do hospedeiro. Os meios de transporte servem para assegurar a sobrevivência desses microorganismos porque fornecem-lhes condições de pH, concentração proteica e atmosféricas (CO2 e O2) ideais para manterem a sua viabilidade. 37. Como se pode identificar o agente infeccioso? O agente infeccioso pode detectar-se: • Directamente no produto biológico – detecção de antigénios e de sequências genómicas; • Após cultura do produto – caracterização bioquímica, antigénica, genotípica e teste de sensibilidade aos antibióticos. 38. Quais são as técnicas utilizadas para a detecção directa de um microorganismo num produto biológico? Podemos utilizar as seguintes técnicas: _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 14
  • 15. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia • Exame microscópico directo; • Detecção de antigénios específicos – evidenciados pelo uso de anticorpos específicos; • Detecção de sequências genómicas – com pesquisa de sequências de nucleótidos específicos. 39. Onde é feita a cultura de bactérias, vírus, fungos e parasitas “in vitro”? As bactérias, fungos e parasitas têm meios de cultura adequados que tornam possível a sua multiplicação. Os vírus e microorganismos intracelulares são cultivados em células do Homem, de animais ou até de ovos embrionados, pois exigem um suporte celular para se multiplicarem. 40. Como se detecta o crescimento das bactérias, vírus, fungos e parasitas nas culturas? O crescimento das bactérias, fungos e parasitas é detectado pelas colónias bacterianas. O crescimento dos vírus é detectado pelo efeito citopatogénico (ECP), ou por técnicas alternativas (hemadsorção ou hemaglutinação). 41. O que são culturas incubadas? São culturas que têm temperatura, humidade e atmosfera adequadas ao desenvolvimento. 42. Como é feita a caracterização e identificação do microorganismo isolado? A caracterização e identificação do microorganismo isolado é feita por: • Caracterização morfológica – utiliza-se a técnica de coloração de Gram+; • Caracterização bioquímica – reconhecimento da presença de enzimas e produtos dos metabolismos; utiliza-se para bactérias e fungos; • Caracterização antigénica – diferentes técnicas serológicas; • Caracterização genotípica. 43. Qual o tipo de crescimento que podem apresentar os microorganismos? _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 15
  • 16. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia • Crescimento rápido – 18-24h; • Crescimento fastidioso – mais de 24h. 44. Depois de cultivados os microorganismos o que se faz? Após a cultura do microorganismo é feita a sua identificação através do teste de sensibilidade aos antibióticos (TSA) ou antibiograma. O TSA baseia-se na capacidade de um microorganismo se multiplicar “in vitro” na presença de diferentes antibióticos. Para efectuar o TSA podemos utilizar 2 métodos: método de diluição e método de difusão. 45. Caracterize os métodos de diluição e de difusão. • Método de diluição – consiste em “semear” uma suspensão bacteriana num meio de cultura sólido ou líquido com um antibiótico em concentração crescente; após incubação efectua-se a leitura e avaliação no caldo de turvação; podemos assim avaliar a CMI (concentração mínima inibitória) que inibe o crescimento bacteriano e a CMB (concentração mínima bactericida) que leva à morte de 99,9% das bactérias; • Método de difusão – consiste em utilizar um meio sólido em placa de Petri no qual se semeia uma suspensão bacteriana; na superfície do meio solido colocam-se discos de papel impregnados de vários antibióticos; após incubação faz-se a leitura e avaliação do halo de inibição do crescimento em volta do disco; caso forma halo diz-se que a bactéria é sensível (S) ao antibiótico, se não formar halo diz-se que é resistente (R) ao antibiótico. 46. Caracterize o diagnóstico indirecto. Numa fase avançada da doença nem sempre é possível isolar e identificar o agente da infecção, pois a resposta imune do hospedeiro já o eliminou. _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 16
  • 17. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia Vamos então pesquisar, no hospedeiro, anticorpos específicos contra o microorganismo que provocou a doença ou pesquisar antigénios específicos do microorganismo. 47. Caracterize a resposta imune humural. Está ligada à actividade dos linfócitos B. Estas células produzem anticorpos e estes ligam-se especificamente aos antigénios que o organismo reconheceu com os seus e quer eliminar. Os anticorpos pesquisam-se no soro, plasma, urina e outros líquidos biológicos. 48. Defina diagnóstico serológico. É a designação que se utiliza para a pesquisa de anticorpos ou antigénios específicos, independentemente do produto onde é feita essa pesquisa. 49. O que é o título de um soro? É o inverso da mais alta diluição do soro que deu um resultado positivo. Por exemplo, se a diluição mais lata que deu positivo for 1/16, então o título do anticorpo é 16. 50. Qual a importância de se estudar 2 soros – um na fase aguda da doença e outro na fase de convalescença? A presença de anticorpos por si só não confirma que o doente está infectado, por isso é necessário avaliar a evolução do título de anticorpos específicos. A recolha de um 1.º soro na fase aguda da doença e de um 2.º soro na fase de convalescença (15 dias de intervalo) vai permitir avaliara a tal evolução do título de anticorpos. _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 17
  • 18. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia OUTROS APONTAMENTOS HISTÓRIA DA MICROBIOLOGIA A microbiologia é a ciência que estuda os seres vivos de dimensões microscópicas. Áreas diversas como: • Bacteriologia; • Virologia; • Parasitologia; • Micologia. A microbiologia surge quando é possível a observação de seres de dimensões microscópicas. 1632-1723: • Antony Van Lunwenhok: • 1.º microscopista; • Animáculos (bactérias e protozoários). • Conceito de abiogénese – seres minúsculos desenvolvem-se a partir de matérias em decomposição – teoria da geração espontânea. _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 18
  • 19. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia 1626-1697: • Francesco Redi: • Os germens desenvolvem-se a partir da matéria orgânica exposta ao ar e calor. 1729-1799: • Lazzaro Spallanzani: • 1.º passo para a destruição da teoria da geração espontânea (carne quando fervida não se alterava); • Georg Schroder; • Theodor Van Dusch; • Usam pela 1.ª vez algodão para tapar os recipientes. 1822-1895: • Louis Pasteur: • Teoria da biogénese – os microorganismos provinham de outros pré- existentes em suspensão nas poeiras; • Usa frascos de colo de cisne. 1820-1893: • Jonh Tyndall: • Câmara isenta de poeiras; • Juntamente com F. Cohn descobrem os esporos termorresistentes; • Tindalização (esterilização); • Tyndall/Cohn/Pasteur – como resultado da actividade microbiana: • Fermentação – Hidratos de Carbono Álcool + Ác. Orgânicos; • Putrefacção – decomposição das Proteínas – produtos de odor nauseabundo; • Pasteur descobre que existem microorganismos que não necessitam de O2 (bactérias anaeróbias); _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 19
  • 20. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia • Os microorganismos podem provocar doenças nos homens e animais. 1705-1786: • Verona e Penciz: • Via de transmissão homem a homem. 1773-1856: • Agostinho Bassi: • O primeiro suporte para a teoria microbiana da doença (a doença do bicho da seda era fúngica). 1839: • Schönlein (Tinha favosa). 1827-1912: • Joseph Lister: • Trabalhos sobre antissepsia; • Vapores de Ác. Carbónico – reduz a infecção no pós-operatório. 1843-1910: • Robert Koch: • Estudo do Bacillus anthracis (carbúnculo); • A 1.ª demonstração directa do papel desenvolvido por uma bactéria no desenvolvimento de uma doença; • Postulados de Koch:  Um microorganismo específico deve estar associado a cada doença;  O microorganismo suspeito deve ser isolado em cultura no laboratório; _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 20
  • 21. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia  A inoculação daquela cultura deve ser capaz de produzir a mesma doença num animal susceptível;  O mesmo microorganismo deve ser isolado a partir do animal doente. • Pelo conhecimento actual: • Nem todos os microorganismos podem ser cultivados no laboratório (ex.: Treponema pallidum e Mycobacterium leprae); • Nem todos os microorganismos patogénicos para o Homem o são para os animais (ex.: Vírus da Hepatite C). 1882: • Robert Koch: • Isola em cultura Mycobacterium tuberculosis (bacilo de Koch); • Isto foi possível porque surgiram: •Meios sólidos (gelatina); •Richard Petri (placa de Petri). Nos seguintes 30 a 40 anos: • Pasteur e Koch descobrem, isolam e cultivam muitas das bactérias conhecidas de hoje. 1892: • Dimitri Ivanovski: • Isola o 1.º Vírus “Mosaico do Tabaco”; • Desenvolvimento das primeiras vacinas. 1749-1823: • Eduard Jenner: • Varíola; • Pasteur e Chamberland: • Difteria e Tétano; _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 21
  • 22. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia 1854-1917: • Emil Von Behringer: • Kitasato; • Paul Ehreich: • Difteria. 1845-1916: • Ellie Metchnikoff: • Imunidade inespecífica; • Descobre actividade bacteriana dos leucócitos (fagócitos) – fagocitose. 1900: • Walter Kud: • Febre amarela transmitida por um mosquito. 1906: • Fritz Schandin e Erich Hoffman; • Treponema pallidum – Sífilis. 1921: • Alexander Fleming: • Descobre a lisozima (imunidade inespecífica). 1928: • Descobre a penicilina (quimioterapia) – antibioterapia. 1933: • Ernest Ruska e Max Knoll: • Descobrem o microscópio electrónico; • Chaton: _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 22
  • 23. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia • Descobre e divide os seres vivos em: •Eucariótas; •Procariótas. 1935: • Gerard Domagk: • Descobre a sulfonamida – antibioterapia. 1944: • Oswald T. Avery, C. M. Mcleod e M. J. McCarty: • Processos de transformação bacteriana que possibilitam a possibilidade de transferência de material genético de uma para outra bactéria. 1953: • James Watson e Francis Corick: • Estudos de biologia molecular; • Descoberta da estrutura do DNA. 1892: • Câmara Pestana: • Fundador da bacteriologia em Portugal; • Director do Real Instituto Bacteriológico de Lisboa; • Faleceu no Porto vítima da peste bubónica. Durante as primeiras décadas do século XX os microbiologistas desenvolveram um trabalho no sentido de: • Estudar os microorganismos como fonte de doença; • A resposta imunitária do hospedeiro; • A pesquisa de novos antimicrobianos; • Avançaram no estudo do metabolismo microbiano. _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 23
  • 24. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia A partir da década de 40 em trabalho com biólogos e bioquímicos – Biologia Molecular e Genética, surgem como novas áreas de estudo e investigação. TAXONOMIA MICROBIANA Taxonomia – Classificação (“arrumação”). A taxonomia tem como base a espécie (estirpes geneticamente semelhantes). Estirpe – descendentes de uma colónia pura. Outras características da espécie: • Características morfológicas; • Necessidades nutricionais. Espécies agrupadas em Géneros Géneros agrupados em Famílias Famílias agrupadas em Ordens Ordem agrupada em Classe Classe agrupada em Filo ou Divisão Filo agrupado em Reino CLASSIFICAÇÃO DOS SERES VIVOS 1735 – Lineu: Animalia Reinos Plantae 1886 – Ernest Haeckel: _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 24
  • 25. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia Acrescenta um reino – Protistas – seres de organização unicelular ou multicelular sem diferenciação em tecidos (bactérias, protozoários, algas, bolores, leveduras). 1940 – A microscopia electrónica – estudo da estrutura celular interna, surgem: Eucariótas 2 tipos Procariótas ORGANIZAÇÃO CELULAR EUCARIÓTA • Núcleo com membrana nuclear; • Aparelho mitótico; • DNA associado a histonas; • Ribossomas; • Cloroplastos (vegetal); • Mitocôndrias; • Retículo endoplasmático; • Aparelho de Golgi; • Vacúolos (vegetal); • Flagelos; • Citoesqueleto; • Parede celular (vegetal). ORGANIZAÇÃO CELULAR PROCARIÓTA • Ribossomas; • Parede celular; _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 25
  • 26. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia CÉLULAS PROCARIÓTICAS • Archaeobacteria – bactérias produtoras de metano, desenvolvem-se em meio hiper salino ou em temperaturas elevadas (termofílicas); • Eubactérias – todas as bactérias incluindo as patogénicas para o Homem, bactérias do solo e da água. CÉLULAS EUCARIÓTICAS • Fungos; • Algas; • Protozoários; • Plantas; • Animais. TAXONOMIA DE WHITTAKER (1969) Divisão em cinco reinos: • Plantae; • Animalia; • Protistas – protozoários e algas unicelulares (eucarióticas unicelulares); • Fungi – bolores e leveduras; • Monera ou Procaryotae – todas as bactérias procarióticas. Critérios de classificação • Tipo celular – procariota e eucariota; _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 26
  • 27. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia • Nível de organização – solitária ou colonial, unicelular ou multicelular; • Tipos de nutrição – fotossíntese, digestão ou absorção. Nesta classificação os microorganismos ficam em três grupos: • Monera – bactérias e cianobactérias; • Protistas – algas unicelulares e protozoários; • Fungi – bolores e leveduras. TAXONOMIA DE CARL WOSE (1977) Os seres vivos são divididos em três domínios ou impérios: • Eukarya – protozoários, algas, fungos, plantas e animais eucariótas; • Archaea – bactérias metanogénicas, termofílicas e halofílicas; • Bactéria – todas as bactérias patogénicas, as bactérias do solo e da água. Esta nova designação baseia-se na composição bioquímica da membrana (natureza dos lípidos, tipo molecular do RNA ribossómico – mRNA). Baseado nestes estudos defende-se que os eucariótas e os procariótas têm origem numa mesma forma ancestral comum, mas que evoluiriam de uma forma diferente. MICROORGANISMOS PROCARIÓTAS BACTÉRIAS PROCARIÓTAS MORFOLOGIA Cocos e bacilos. Replicação por divisão binária. Agrupamentos _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 27
  • 28. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia • Cocos: • Diplococos; • Cadeia; • Cacho; • Tetrada. • Bacilos: • Isolados; • Cadeia curta; • Pleomorfismo: •Curvilíneos; •Fusiformes; •Ondulados; •Espiralados. Dimensão De 100nm a 1,5µm. Tintagem (coloração de Gram) Na microscopia óptica revelam-se com corantes. A coloração de Gram tem valor taxonómico: Corante primário – Violeta de Cristal; Mordente – Soluto de Lugol; Descorante – Etanol; • Corante de contraste – Fucsina básica. •Bactérias positivas ao Gram – fixam o Violeta de Cristal; Parede •Bactérias negativas ao Gram – fixam a Fucsina básica. celular _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 28
  • 29. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia Parede celular As Eubactérias possuem parede celular, com excepção das Mycoplasmas (possuem apenas membrana celular). A parede celular: • Confere protecção mecânica – impede a lise da célula bacteriana em meio hipotónico; • Dá forma à bactéria; • Determina o comportamento ao Gram Peptidoglicano (Mucopeptideo ou Mureina) Presente em todas as bactérias, com excepção das Archaeobactérias (parede celular com pseudopeptidoglicano). O peptidoglicano é o constituinte rígido da estrutura parietal. Diferença de comportamento ao Gram A existência de Gram + e Gram - deve-se a estrutura e química da parede diferentes. Diferenças mais relevantes • Bactérias Gram +: • Não têm lípidos, com excepção dos três géneros Mycobacterium, Corynebacterium e Nocardia; • Elevada concentração de peptidoglicano – 50-90% do peso da parede. • Bactérias Gram -: • Elevado teor em lípidos; • Baixa concentração em peptidoglicano – 10% do peso da parede. _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 29
  • 30. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia Composição química da parede celular bacteriana Constituintes Gram + Gram - Peptidoglicano + +/- Ácidos Teicóicos/Teicurónicos + +/- Polissacarídeos + - Proteínas +/- + Lipossacarídeos - + Lípidos +/- + Parede celular das bactérias Gram + Constituição química • Peptidoglicano; • Outros heteropolímeros: • Ácidos Teicóicos; ambos estão associados ao peptidoglicano • Ácidos Teicurónicos. mas não conferem rigidez Peptidoglicano • Organização tridimensional universal; • Macropolímero em forma de saco (muraina saculus); • Rígido/insolúvel na água; • Constituído por dois aminoácidos, com disposição linear alternada, ligados por ligação glicosídica, que pode ser hidrolisada pela enzima lisozima (acção mureínica): • N-acetilglucosamina (NAG); • Acido N-acetil muranico (NAM) – a cada molécula de NAM liga-se um peptídeo (cadeia de 4 aminoácidos), através de uma ligação amina. Ácidos Teicóicos • Contêm vestígios de glicerol e ribitol; _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 30
  • 31. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia • São solúveis na água; • Localizam-se em toda a espessura da membrana; • Formam-se ácidos lipoteicóicos quando uma porção de ácidos teicóicos que contêm glicerol se liga ao glicopeptídeo do folheto exterior da membrana citoplasmática. Atravessam a parede celular dos bacilos Gram + e constituem os antigénios somáticos dos bacilos Gram +; • A zona hidrófila dos ácidos teicóicos é acessível aos ácidos específicos, o que provoca a sua presença na superfície celular. Ácidos Teicurónicos São as moléculas que substituem os ácidos teicóicos quando as bactérias crescem em meios pobres em fósforo por conterem galactosamina mais ácido glucorónico. Ácidos Teicóicos e Ácidos Teicurónicos São responsáveis pela carga negativa da superfície dos bacilos Gram +, atraindo Mg2+ e Ca2+ . Reduzem as repressões electrostáticas no polímero – conferem estabilidade estrutural. Lípidos Estão presentes nos géneros: • Mycobacterium; • Nocardia; • Corynebacteruium. Estas bactérias têm lípidos de peso molecular elevado que torna a molécula impermeável a vários compostos. O comprimento da cadeia dos ácidos lipídicos tem valor taxonómico: _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 31
  • 32. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia • C 24 - C 40 – ácidos corionomicolicos; • C 40 - C 60 – ácidos nocardicos; • C 60 - C 80 – ácidos micolicos. São estes que tornam a molécula impermeável a vários compostos. Não são por isso visíveis na coloração de Gram, mas têm uma parede do tipo Gram + complexa. Coram pela coloração Ziehl Neelsen com Fucsina concentrada e a quente, resistindo à descoloração pelo reagente de Ebner (álcool mais acido clorídrico), por isso são designadas Bacilos Álcool Ácido Resistentes (BAAR). O polissacarídeo específico dos BAAR é a arabinogalactomanana. Autolisinas endógenas São enzimas muralíticas (tipo amidase). Localizam-se na membrana citoplasmática. Durante o crescimento bacteriano têm uma acção lítica fisiológica (hidrolisam selectivamente peptidoglicano em determinadas partes da parede bacteriana para a entrada de novas unidades de peptidoglicano. A sua acção é controlada pelos ácidos lipoteicóicos e fosfolípidos. Se falharem os mecanismos de repressão ou forem activados pelas β-lactamases, ocorre lise bacteriana – morte. Parede celular de bactérias Gram – Constituição química • Lipossacarídeos (LPS); • Fosfolípidos; • Proteínas; • Porinas; • Proteínas OMpA; • Autolisinas; _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 32
  • 33. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia • Peptidoglicano. Lipopolissacarídeo (LPS) • Molécula mais característica dos Gram -; • Principal endotoxina; • Molécula anfílica: • Polissacarídeo – hidrófilo; • Lípido A – hidrófobo. • Localização – folheto externo da membrana exterior; • Os LPS estão ligados à membrana exterior pelo lípido A, e o polissacarídeo fica virado para o exterior da célula, sendo responsável pela carga negativa da bactéria. Esta hidrofilia torna a molécula impermeável à penetração de compostos hidrófobos; • Os LPS são os Antigénios Somáticos dos bacilos Gram -; • A fracção lípido A é responsável nas infecções clínicas por bacilos Gram -, pelo aparecimento no hospedeiro de febre, inflamação e choque séptico; • Os LPS estão mais ou menos indirectamente envolvidos na activação de: •Macrófagos; •Linfócitos B; •Linfócitos T; •Sistema complemento; •Sistema de coagulação. Fosfolípidos Localizam-se na membrana exterior no folheto interno. Quando se deslocam para o folheto externo tornam as bactérias permeáveis a componentes hidrófobos. Proteínas Localizam-se na membrana exterior. Nos Gram – a concentração de proteínas na parede celular é elevada: _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 33
  • 34. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia • Lipoproteínas; • São as mais abundantes; • Encontram-se livres ou ligadas ao peptidoglicano; • O seu principal papel é conferir estabilidade à bactéria, podendo esta sobreviver sem ela, mas lisam facilmente por diversos agentes. • Proteínas OMpA; • Porinas – Proteínas que se organizam em poros ou canais onde passam substâncias hidrofílicas (nutrientes para a bactéria) • Proteínas de transporte específico de substâncias na difusão através da membrana exterior; • Autolisinas (enzimas hidrolíticas) do peptidoglicano; • Nas bactérias Gram – não se conhece: • Natureza; • Localização; • Mecanismos de regulação. • Enzimas – fosfolipase A e proteases. Esquema da arquitectura molecular da parede celular das bactérias Gram - CONSTITUIÇÃO Parede celular _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 34
  • 35. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia Bactérias Gram - Por microscopia electrónica verifica-se que é constituída por duas membranas: • Membrana exterior; • Membrana interior – membrana citoplasmática. O espaço entre elas denomina-se espaço periplasmático. A camada rígida R é formada pelo peptidoglicano. Espaço periplasmático • Composição – polipeptidossacarídeos; • Consistência – gel; • Espaço vital para as células bacterianas; • Reservatório de β-lactamases; • Enzimas degradativas; • Enzimas de transporte – açucares e aminoácidos; • Quimioreceptores. Funções de permeabilidade • Folheto externo (membrana externa) – LPS; • Folheto interno (membrana externa) – fosfolípidos. • Os antibióticos atravessam a membrana externa por dois processos: • Via hidrofílica – porinas; • Via hidrofóbica – bicamada fosfolipídica. Canais de porinas (transmembranares) • φ variável entre as bactérias; • Difusão passiva de compostos hidrófilos: Membrana citoplasmática • Bicamada – permeabilidade selectiva: • Permeável e moléculas lipófilas; _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 35
  • 36. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia • Impermeável a moléculas hidrófobas. • Funções de biossíntese – peptidoglicano; • Funções energéticas – metabolismo oxidativo. Enterobactérias A camada fosfolipídica é impermeável. A membrana citoplasmática envolve o citoplasma celular. Composição química: • Bicamada de fosfolípidos; • Proteínas. Archaeobactérias Composição química: • Fosfolípidos; • Proteínas; • Lípidos especiais. Cápsula Estrutura que envolve a parede celular em algumas bactérias. Por microscopia electrónica (tinta da china), verifica-se um halo transparente que envolve a bactéria. Natureza – polissacarídeo Retém a água e impede a dissecação da bactéria. Confere grande virulência – cápsula antifagocitária. Estruturas intracitoplasmáticas • Visíveis em microscopia óptica; _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 36
  • 37. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia • Colorações especiais; • Estão presentes em algumas espécies. Granulações metacromáticas (grânulos de volutina) • Coloração de Albert – azul de metileno; • Constituem reserva de fósforo essencial para a síntese de ácidos nucleicos e Fosfolípidos da bactéria. Vacúolos de Gaz • Para as bactérias fotossintéticas; • Reserva de azoto; • Permite flutuar na água. Grânulos de glicogénio • Coram pelo reagente de lugol; • Polímeros de glucose; • Reserva energética. Grânulos de lípidos • Coram pelo reagente de negrão de sudão; • Reserva. Ribossomas _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 37
  • 38. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia • Dispersos no citoplasma bacteriano; • Local de síntese proteica; • Constituídos por proteínas e ácidos nucleicos. Endosporos • Permitem a passagem da morfologia vegetativa em esporos; • Impede a dissecação celular – sobrevivência da bactéria por centenas ou milhares de anos; • Forma resistência em condições hostis como: • Radiações; • Detergentes; • Calor; • Antibióticos. • Os esporos preservam o material genético, em boas condições, dando origem a células vegetativas – fenómeno de germinação. Nucleóide • Local da célula onde se localiza o material genético – DNA (material nuclear); • Ausência de membrana nuclear; • Aparelho mitótico; • Tem um único cromossoma; • Visível em microscopia óptica com corantes básicos; • O DNA cromossómico pode coexistir com o DNA plasmídico. _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 38
  • 39. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia Mobilidade bacteriana Flagelos • Órgão de locomoção; • Natureza proteica; • Visíveis em microscopia óptica com corantes; • A sua localização na bactéria tem valor taxonómico: • Bactérias com flagelo polar – monótrico; • Flagelos polares – anfítrico; • Tufo de flagelos em um ou nos dois pólos – lofotricos; • Distribuem-se em toda a superfície – peritrica Outras espécies movem-se por contractura de um conjunto de fibras situadas no periplasma – filamento axial – com mobilidade deslizante. Pilis e fimbrias (apêndices bacterianos endocelulares que se projectam para o exterior das células) Pilis • Estrutura filamentosa de natureza proteica; • Visível só na microscopia electrónica; • Permite o contacto entre células diferentes – conjugação. Fimbrias • Estrutura filamentosa de natureza proteica; • Visível no microscópio electrónico ou por microscopia óptica após coloração; • Órgão de aderência bacteriana a outras células; _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 39
  • 40. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia • Reconhece receptores celulares nas superfícies epiteliais. MICROORGANISMOS EUCARIOTAS MORFOLOGIA E ULTRAESTRUTURAS EUCARIOTAS Organismos unicelulares e pluricelulares que possuem membranas internas, com núcleo individualizado – existem espaços físicos com funções diferentes. ORGANISMOS EUCARIOTAS Fungos, algas e protozoários (parasitas). ORGANISMOS EUCARIOTAS MAIS SIMPLES Leveduras. ORGANISMOS EUCARIOTAS UNICELULARES COMPLEXOS Protozoários. ORGANISMOS UNICELULARES EUCARIOTAS Constituem metade da biomassa da Terra porque: • São pequenos; _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 40
  • 41. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia • Têm divisão rápida; • Consomem poucos nutrientes; • Adaptam-se facilmente a diversos ambientes Sucesso na sua evolução As células eucariotas são mais complexas que as células procariotas. O genoma é maior e possui mecanismos de regulação e de expressão, genotipicamente mais elaborados. O DNA encontra-se num compartimento próprio delimitado por membranas – o núcleo. No citoplasma há vários constituintes (organitos) delimitados por membranas com funções especiais. CONSTITUIÇÃO MEMBRANA CITOPLASMÁTICA Constituição: • Fosfolípidos; • Proteínas; • Esteróis (mamíferos – colesterol). PAREDE CELULAR • Eucariotas sem parede celular – mamíferos e alguns protozoários; • Eucariotas com parede celular – algas, fungos e alguns protozoários. Constituição: _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 41
  • 42. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia • Peptidoglicano – o glicano nos protozoários é substituído por polissacarídeos. NÚCLEO Possui invólucro nuclear constituído por duas membranas: • Membrana nuclear externa; • Membrana nuclear interna. As duas membranas delimitam um espaço designado por cisterna perinuclear, à qual está intimamente ligado o retículo endoplasmático. Através da cisterna há transporte para o citoplasma de: • RNA mensageiro; • RNA de transferência; • RNA ribossomal. Transporte em sentido oposto: • Enzimas para replicação do DNA; • Enzimas de síntese do RNA. MOLÉCULA DO DNA Macromolécula que cabe no núcleo “enrolada” e que contém o património genético das células. O DNA é “encapotado” por proteínas – histonas. DNA + histonas cromatina nuclear. Heterocromatina – periferia nuclear, zona menos densa. Eucromatina – interior do núcleo, zona menos densa – concentra os genes activos e inactivos. NUCLÉOLO _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 42
  • 43. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia Estrutura nuclear em número variável. Função – síntese de ribossomas. RIBOSSOMAS Síntese proteica No citoplasma são utilizadas todas as moléculas que permitem à célula crescer, multiplicar-se, diferenciar-se e comunicar com as outras num organismo pluricelular. Estas moléculas com esta função são na sua maioria proteicas. As proteínas cuja estrutura e consequente função é determinada pela sequencia de pares do respectivo gene. Cada gene que codifica uma proteína é inicialmente copiado no núcleo por um mecanismo designado transcrição dando origem a uma molécula de RNA mensageiro (RNAm). Estas quando transportadas para o citoplasma associam-se a ribossomas. Aqui ligam-se a outras moléculas adaptadoras e denominam-se RNA de transferência (RNAt). A sequência de nucleótidos de cada RNAm é traduzida numa sequência de aminoácidos (proteína). As proteínas têm na célula eucariota múltiplas funções: • Enzimas que caracterizam reacções específicas; • Transportadores de outras moléculas. Grande parte das proteínas é sintetizada nos ribossomas localizados no citosol – espaço do citoplasma entre os organitos celulares. Outras proteínas são sintetizadas no ribossoma do retículo endoplasmático (proteínas das membranas celulares, proteínas lisossomais, proteínas de secreção). Muitos dos antibióticos usados actuam ao nível do RNAr – interagem com os mecanismos do ribossoma. Muitos interferem nas células procariotas, mas não nas eucariotas. _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 43
  • 44. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia Mas nas células eucariotas os ribossomas das mitocôndrias são semelhantes às procariotas o que leva à intoxicação da célula. RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO • Labirinto intracelular constituído por cisternas limitadas por membranas; • Retículo endoplasmático rugoso – cisterna revestida de ribossomas; • Retículo endoplasmático liso – não tem ribossomas. Retículo endoplasmático rugoso Há síntese de: • Proteínas secretadas para o exterior da célula; • Proteínas das membranas; • Enzimas lisossómicas. No lúmen do retículo as proteínas sintetizadas nos seus ribossomas ligam-se a um açúcar e transformam-se em glicoproteínas. Retículo endoplasmático liso É muito abundante nas células hepáticas e musculares. Nas células hepáticas acumula-se no retículo liso: • Enzimas de síntese de lipoproteínas; • Enzimas de degradação das drogas e de outras substâncias tóxicas; • Enzimas de síntese de hormonas esteróides – a partir do colesterol; • Síntese de proteínas de transporte; • Proteínas de sequestro de Ca – abundantes no músculo. APARELHO DE GOLGI _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 44
  • 45. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia • Constituído por cisternas e vesículas; • Intimamente ligado ao retículo endoplasmático, recebendo deste as proteínas de secreção, onde sofrem modificações químicas. No aparelho de Golgi é onde se produzem as glicoproteínas. VIA DA SECREÇÃO Exocitose – as vesículas libertam proteínas para o meio extracelular. Um mecanismo de secreção regula o armazenamento de proteínas em grânulos de secreção cuja exocitose só ocorre por um sinal exterior (ingestão de alimento). Permite a digestão das LDL, fracção de colesterol, libertando o colesterol usado como nutriente celular. LISOSSOMAS “Sacos” intracelulares que armazenam enzimas hidrolíticas (enzimas lisossomáticas), activas em meio ácido: • Proteases; • Lipases; • Fosfolipases; • Fosfatases. DIAGNÓSTICO LABORATORIAL EM MICROBIOLOGIA PESQUISA DE MICROORGANISMSOS INFECCIOSOS PRODUTOS BIOLÓGICOS _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 45
  • 46. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia • Expectoração; • Urina; • Fezes; • Corrimento vaginal ou uretral; • Líquidos: ascítico, pleural e cefaloraquídeo; • Secreções nasais e laríngeas; • Tecidos – sangue; • Órgãos – biopsias. Para o isolamento dos microorganismos é preciso respeitar: • Regras de colheita; • Transporte; • Processamento da amostra COLHEITAS DAS AMOSTRAS BIOLÓGICAS Isolar o agente da infecção implica colher a amostra no órgão ou sistema infectado: • Infecção urinária – urina; • Infecção respiratória – secreções respiratórias; • Infecção gastrointestinal – fezes; • Meningite – LCR; • Infecção cutânea: • Exsudado de vesícula; • Raspado de lesão. Na ausência de sintomatologia sugestiva do local – várias colheitas de sangue. Num pico febril – hemocultura. _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 46
  • 47. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia O local para a colheita pode variar no decurso da doença dependendo do ciclo biológico do agente infeccioso. Para o isolamento do agente responsável, deve-se: • Colher a amostra antes de iniciar terapêutica – para não inibir o crescimento “in vitro”; • Colher com material estéril (seringa, zaragatoa, bisturi) para um contentor estéril. Para evitar contaminação com microrganismos, quando se colhe uma amostra estéril, normalmente, sangue, líquido pleural, LCR, antes deve-se desinfectar a pele – a flora da pele contamina a amostra. A colheita deve ser adequada e suficiente para a analise: • Expectoração sem saliva; • Pús do fundo do abcesso. Por vezes são necessárias várias colheitas em períodos diversos porque o microorganismos tem uma presença intermitente. Para manter alguns microrganismos viáveis é necessário enviar a amostra em meio de transporte adequado, que forneça: • pH adequado; • Proteínas; • Atmosfera (CO2); Enviar o produto em contentores rotulados (identificação do doente, serviço e cama). CONSERVAÇÃO DOS PRODUTOS BIOLÓGICOS Após recepção são trabalhados o mais rapidamente possível ou conservados no frigorífico a 4ºC, salvo raras excepções. IDENTIFICAÇÃO DO AGENTE INFECCIOSO _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 47
  • 48. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia • Directamente no produto biológico: • Pesquisa de antigénios específicos; • Observação microscópica da morfologia microbiana – raramente é possível. • Após cultura do produto: • Caracterização bioquímica; • Caracterização antigénica; • Caracterização do genótipo; • Teste da sensibilidade aos antibióticos – ajuda na identificação. DIAGNÓSTICO DIRECTO NO PRODUTO BIOLÓGICO • Exame microscópico directo; • Bactérias, parasitas, fungos em exame a fresco ou em exame corado permite: • Diagnóstico dos parasitas pelas características morfológicas; • Raras vezes serve para os fungos; • Impossível para quase todas as bactérias. • Detecção dos antigénios específicos, evidenciados pelo uso de anticorpos específicos: • Imunofluorescência – anticorpos marcados com corante fluorescente para observação com microscopia fluorescente; • Métodos imunoenzimáticos (ELISA) – pesquisa com anticorpos por reacção colorimétrica; • Reacção de aglutinação em látex – partículas de látex revestidas com anticorpos específicos. • Detecção de sequências genómicas, com pesquisa de nucleótidos específicos: • A pesquisa é feita directamente no produto biológico, com extracção do genoma (DNA) – hibridação; _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 48
  • 49. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia • Após a extracção do genoma no produto biológico, amplia-se o número de sequências específicas utilizando uma enzima, para aumentar a sensibilidade da técnica. DIAGNÓSTICO APÓS CULTURA DO PRODUTO • Caracterização bioquímica: • PCR (Polymerase Chain Reaction) – efectua-se com sondas (sequências de nucleótidos complementares das sequências específicas que pesquisamos) – hibridação (complementaridade de base nucleótida); • Caracterização antigénica: • Diferentes técnicas serológicas; • Reacção antigénio/anticorpo; • Caracterização genotípica: • Classificar os microorganismos de acordo com diferentes padrões de sequência genómica – técnica de hibridação. • Teste de sensibilidade aos antibióticos (antibiograma) – conhecer o padrão de sensibilidade à terapêutica é fundamental porque têm surgido bactérias muito resistentes. Existem várias técnicas para efectuar o TSA. Este baseia-se na capacidade de um microorganismos se multiplicar “in vitro” na presença de diferentes antibióticos: • Método de difusão: • Meio sólido em placa de Petri; • Semeia-se uma suspensão bacteriana; • Discos de papel impregnados de antibióticos; • Após a incubação à temperatura adequado, faz-se a leitura – mediação do halo de inibição do crescimento em volta do disco em mm; • Resultado: _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 49
  • 50. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia •Resistente – não forma halo; •Sensível – forma halo. • Método de diluição: • Meio de cultura semi-sólido ou líquido; • Antibiótico em concentração crescente; • Suspensão bacteriana sempre igual; • Leitura e avaliação no caldo de turvação, podendo avaliar: •CMI (concentração mínima inibitória) que impede o crescimento bacteriano; •CMB (concentração mínima que leva à morte de 99% das bactérias). Cultura e isolamento Bactérias, fungos, parasitas e vírus: • Meios adequados que permitam a multiplicação bacteriana; • Vírus e microorganismos intracelulares são cultivados em células do Homem, animais ou embriões; • Os produtos biológicos são semeados directamente nos meios de cultura; • Algumas amostras antes de serem cultivadas têm de ser tratadas; • As culturas de produtos biológicos com flora residente exigem meios selectivos que favoreçam o crescimento dos microorganismos potencialmente patogénicos; • Culturas incubadas – atmosfera, humidade e temperatura adequadas; • O tempo de incubação depende da capacidade de replicação: • Crescimento rápido – 18-24h; • Crescimento fastidioso – 48-72h; • Anaeróbios estritos – 48-96h. _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 50
  • 51. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia • Colónias bacterianas são a forma de detecção do crescimento de fungos e bactérias; • Efeito citopatogénico (ECP) – um vírus em crescimento é detectado por alterações morfológicas nas células infectadas. DETECÇÃO DA RESPOSTA IMUNE ESPECÍFICA CONTRA O AGENTE INFECCIOSO Quando não é possível identificar o microorganismo recorre-se à técnica imunológica que permite avaliar a resposta imune do hospedeiro infectado. Os microorganismos são nos hospedeiros antigénios e induzem a resposta específica imunohumoral e celular. Detecção da resposta imunohumoral Diagnóstico serológico Pesquisa de anticorpos ou antigénios específicos. A resposta humoral está ligada à actividade dos linfócitos B, estas células produzem anticorpos e estes ligam-se especificamente aos antigénios que o organismo não reconhece como seus e quer eliminar. Os anticorpos pesquisam-se no soro, plasma, urina e outros líquidos biológicos. Quantificação dos anticorpos É determinante para efectuar o diagnóstico. As reacções antigénio/anticorpo fazem-se em diluições seriadas do soro do doente. _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 51
  • 52. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia Título de anticorpo – é o inverso da mais alta diluição do soro que dá ainda resultado positivo. Só por si a presença de anticorpos específicos não afirma que o doente está infectado mas é necessário avaliar a evolução do título de anticorpos específicos: • 1.ª colheita de soro na fase de doença; • 2.ª colheita de soro na fase de convalescença. Estas duas colheitas efectuam-se com pelo menos 15 dias de intervalo. Os anticorpos específicos surgem entre a 1.ª e 2.ª semana, após o contacto com o microorganismo. Atingem posteriormente o valor máximo e descem para valores basais. Interpretação das provas serológicas • Limitações; • Resultados positivos; • Falsos resultados positivos. Reacção cruzada – acontece com testes muito sensíveis mas pouco específicos, porque os antigénios usados são comuns a outros microorganismos. Os resultados positivos devem sempre que possível ser confirmados por técnicas mais específicas. Devemos titular os anticorpos e determinar a classe para avaliar a possibilidade da relação com a infecção aguda. Resultados negativos Se há grande suspeita de infecção deve repetir-se a colheita mais tarde, pois a primeira colheita pode ter sido precoce, não há ainda anticorpos detectáveis. Há pessoas imunocomprometidas, isto é, não respondem às infecções com produção de anticorpos a um nível detectável. Exemplos de pessoas imunocomprometidas: • Doentes do foro oncológico; _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 52
  • 53. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia • Diabéticos; • Cirróticos; • Insuficientes renais; • Doentes muito idosos. Isto são doentes que têm uma patologia de base muito debilitante. Resposta imunocelular Depende da actividade dos linfócitos T que são responsáveis pela resposta inflamatória local – intradermo-reacção (tumefacção limitada, zona quente). É a reacção à inoculação intradérmica de antigénios de agentes infecciosos. A reacção positiva da intradermo-reacção serve quando positiva para dizer que já houve contacto anterior com o agente infeccioso. Pessoas anérgicas (reacção infectiva) • Pessoas sem contacto com o agente; • Pessoas no início da infecção; • Pessoas imunocomprometidas. Decisão diagnóstica Há microorganismos que são sempre considerados agentes patogénicos. A sua identificação leva sempre ao início da terapêutica. A identificação de um microorganismo tem muito significado se a amostra é colhida em local estéril habitualmente. A identificação de microorganismos em locais onde existe flora comensal é analisada com cuidado – resposta imune. Deve ainda ter-se nesse caso em atenção o número de microorganismos e é de considerar se for elevada a presença, e verificar se há reacção serológica compatível. Uma subida de título do 1.º soro para o 2.º soro indica infecção recente. Uma manutenção do título ou baixa – índice de que houve contacto com o microorganismo no passado mas agora ele não é causa de doença. Determinação da classe de anticorpos _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 53
  • 54. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia Deve determinar-se sempre que possível a classe dos anticorpos que reagem especificamente com o antigénio: • IgM – surgem no início da infecção e persistem até cerca de dois meses (fase aguda da doença) – revelam um contacto recente com o antigénio específico (por vezes até um ano); • IgG – na convalescença as IgG substituem as IgM e podem ficar com os títulos residuais toda a vida; • IgA – surgem logo no início da doença e permitem a sua detecção em diagnóstico precoce. Métodos utilizados para a detecção de anticorpos e antigénios • Reacções imunoenzimáticas; • Reacções de imunofluorescência; • Reacções de aglutinação; • Reacções de inibição de hemaglutinação; • Reacções de imunodifusão; • Reacções de fixação do complemento; • Reacções de seroneutralização. VÍRUS CARACTERÍSTICAS VIRAIS • Dimensão submicroscópica; • Intracelular obrigatório; • Contém informação genética num único tipo de ácido nucleico, DNA e RNA; • Partículas formadas por estruturas proteicas repetitivas e regulares encerrando o ácido nucleico viral; • Não têm metabolismo; _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 54
  • 55. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia • Não produzem energia. DEFINIÇÃO DE VÍRUS Entidade potencialmente patogénica cujo genoma são ácidos nucleicos que se replicam no interior de células vivas usando o equipamento de síntese celular e que sintetizem partículas que transmitem o genoma a outras células. DUAS PROPRIEDADES ESSENCIAIS AOS VÍRUS • Têm material genético próprio; • Utilizam o equipamento bioquímico da célula infectada – parasitismo genético. FASE EXTRACELULAR Partículas inertes produzidas na célula sobre o comando de vírus que levam a informação genética viral para outras células. DEFINIÇÃO VIRAL NA PERSPECTIVA DE BIOLOGIA MOLECULAR (Rybicki) Elemento unitário de uma linhagem contínua com história evolutiva individualizada. CRITÉRIO DE VIDA • Capacidade de replicação; • Transmissão de informação genética; • Evolução. _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 55
  • 56. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia Ambiguidade na definição de biologia molecular: • Plasmídeo – replicação autónoma, codifica proteínas e são transmissíveis. Ao contrário dos vírus não têm fase extracelular; • Viróides – são patogénicos das plantas com uma molécula de RNA, sem genes e sem capside; • Priões: • Não têm ácido nucleico; • Proteínas molecular mutada que forma agregados infecciosos. CICLO VIRAL Ciclo infeccioso que inclui diversas fases:  Interacção do vírus com a célula: • Adsorção à membrana da célula; • Penetração na célula. Segue-se a esta fase inicial o elipse viral – não se consegue detectar o vírus. Corresponde ao período de síntese dos componentes para formar novas partículas viras (enzimas, ácidos nucleicos e proteínas).  Fase de maturação: • Detectam-se após novos vírus com produção exponencial que se vão libertar na fase final – extrusão; • Pode ocorrer a morte celular entre 6 e 48 horas. Este ciclo que leva à produção de novos vírus e morte da célula é o ciclo infeccioso completo – ciclo lítico ou produtivo. Ocorre nas células permissivas. CICLO ABORTIVO _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 56
  • 57. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia • Quando o vírus não consegue expressar todas as funções necessárias à síntese de novos vírus, chamam-se a estes vírus defectivos; • As células não são permissivas – ocorre a síntese de alguns compostos mas não há produção final de vírus infecciosos. INFECÇÃO LATENTE Quando o genoma viral fica na célula muito tempo mas não há formação de novos vírus. MORFOLOGIA As partículas virais são constituídas por: • Cápsula proteica – encerra o nucleóide; • Nucleóide – é constituído pelo ácido nucleico e proteínas virais; • Nucleocapside – capside mais nucleóide; • Invólucro – reveste alguns derivados da membrana celular. FORMA/ESTRUTURA/DIMENSÃO • Esféricos, bastonete rígido, filamento flexível; • Icosaédrica (vinte faces triangulares), helicoidal; • 20-45nm. CLASSIFICAÇÃO E TAXONOMIA Principais critérios usados: _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 57
  • 58. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia • Tipo e estrutura do genoma: • DNA e RNA; • DNA de cadeia linear ou circular, de cadeia simples ou dupla; • RNA de cadeia dupla ou simples. Se a cadeia é simples pode ter uma sequência igual ao RNAm ou RNA complementar; • Genoma segmentado – dividido em mais do que uma molécula. • Estrutura – icosaédrica, helicoidal, mista, com ou sem invólucro; • Tipo de hospedeiro – vertebrados; invertebrados, plantas, fungos ou bactérias. Para estabelecer a diferença entre género e espécie acrescentam-se mais critérios aos anteriores: • Número e tipo de proteínas; • Estratégia de replicação viral; • Processo de transcrição; • Propriedades físico-químicas; • Relações antigénicas. A classificação actual abrange 3600 vírus que constituem 75 famílias. CLASSIFICAÇÃO DE VÍRUS DE VERTEBRADOS Genoma Morfologia Família Exemplo DNA Cadeia dupla linear Cadeia mista Icosaédrica com invólucro Icosaédrica sem invólucro Herpes viridae Herpes simples Poxviridae Varíola _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 58
  • 59. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia RNA Cadeia simples RNAm Icosaédrica Picornaviridae Poliomielite Icosaédrica Flaviridae Febre amarela Icosaédrica Togaviridae Rubéola Cadeia segmentada Helicoidal Orthomyxovirida e Gripe Cadeia não segmentada Helicoidal Paramyxoviridae Sarampo RNA-DNA Icosaédrica Retroviridae HIV PROCESSO DE PRODUÇÃO DE VÍRUS Inclui diversas fases: • Absorção: • Adsorção do vírus (proteínas) aos receptores da membrana celular (proteínas ou polissacarídeos); • O tipo de receptor é factor muito importante na susceptibilidade da célula à infecção; • Alguns vírus têm grande especialidade de hospedeiros. • Penetração: • Translocação da partícula para o citoplasma da célula; • Fusão do invólucro do vírus com a membrana celular; • Endocitose por endossomas mediada por receptores. • Descapsidação – perda da cápsula, pode acontecer no citoplasma ou no núcleo celular e pode ocorrer logo depois da penetração; • Fase sintética – fase de síntese de componentes virais (enzimas reguladoras ou estruturais) e a replicação do genoma viral; • Montagem e extrusão: • Os componentes do vírus recém-sintetizados são montados em partículas mais ou menos complexas; • O local de replicação pode ser o citoplasma ou o núcleo; _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 59
  • 60. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia • Excepção para os retrovírus cujas partículas imaturas ficam junto da membrana celular onde adquire o invólucro e sai da célula por gemulação; • Excepção para os herpes, vírus de replicação nuclear, a maturação faz-se entre os dois folhetos da membrana nuclear. Os vírus são posteriormente transportados para o exterior pelo retículo endoplasmático sem entrar em contacto com o citoplasma. O invólucro é de natureza nuclear. ESTRATÉGIA DO GENOMA VIRAL Vários tipos de vírus e diversos genomas implicam diversos mecanismos de expressão de informação genética e replicação do genoma. A replicação viral tem sem excepção uma via comum. O RNAm é traduzido em proteínas pelo equipamento das células: • Ribossomas; • RNAt. De acordo com esta via, Baltimore classificou-os em grupos de estratégia. CLASSIFICAÇÃO DE BALTIMORE (vírus dos vertebrados) • Grupo I – vírus de DNA de cadeia dupla de replicação nuclear ou citoplasmática. O genoma viral é transcrito em RNAm por enzimas celulares ou enzimas virais. Decorre em duas fases: • 1.ª fase – o DNA é transcrito em RNAm precoce e este é traduzido em DNA – é a polimerase que replica o DNA viral; • 2.ª fase – novo RNAm dito tardio é traduzido em outras proteínas do vírus. _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 60
  • 61. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia • Grupo II – vírus com DNA de cadeia simples. O genoma é convertido numa molécula de cadeia dupla (forma replicativa) que serve de molde para a transcrição do RNAm e replicação que como nos vírus do grupo I dá-se com enzimas celulares; • Grupo III – vírus com RNA de cadeia dupla. O RNA viral dentro do nucleóide é transcrito em RNA+ por uma polimerase presente na capside viral. O RNA+ serve de RNAm e serve de molde para a síntese de RNA viral de cadeia dupla – RNA- ; • Grupo IV – nos vírus RNA+ , o RNA viral pode ser usado como RNAm que codifica e replica RNA viral; • Grupo V – nos vírus RNA- este é transcrito em RNA complementar que serve de RNAm. As células não têm RNA polimerases que usam RNA como molde. Uma enzima deste tipo – transcriptase – está presente no próprio vírus, sintetiza o RNA+ que é transcrito em RNA complementar; • Grupo VI – retrovírus. O RNA é transcrito numa molécula de DNA de cadeia dupla por uma enzima presente no vírus – a retranscriptase. Este DNA é replicado e transcrito em RNAm por enzimas celulares como se fosse DNA celular. Proteínas do vírus modificam a transcrição com produção de RNA+ , que é encapsidado como RNA viral; • Grupo VII – vírus com DNA de cadeia dupla (vírus da hepatite B). Em zonas do genoma a cadeia é simples, esta é preenchida por enzimas celulares. Uma RNA polimerase celular transcreve esta cadeia reparada em RNAm e em RNA que cobre todo o genoma. Este RNA+ é o molde para a síntese de um híbrido RNA-DNA à custa de uma transcriptase reversa e o híbrido é convertido em RNA viral. VÍRUS DA HEPATITE B (HBV) Grupo – hepadnavirus. Tipo do genoma – DNA circular. _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 61
  • 62. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia ANTIGÉNIOS IMPORTANTES • HBsAg – Ag de superfície do vírus; • HBeAg – Ag do invólucro ou nucleocapside; • HBcAg – Ag do core. O vírus localiza-se no sangue e pode disseminar-se, por replicação no tecido linfóide, fígado e sangue. Incubação – 1-3 meses. Quando aumenta a lesão hepática aparecem os sintomas clínicos. MARCADORES DA HEPATITE B • HBsAg – indica infectividade do sangue; • HBsAc – Ac contra o Ag de superfície. Fornece imunidade, não está presente nos indivíduos portadores. Imunidade após infecção ou após vacinação. Nunca está presente nos portadores; • HBeAg – Ag da nucleocapside. Indica transmissibilidades; • HBeAc – Ac do Ag do invólucro. Indica baixa transmissibilidade; • HBcAg – Ag do core; • HBcAc – Ac do Ag do core, que aparece na fase inicial. MARCADORES SEROLÓGICOS  Seroconvenção: • HBeAg – desaparece; _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 62
  • 63. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia • Anti-HBe – aparece; indica • Replicação viral – evolução para cura.  Reactivação da infecção: • HBeAg – reaparece; • 95% dos casos de infecção HBV evoluem para cura, HBsAg e HBeAg – desaparecem. Surgem estes Ac: • Anti-HBc; • Anti-HBe; • Anti-HBs. • 5% é infocrónica.  Hepatite activa, estão presentes – fase aguda: • HBsAg; • IgM anti-HBc.  Hepatite crónica – após 6 meses determinam-se: • No soro: • HBsAg; • IgM anti-Hbc. • Em biopsia hepática: • HBeAg – hepatite crónica nativa; • Anti-HBe – H.C. mutante.  Cura, podem desaparecer passado meses: • Anti-HBs; • Anti-HBe. Vacinados contra VHB _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 63
  • 64. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia Películas sintetizadas. Ficam nos imunizados anti-HBs. Recém-nascidos Mãe com imunidade de infecção antiga. RN apresenta durante meses, porque atravessam a placenta: • Anti-HBs; • Anti-HBe. GRÁFICO DE SEROLOGIA E MARCADORES DA HEPATITE B PROPRIEDADES BIOLÓGICAS DAS PRINCIPAIS CLASSES DE IMUNOGLOBULINAS EM HUMANOS _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 64
  • 65. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia Designação IgG IgA IgM IgD IgE Principais características Ig interna mais abundante Protecção das superfícies externas Muito eficiente na bacteriemia Principalment e actua como receptor nos linfócitos Inicia a inflamação, elevada nas infecções parasitárias, causa síndromes alérgicas Ligação ao antigénio ++ ++ ++ ++ ++ Fixação do complemento + - +++ + - Passagem transplacentária ++ - - - - Fixação a mastócitos e basófilos homólogos - - - - ++ Ligação a macrófagos e polimorfos +++ + - - + RICKTESIAS MORFOLOGIA • Bacilos Gram -: • Coram fracamente pelo Gram; • Corante mais usado – Gimenez. Adquirem cor vermelha – visíveis no microscópio óptico. • Formas cocobacilares; • Tamanho variável das diferentes estirpes – mais pequenas que as restantes bactérias; • Aeróbias obrigatórias; • Imóveis; • Crescimento lento – bactérias fastidiosas; • Têm DNA e RNA; • Parede celular bacteriana; _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 65
  • 66. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia • Equipamento enzimático complexo; • Reproduzem-se por divisão binária; • Organização celular – procariota; • Intracelulares; • Sensíveis a antibióticos de largo espectro – Cloranfenicol e Tetraciclina. Morfologicamente e fisiologicamente as Ricktesias ficam entre as bactérias e os vírus. Desenvolvem-se obrigatoriamente em tecidos e células embrionárias – citoplasma e por vezes no núcleo da célula do hospedeiro: • Ciclo de vida; • Transmissão. RESERVATÓRIO • Pequenos roedores – ratos caseiros; • Pulgas, piolhos, carraças – artrópodes; • Só acidentalmente no Homem e outros vertebrados – caprinos, outros. CADEIA DE TRANSMISSÃO • Multiplica-se no artrópode – reservatório; • Transmite-se ao Homem ou a outros vertebrados por picada do artrópode infectado – carraça, piolho, pulga; • No caso da Coxiella burnetii o hospedeiro acidental pode ser infectado directamente Após multiplicação no interior da célula reservatório (infectada) as enzimas da Ricktesia promovem a lise da parede celular do hospedeiro. Quando libertas (vida extracelular) perdem rapidamente o poder infectante. _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 66
  • 67. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia Não sobrevivem à dissecação. Excepto Coxiella burnetii que é muito resistente – assim pode haver contágio directo com o Homem. Esta não necessita de vectores – artrópodes. RESITÊNCIAAOS DESINFECTANTES Com a Coxiella burnetii, a mais resistente, deve usar-se: • Formaldeido 5%; • Água oxigenada 5%. ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO • Difícil isolamento; • Perigosa manipulação – câmara de classe III – perigo de transmissão através de aerossóis infectados; • Cultura em tecidos ou embriões – laboratório especializado. SEROLOGIA – DIAGNÓSTICO PRESUNTIVO (rotina laboratorial) Reacção de Weil Felix que utiliza antigénios homólogos da estirpe – Proteus vulgaris – OX – 19; OX – 2; OX – K: • Aglutinam com os anticorpos produzidos contra a Ricktesia (dos grupos do Tifo e Febre); • Reacção sempre negativa para a Coxiella burnetii – agente da febre; INCUBAÇÃO DAS DOENÇAS Agrupam-se de acordo com a morfologia, cultura e tipo de infecção. Provocam: • Febre; • Mialgias; Toxinas da • Lesão cardíaca; Ricktesia • Hemorragia. _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 67
  • 68. Escola Superior de Enfermagem da Guarda ________________________________ __________________________________________________________ Microbiologia RELAÇÕES PARASITA-HOSPEDEIRO Parasitismo – se o microorganismo beneficia na relação com o hospedeiro em detrimento deste. Comensalismo – quando um é beneficiado e o outro não é prejudicado; Mutualismo – quando ambos beneficiam. equilíbrio Floram comensal hospedeiro Flora comensal – microorganismos residentes num local do hospedeiro sem provocar doença – adaptação. O hospedeiro fornece condições de residência aos microorganismos no local: • Nutrientes; • pH; • Humidade; • Temperatura. adequadas ao crescimento bacteriano. ZONAS DE COLONIZAÇÃO • Cavidade bucal; • Tracto gastrointestinal; • Tracto respiratório superior – fossas nasais e nasofaringe; • Pele. _________________________ V Curso de Licenciatura _______________________ ___________________________ 1.º ano/1.º semestre __________________________ 68