O estudo testou a importância de regiões básicas (BRs) nas proteínas da cápside VP1, VP2 e VP3 do vírus adeno-associado tipo 2 para a translocação nuclear e montagem do vírion. As mutações nas BRs 2 e 3 reduziram o transporte de VP1 e VP2 para o núcleo, mas não de VP3, enquanto a mutação da BR4 retém as três proteínas no citoplasma. A BR3 parece ser necessária e suficiente para o transporte nuclear de VP2.

1. Bruno, Elton, Edson, Guilherme, Rodrigo
UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
BIOTECNOLOGIA - 2014.1
VIROLOGIA MOLECULAR

2. O artigo
★ Translocação Nuclear de proteínas da cápside de vírus
adeno-associados TIPO 2 para montagem de vírions.
★ Origem: Alemanha/Inglaterra
German Cancer Research Center (Alemanha)
Rentschler Biotechnologie (Alemanha)
Roslin Cellab, Roslin BioCentre (Inglaterra)
★ Publicado no Journal of General Virology 93

3. Introdução e pontos-chave
● A montagem da cápside de vírus Adeno-associados (AAV)
ocorre no núcleo celular. Simetria Icosaédrica (VP1,VP2 e
VP3)
● Proteínas de cápside VP1, VP2 e VP3 contém diversas
regiões básicas (BRs). Que podem atuar como sinais de
localização nuclear (NLSs).
● Mutações nas BRs modificam a translocação proteica e
consequentemente a montagem da cápside.

4. Objetivo
Os estudos testaram hipóteses sobre a
importância e a variação das BRs no
resultado final de montagem do vírion e na
translocação nuclear das proteínas.

5. Introdução

6. Introdução

7. Observações - Introdução
● Mutações nas regiões BR2 e BR3, reduzem o transporte
de VP1 e VP2 para o núcleo, mas não VP3.
● Mutação combinada de BR1, BR2 e BR3 resultam em
capsídeos com pequena redução de VP1.
● Expressão isolada de VP1/2 na terminação N mostram
influência de BR3 no transporte nuclear, enquanto BR1
ou BR2 não tem efeito.
● Mutação de BR4, apresenta que as 3 VPs ficam retidas
no citoplasma.

8. Materiais e Métodos
● Cultura de Células: Células da linhagem HeLa e 293
células T em 37o
C com 5% CO2
. Meio de cultivo Eagle
suplantado com 10 % FCS, penicillina, streptomycina e
glutamina.
● Plasmídeo: pTAV2.0 contém o genoma AAV2 completo
As mutações foram verificadas através de DNAseq.
● A expressão das proteínas da cápside foi analisada
através do extrato celular completo através de Western
blotting.

9. Materiais e Métodos
● Localização subcelular das proteínas virais
estabelecida através de microscopia de
imunofluorescência.
● Graphic Imagens preparadas usando o software
RASMOL.
● A estrutura proteica de AAV2 foi obtida do
Brookhaven Protein Data Bank (entry 1LP3)

10. Resultados - Análise de VP1 / 2 BRs N-terminal como
potencial NLSs de proteínas do cápside
•Os VP1 / 2
•Sequências altamente conservadas(BR1-BR3)
•Candidatos para o NLSs de proteínas do Cápside
• Mapeamento Supressão de VP2
•Mutagênese dirigida ao Sítio

11. Resultados - Análise de VP1 / 2 BRs N-terminal como
potencial NLSs de proteínas do cápside
•Transporte Monitorado por
imunofluorescência indireta
para detectar as proteínas do
Cápside, utilizando:
- mAb-A1 – VP1
- mAb A69 – VP1 e VP2
- mAb- B1 – VP1, VP2 e VP3
• A coloração de células
transfectadas com o mAb A20
indicou que formação da
cápside ocorreu com todos os
mutantes

12. Resultados - BR2 e BR3 influência VP na
estequimometria dos Capsídeos Montados
•Avaliação dos diferentes mutantes utilizando a técnica de imunofluorescência

13. Resultados - BR2 e BR3 influência VP na
estequimometria dos Capsídeos Montados
• Quantificação de formação da cápside por
um capsídeo mAb A20 (ELISA);
• Avaliação de mutação BR1, BR2 e BR3
• Influência sobre a estequiometria
de VPs em cápsides
• Cápsides imunoprecipitadas
• Cápsides de mutantes: BR2
-
3
-
e BR1
-
2
-
3
-
Apresentaram:
★ Uma ligeira redução de VP1 e VP2.

14. Resultados
Transporte Nuclear de VP1/2 N-terminal
● Marcadores foram adicionados às VP’s, para visualizar
sua localização na célula, tendo por objetivo saber a
distribuição delas no citoplsama e no núcleo.

15. Resultados
Transporte Nuclear de VP1/2 N-terminal
● Modificaram-se zonas do gene que codifica as Proteínas BR2/3.

16. ● Ficou claro que a predominância de VP’s nos vírus selvagens foi no
núcleo, porém nos mutados observou-se que na ausência de BR2 e 3, o
cenário se inverte, e aproximadamente 80% de VP1,2 e 3 ficou no
citoplasma.
● Constatou-se assim, que BR 2 e 3 são fundamentais no carreamento
de VP’s do vírus para o núcleo da célula.
Resultados
Transporte Nuclear de VP1/2 N-terminal

17. Resultados
Efeitos de BR4 na acumulação das protéinas do cápside no núcleo.
● BR4 mutantes utilizados nesse estudo,

18. Efeitos de BR4 na
acumulação das
protéinas do cápside
no núcleo.
Outro experimento foi feito com o
intuito de verificar, se assim como
BR2 e 3, a BR4 também tinha poder
de modificar o fluxo de VP’s para o
núcleo.
Observou-se que as diversas
mutações feitas em BR4 não
favoreceram acúmulo de VP’s no
núcleo.

19. Resultados
● Se BR4 atua como um NLS, VP3 deveria ser capaz de
se acumular no núcleo.
● No entanto, VP3 expresso sem VP1 e VP2 não se
acumula no núcleo.
● Este resultado pode indicar que o padrão BR4 em VP3 está presente
numa conformação inativa e pode precisar das sequências da
proteína da cápside para se tornar ativo e atuar como um NLS.
BR4 não é necessário para mediar o transporte nuclear de
um subfragmento de VP

20. Resultados
Para avaliar o papel da BR4 sem a interferência das proteínas da cápside por
completo, houve a fusão de uma parte das proteínas. compreendendo parte de
VP2, VP3, o elemento BR4 ao GFP e foi feita a análise da acumulação desse ​​
subfragmento VP no núcleo.
BR4 não é necessário para mediar o transporte nuclear de
um subfragmento de VP

21. Resultados
A Expressão das proteínas de fusão de GFP foi confirmada por Western
blotting, e a translocação nuclear foi analisada por imunofluorescência indireta
usando mAb A69
BR4 não é necessário para mediar o transporte nuclear de
um subfragmento de VP

22. Resultados
● Em contraste com VP3 sozinho, o fragmento EcoNI-BsiWI de VP foi
localizado exclusivamente no núcleo da célula.
● Curiosamente, mutação do BR4 não impediu acúmulo nuclear deste
fragmento da proteína da cápside, levando à conclusão de que BR4 não
pode servir como o único NLS.
BR4 não é necessário para mediar o transporte nuclear de
um subfragmento de VP

23. Resultados
● Este resultado sugeriu que a falta de localização nuclear dos mutantes
BR4 no contexto de VPs de comprimento completo pode ser causada por
de retenção citoplasmática devido ao enrolamento da proteína e não pela
perda de um NLS.
● Mutação de BR2 impediu acumulação nuclear
● Fragmento contendo BR3 não era detectável por imunofluorescência e
também não por Western blotting.
BR4 não é necessário para mediar o transporte nuclear de
um subfragmento de VP

24. Resultados
● Os VPs em K688 e K692, que foram alterados para A (BR52),
● No contexto das proteínas do capsídeo de corpo inteiro entrou claramente
no núcleo; no entanto, eles mostraram uma distribuição salpicada.
BR5 desempenha um papel na distribuição intranuclear
das proteínas do capsídeo

25. Conclusões
● Estudar as sequências de sinais envolvidos na
translocação nuclear é um desafio por alguns motivos:
1. Os três VPs podem interagir uns com os outros;
2. Podem associar-se com outras proteínas e formar
agregados que impedem os transportes intracelulares
normais.

26. Conclusões
● A análise separada de Vps ou fragmentos,
revela apenas um aspecto parcial do
processo natural que acarreta conclusões
enganosas.

27. Conclusões
● Dessa forma, usaram-se abordagens diferentes que
permitissem relacionar questões do potencial NLS e
das proteínas do capsídeo AAV2.
● Abordagens: Análise de transporte de VP de todas as
proteínas AAV2 e os fragmentos isolados.
Fragmento EcoNI-BsiWI

28. Conclusões
● BR3 é necessária e
suficiente para o
transporte nuclear de VP2.
Essa conclusão baseou-se
na fusão de BR3 a GFP,
que dirige a GFP nos
núcleos das células.

29. Conclusões
● É sugerido um papel de BR2 e BR3 para transporte
nuclear de VPs, embora essa função é, provavelmente,
dependente da interação cooperativa com outro VP
codificada por sinais de transporte nuclear.
● BR2 e BR3 pode atuar mais fortemente em conjunto
como um NLS de duas partes.

30. Conclusões
● A mutação de BR5 não evita o acúmulo
nuclear de proteínas do capsídeo, mas causa
uma aparência manchada no núcleo.

31. Conclusões
● São prováveis as contribuições de BR2 e
BR3, no entanto essas podem ser afetadas
por conformações VP.
● A mutação de BR4 e BR5, nas sequências
NLM, indica uma influência indireta sobre a
conformação da estrutura VP, ao invés de
uma influência na atividade de transporte
nuclear.

32. Conclusões
● A busca por NLSs de proteínas do capsídeo
recém-sintetizadas de AAV2 revelou uma
situação complexa em que nenhuma das
sequências de sinais candidatos
investigados mostrou uma atividade
dominante NLS.

33. FIM
Perguntas ?
:-)

34. FIM
+ Perguntas ?
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35. FIM
Obrigado
:-)