O documento discute mutações e mecanismos de reparação de DNA. Aborda os tipos de mutações como pontuais, induzidas por radiação e agentes químicos. Também explica como as mutações podem ocorrer em nível molecular e são concentradas em "sítios quentes". Finalmente, descreve mecanismos como reparação por fotorreatividade enzimática para corrigir danos no DNA.

1. CAPÍTULO 6 – MUTAÇÃO E MECANISMOS DE REPARAÇÃO DE DNA
MUTANTE
É todo organismo que exibe uma forma diferente da de seus
ascendentes – resultado da presença de uma mutação
MUTAÇÃO
Modificações na informação genética, que resultam em células ou
indivíduos com alterações fenotípicas. Qualquer modificação súbita e
hereditária no conjunto gênico de um organismo, que não é explicável pela
recombinação da variabilidade genética preexistente – mudanças no número
de cromossomos (euploidia e aneuploidia), mudanças grosseiras na estrutura
cromossômica (aberrações cromossômicas) e alterações nos genes
individuais.
Mutação é a fonte básica de toda a variabilidade genética, constituindo a
matéria prima para a evolução. A recombinação apenas rearranja essa
variabilidade em combinações novas e a seleção natural/artificial simplesmente
preserva as combinações mais bem adaptadas às condições ambientais
existentes/desejadas. Sem a mutação, todos os genes existiriam apenas em
uma forma e os organismos não seriam capazes de evoluir e de se adaptar às
condições ambientais.
Mutações espontâneas – resultadas de funções celulares normais ou
interações aleatórias com o ambiente. A frequência de ocorrência das mesmas
é denominado nível basal (background).
Mutações induzidas – causadas por agentes mutagênicos e as
modificações que eles causam. Muitos mutagênicos atuam diretamente no
DNA (atuando como uma determinada base ou incorporando-se à cadeia
polinucleotídica).
Mutação pontual – envolve modificação em um único par de bases
(substituição, adição ou deleção) e pode ser o resultado de um mau
funcionamento do sistema celular que replica ou repara o DNA, inserindo uma
base incorreta na cadeia polinucleotídica que está sendo sintetizada, ou de
uma interferência química diretamente sobre uma das bases do DNA.
Mutações letais condicionais – são aquelas letais em um ambiente,
nas denominadas condições restritivas, mas são viáveis em um segundo
ambiente, em condições permissivas.
1) Mutantes auxotróficos – incapazes de sintetizar um metabólito
essencial (ex: aminoácido, purina, pirimidina) e que é sintetizado

2. novamente pelos indivíduos do tipo selvagem da espécie – esses
mutantes crescem e se reproduzem quando o metabólito é fornecido
pelo meio (condição permissiva) e não crescem quando o metabólito
está ausente (condição restritiva).
2) Mutantes sensíveis a temperatura – são viáveis em uma
determinada temperatura, mas não em outra.
3) Mutantes sensíveis ao supressor – viáveis quando um segundo
fator genético, um supressor, está presente, mas não são viáveis na
ausência deste. O gene supressor pode corrigir ou compensar um
efeito no fenótipo, ou pode restituir o produto gênico alterado pela
mutação não-essencial.
Mutações podem ocorrer em qualquer célula e em qualquer estágio do
ciclo celular. Aquelas que ocorrem em células germinativas serão transmitidas
à descendência. Mutações em células somáticas serão perpetuadas apenas
nas células descendentes da célula original na qual a mutação ocorreu e
podem não afetar o organismo inteiro.
MUTAÇÃO EM NÍVEL MOLECULAR
Alguns átomos de hidrogênio podem mover-se de uma posição para a
outra nas purinas e pirimidinas, tais flutuações químicas são denominadas de
modificações tautoméricas – alteram o pareamento de bases normal, onde a
adenina pareia com a timina e a guanina com a citosina. Raramente, as formas
cetônicas mais estáveis da timina e da guanina e as formas amínicas da
adenina e da citosina podem sofrer modificações tautoméricas para,
respectivamente, as formas enólicas e imínicas, menos estáveis.
Nos seus estados menos estáveis, imínico e enólico, a adenina pode
parear com a citosina e a timina, com a guanina. No próximo ciclo de
replicação, a adenina provavelmente voltará a sua forma amínica estável, a
qual irá parear com uma timina, e a citosina, incorporada erroneamente em ma
das fitas da cadeia, será mantida e irá parear com uma guanina. Assim, uma
das cadeias-filhas da molécula de DNA irá conter um par G-C no lugar do par
de bases normal A-T.
As mutações resultantes de modificações tautoméricas nas bases do
DNA envolvem a substituição de um par de bases por outro (mutação pontual).
Chama-se transição a substituição de uma purina por outra purina ou de uma
pirimidina por outra pirimidina. Transversão é a substituição de uma purina por
uma pirimidina ou vice-versa.
Mutação que modifica a fase de leitura – tipo de mutação pontual que
envolve a adição ou deleção de um ou mais pares de bases, alterando a fase

3. de leitura de todas as trincas de pares de bases no gene, depois do sítio
mutado.
As DNA-polimerases possuem atividade exonucleásica (3’  5’) que
garante a remoção de praticamente todo nucleotídeo incorretamente pareado
[DNA-polimerase III exerce a função de revisar a polimerização].
MUTAÇÕES SÃO CONCENTRADAS EM “SÍTIOS QUENTES” (hotspots)
Sítios nos quais ocorre um número de mutações maior do que o
esperado para uma distribuição aleatória. Os “sítios quentes” não são
universais para todos os tipos de mutações e diferentes mutagênicos podem
ter diferentes “sítios quentes”.
Bases modificadas (mutações espontâneas) – são produzidas pela
modificação química de uma das quatro bases já presentes no DNA. A base
modificada mais comum é a 5-metilcitosina, gerada pela enzima metilase, que
adiciona um grupamento metila a uma pequena fração dos resíduos de citosina
(em sítios específicos de DNA). Sítios contendo 5-metilcitosina constituem
“sítios quentes” para mutações pontuais espontâneas – toma a forma de uma
transição G-C para A-T.
5-metilcitosina (desaminação espontânea) – substituição do grupamento
amínico por um grupamento cetônico – 5-metilcitosina é convertida em timina
A conversão cria um par anômalo G-T cuja separação, na replicação
subsequente, produz um par G-C do tipo selvagem e um par A-T mutante.
FREQUÊNCIAS DE MUTAÇÃO
Mutações silenciosas – mutações sem efeito aparente. Elas se dividem
em dois grupos: aquelas que envolvem troca de bases do DNA, mas não
causam a troca do aminoácido presente na proteína correspondente e aquelas
que levam à troca do aminoácido, mas a substituição não afeta a atividade da
proteína (mutações neutras).
Mutações diretas – mutações que inativam o gene. Seus efeitos podem
ser revertidos pelas mutações reversas ou retromutações, as quais também
podem ser de dois tipos: uma reversão exata, no mesmo sítio da mutação
original, é chamada reversão verdadeira e restaura a sequência selvagem. A
ocorrência de uma segunda mutação, em um local diferente do genoma, que,
de alguma forma, compensa a primeira mutação, é denominada de mutação
supressora ou reversão do segundo sítio, pois “suprime” os efeitos da
mutação original (pode ocorrer em um lugar distinto no mesmo gene da
mutação original, em um gene diferente, em um cromossomo diferente – desde
que restaure a função do gene originalmente inativado).

4. Uma mutação direta resulta de qualquer alteração que inative um gene,
enquanto uma mutação reversa restaura a função de uma proteína danificada
por uma determinada mutação direta.
MUTAÇÃO INDUZIDA POR RADIAÇÃO
Radiação ionizante (raios X, raios gama e raios cósmicos) – ao
penetrarem nos tecidos vivos, esses raios de muita energia colidem com os
átomos da matéria e causam a liberação de elétrons, deixando radicais livres
positivamente carregados (íons). Esses íons, por sua vez, colidem com outras
moléculas, provocando a liberação de outros elétrons. O resultado final é a
formação de uma “trilha” de íons ao longo do caminho de casa raio de alta
energia através da matéria ou tecido vivo.
Os raios ultravioleta (UV), que tem pouca energia, penetram apenas nas
camadas superficiais de plantas e animais superiores e não induzem a
ionizações. Os raios UV dissipam sua energia para os átomos que eles
encontram, elevando os elétrons de orbitais exteriores para níveis de alta
energia, um estado referido como excitação. As moléculas contendo átomos
na forma iônica ou no estado excitado são quimicamente mais reativas do que
as que contêm átomos no seu estado estável normal. A reatividade aumentada
dos átomos presentes nas moléculas de DNA é a base dos efeitos
mutagênicos da luz UV e da radiação ionizante.
RADIAÇÃO IONIZANTE
Teoria da cinética de colisão única – toda ionização tem uma
probabilidade de induzir a uma mutação.
RADIAÇÃO ULTRAVIOLETA
Os raios UV não possuem energia suficiente para induzir a ionizações.
Eles são, entretanto, prontamente absorvidos por certas substâncias, tais como
purinas e pirimidinas, as quais, por sua vez, ficam mais reativas ou no estado
excitado. Nos organismos multicelulares, os raios UV atingem apenas a
camada de células superficiais. Nos seres unicelulares, no entanto, os raios UV
são um potente agente mutagênico. Os dois principais produtos da absorção
de UV pelas pirimidinas são os hidratos de pirimidinas e os dímeros de
pirimidinas.
Os dímeros de timina parecem causar mutações de duas formas
indiretas – os dímeros aparentemente alteram a hélice dupla de DNA,
interferindo na replicação precisa da molécula; e os erros ocasionais ocorrem
durante os processos de reparação do DNA danificado. A relação entre a
frequência de mutação e a dose de UV é muito variável, dependendo do tipo de
mutação do organismo e das condições vigentes.

5. MUTAÇÃO INDUZIDA QUIMICAMENTE
Análogos de bases são substâncias mutagênicas que possuem estrutura
suficientemente similar às bases normais para serem metabolizadas e
incorporadas ao DNA durante a replicação. As duas bases análogas mais
comumente utilizadas são 5-bromouracila e a 2-aminopurina. A 5-bromouracila
é uma análoga da timina e sua forma enólica pareia com a guanina, causando
a transição A-T  C-G. A 2- aminopurina normalmente pareia com a timina e
seu tautômero forma uma única ponte de hidrogênio com a citosina para
produzir a transição A-T  G-C.
Outros mutagênicos atuam por meio de modificações químicas das
bases de DNA, como:
1) Ácido nitroso – reage com as bases que possuem grupamento amino.
A adenina é desaminada oxidativamente para hipoxantina, a citosina
para uracila e a guanina para xantina (hipoxantina-citosina, uracila-
adenina e xantina-citosina). Ocorre transição A-T  C-G.
2) Hidroxilamina – mutagênico altamente específico (hidroxilamina-
citosina), gera um derivado que pareia com a adenina, ao invés de com
a guanina. Transição unidirecional C-G  A-T.
3) Acridinas (corante aromático) – esses compostos intercalam-se no DNA
introduzindo-se entre pares de bases adjacentes da hélice dupla e,
consequentemente, causam a inserção ou deleção de um ou mais pares
de bases – altera o módulo de leitura na tradução.
4) Alquilação – transferência de grupamentos metila ou etila para os sítios
reativos das bases e dos fosfatos da cadeia de DNA (nitrosaminas e
metilnitrosoguanidina), um dos sítios mais vulneráveis é a base
guanina. Troca de G-C por A-T.
APLICAÇÕES PRÁTICAS DAS MUTAÇÕES
A sequência de passos de uma rota metabólica pode ser
freqüentemente, determinada através do isolamento e do estudo de mutações
nos genes que codificam as enzimas envolvidas. Para determinar a função de
um gene recentemente identificado, utiliza-se a mutação nula – elimina
completamente a função de um gene, caso ele seja essencial a mutação nula é
letal.
MUTAÇÕES NO HOMEM

6. Verificou-se que a cadeia BETA da HbS (hemoglobina da célula
falciforme) diferia em apenas um aminoácido em relação a cadeia BETA da
HbA (sexto aminoácido da extremidade amínica). Na cadeia BETA, da HbA,
esse aminoácido é o ácido glutâmico (com carga negativa) e, na cadeia BETA
da HbS, ele é uma valina (sem carga). As cadeias ALFA da HbA e HbS são
idênticas. Portanto, uma modificação em apenas um único aminoácido pode ter
sério efeito no fenótipo (troca de ácido glutâmico para valina é bem explicada
pela substituição de um par de bases A-T por T-A [transversão]).
Várias outras doenças hereditárias humanas são causadas por
mutações que envolvem a substituição de um único nucleotídeo, levando à
troca do aminoácido correspondente.
MECANISMO DE REPARAÇÃO DO DNA
Muitos dos danos sofridos pelo DNA podem ser reparados (quebra de
ligações fosfodiéster da cadeia, fitas livres podem ser cruzadas e
covalentemente ligadas, bases podem ser alteradas ou perdidas) porque a
informação genética é preservada em ambas as fitas da hélice dupla, de tal
forma que a informação perdida em uma fita pode ser recuperada a partir da
fita complementar.
REPARAÇÃO POR FOTORREATIVIDADE ENZIMÁTICA
Remoção de dímeros de pirimidina, que são formados pela exposição do
DNA à luz ultravioleta. Resíduos de pirimidinas adjacentes podem tornar-se
covalentemente ligados sob estas condições. Este dímero não se encaixa bem
na hélice dupla e, assim, a replicação e a expressão gênica são bloqueadas
até que a lesão seja removida. Dímeros de pirimidina são o alvo universal da
enzima fotoliase (se liga ao dímero e catalisa uma segunda reação
fotoquímica, na presença de luz visível – refaz as bases pirimídicas
individuais).
Esse processo é chamado de fotorreativação e envolve duas etapas:
1) A enzima reconhece e liga-se especificamente ao dímero no escuro
2) A absorção de luz fornece energia para converter o dímero em
monômeros de pirimidina e a enzima dissocia-se do DNA.
REPARAÇÃO DE BASES ALQUILADAS
Remoção dos grupamentos metila dos fosfatos que possivelmente
interrompem a cadeia de DNA. Uma característica dessa reação é que não há
meios de recuperar a enzima metilada, o que determina que uma nova
molécula de enzima seja gasta para cada grupamento metila que é removido.
REPARAÇÃO POR EXCISÃO

7. A remoção de uma base defeituosa ou não-habitual pode ser feita pela
clivagem da ligação base-açúcar (excisão da base) ou, mais comumente, pela
incisão endonucleolítica nos dois lados da lesão, pela liberação dos
nucleotídeos, seguida pelo preenchimento da região pela ação da DNA-
polimerase I e posterior ligação.
REPARAÇÃO POR EXCISÃO DE NUCLEOTÍDEOS
Reparação por excisão de nucleotídeos (REN) – cinco etapas:
1) Reconhecimento da lesão;
2) Incisão da fita lesada em ambos os lados da lesão e a alguma distância
desta;
3) Excisão do segmento (oligonucleotídeo) contendo a lesão;
4) Síntese de um novo segmento de DNA utilizando a fita não-danificada
como molde;
5) Ligação.
A extensão média do fragmento de DNA removido é de 12 nucleotídeos
(modelo de reparação de regiões curtas). Em caso de grandes quantidades
de lesões, a reparação de regiões curtas contribui com 99% dos eventos de
reparação por excisão. Esse modelo de reparação também requer a ação dos
genes uvr e envolve DNA-polimerase I (reparação de regiões longas –
induzidas por lesões no DNA). O passo mais importante, a detecção da lesão
através da discriminação entre estruturas de DNA normais e anormais, é
realizado pela ação cooperativa das proteínas UvrA e UvrB.
O sistema REN remove lesões que bloqueiam a transcrição da fita que
contém um gene ativo mais rapidamente do que da fita que não é transcrita ou
do restante do genoma da célula. O sistema pode, aparentemente, diferenciar
entre as duas fitas de um gene e determinar que sítios mais sensíveis do
genoma sejam os primeiros a ser reparados, embora contenham o mesmo tipo
de lesão encontrada em locais menos críticos do DNA.
REPARAÇÃO DE BASES MALPAREADAS
Algumas bases incorretamente pareadas conseguem escapar da revisão
realizada pela DNA-polimerase. O sistema de correção de erro (várias
proteínas) percorre o DNA recentemente sintetizado à procura de pares de
bases malpareadas e remove os segmentos de fita simples contendo
nucleotídeos incorretos. Isso permite que a DNA-polimerase insira a base
correta na lacuna formada. Existe um sinal específico, controlado
temporalmente, que direciona o sistema de excisão do erro exclusivamente

8. para a fita recém-sintetizada (reconhecimento de sequências GATC próximas
ao erro).
Muitas sequências GATC na célula tornam-se modificadas após sua
síntese, mas somente após um pequeno espaço de tempo – alguns segundos
ou minutos. Tempo suficiente para que o sistema de correção se ligue à fita
recém-sintetizada, ao invés de se ligar à fita molde. O sistema de correção
detecta não somente pares únicos de bases malpareadas, mas também
adições e deleções, o que reduz a incidência de mutações por modificação no
módulo de leitura, além daquelas envolvendo substituição de bases.
SISTEMA DE REPARAÇÃO POR DESVIO
Os sistemas de reparação por desvio não removem lesões, mas
possibilitam a preservação da continuidade do genoma através de replicação
sujeita a erro ou por recombinação.
REPARAÇÃO POR RECOMBINAÇÃO PÓS-REPLICAÇÃO
No processo de reparação por excisão, a fita complementar não-
danificada é utilizada como molde na substituição do fragmento lesado.
Algumas vezes, porém, esse molde não está disponível (ex: lesão do tipo
dímero de pirimidinas impede o sítio danificado de atuar como molde). A DNA
polimerase, então, é forçada a “saltar”, passando pela lesão. Nesse caso as
duas fitas filhas resultantes serão diferentes: uma terá a fita parental contendo
a lesão, pareada com uma fita recém sintetizada, que contém uma lacuna de
tamanho considerável; a outra fita duplicada terá a fita parental não danificada,
a qual terá sido copiada, originando uma fita complementar normal.
Além disso, se ambas as bases de um par complementar forem
alteradas, nenhuma poderá atuar como molde para a outra; ou, ainda, se a
hélice dupla for quebrada nas duas fitas e se um determinado segmento do
DNA for perdido, não haverá a possibilidade de que uma reparação direta e
precisa ocorra (apenas outra molécula idêntica de DNA pode reparar esses
danos – reparação por recombinação).
REPARAÇÃO ATRAVÉS DO SISTEMA SOS
Uma vez que a célula pode, freqüentemente, regular a expressão dos
genes de acordo com a necessidade de seus produtos, muitas enzimas
envolvidas na separação do DNA são induzidas pelo próprio defeito da
molécula. O grupo mais importante dessas enzimas consiste nos produtos dos
genes SOS, que são induzidos por um defeito que é severo o bastante a ponto
de impedir a síntese de DNA, ao invés de apenas trocar as propriedades de
pareamento das bases (ex: dímeros de pirimidinas).
SISTEMA DE REPARAÇÃO SUJEITO A ERRO

9. Existem ocasiões em que o dano no DNA é tão extremo que não há
maneira de os mecanismos celulares de reparação corrigirem de forma precisa
a molécula. Nesse momento a célula utiliza como último recurso, o sistema de
reparação sujeito a erro, no qual qualquer uma das quatro bases é inserida
no local lesado, a fim de garantir a continuidade do processo de replicação.
Devido ao fato de não haver a informação (molde) precisa, o próprio
mecanismo de reparação acaba sendo o causador de uma mutação, pois a
chance de introduzir uma base incorreta na cadeia é grande.
SISTEMA DE REPARAÇÃO EM CÉLULAS DE MAMÍFEROS
Sistema de reparação de genes ativos ou fitaseletivos – reparação
preferencial de sequências transcritas. Aparentemente, uma maior prioridade é
dada no sentido de resolver rapidamente um bloqueio da transcrição de um
processo vital causado por uma lesão no molde. O reconhecimento inicial e a
sinalização da lesão do DNA são provavelmente realizados pela RNA-
polimerase II, enquanto que a reparação em regiões do genoma que não
contém genes (sistema de reparação global) é mais lenta e mesmo
incompleta.
Recentemente, a proteína XPC foi identificada como um sensor de
lesões no DNA e como um fator de recrutamento do sistema de reparação do
genoma global, não participando, portanto, do sistema de reparação de genes
ativos (fita-seletivo).
1) As proteínas XPB, XPD e XPA estão envolvidas na detecção da lesão,
com as helicases percorrendo a hélice e PA reconhecendo a lesão;
2) Após encontrar a lesão, o complexo desnatura o DNA do local do dano.
Essa conformação específica é reconhecida pelas endonucleases XPF-
ERCC1 e XPG, que fazem a dupla incisão na cadeia, gerando um
oligonucleotídeo de 24-32 bases contendo a lesão;
3) As DNAs polimerases GAMA e EPSON e seus co-fatores PCNA e RF-C
estão envolvidos na remoção do oligonucleotídeo contendo o dano, na
liberação do complexo de incisão e ressíntese do DNA;
4) DNA-ligase I realiza a ligação da extremidade 5’da região recém-
sintetizada `sequência original.
UNIÃO DE EXTREMIDADES NÃO-HOMÓLOGAS
Quebra nas duas fitas de uma mesma molécula de DNA ocorrem nas
células em diversas circunstâncias e constituem uma das principais ameaças à
integridade do genoma. Se não forem reparadas, elas podem causar a morte
celular e, em organismos multicelulares, podem causar o câncer. (agentes

10. exógenos, agentes endógenos, drogas anticancerígenas, radiação ionizante –
causam essas quebras).
União de extremidades não-homólogas – principal mecanismo de
reparação dessas quebras duplas e consiste na ligação de extremidades não-
coesivas de uma mesma molécula de DNA. (não requer homologia entre as
duas moléculas que irão recombinar).
Em leveduras, o processo predominante para a reparação de quebras
nas duas fitas do DNA é a recombinação homóloga. No entanto, leveduras
também possuem o processo de união de extremidades não-homólogas.
AULAS PRÁTICAS – EXTRAÇÃO DE DNA PLASMIDIAL E ELETROSFORESE
DNA plasmidial consiste em uma molécula circular, existente
naturalmente em bactéria e que se auto replica independentemente do genoma
da célula (genes que conferem resistência a antibióticos ou que codificam
algum nutriente para o qual a célula é deficiente).
• SDS/hidróxido de sódio (SDS/NaOH): Lisa as células
bacterianas. O detergente SDS decompõe os componentes
lipídicos do envelope celular. O hidróxido de sódio desnatura os
DNAs plasmidial e cromossômicos em cadeias simples.
• Etanol 100%: rapidamente precipita os ácidos nucléicos
(proteínas precipitam mais lentamente).
• Tris/EDTA (TE): O Tris tampona a solução de EDTA e o EDTA
protege o DNA da degradação por DNAse (ativação da DNAse
depende de cofatores). Para que houvesse o sucesso deste
protocolo houve a necessidade da preservação do DNA
cromossômico em pedaços grandes, que poderiam ser separados
do DNA plasmidial intacto. A fragmentação.
• Glicose/Tris/EDTA (GTE): A glicose funciona para manter a
pressão osmótica enquanto que o Tris tampona as células (pH 8),
o EDTA liga-se a cátions bivalentes da camada lipídica
fragilizando o envelope celular (após a lise celular, o EDTA evita a
degradação do DNA, ligando-se a íons Mg).
• Acetato de potássio/ácido acético (KOAc): O ácido acético
neutraliza o pH, permitindo que as cadeias de DNA renaturem e o
acetato de potássio precipita o SDS, os lipídios e as proteínas
associadas da suspensão celular (DNA cromossômico
parcialmente renaturado fica preso ao precipitado) apenas os

11. DNAs plasmidiais menores, fragmentos do DNA cromossomal,
moléculas de RNA escapam do precipitado e permanecem nas
solução.
• Etanol 70%: A água presente no etanol 70% remove o SDS e
alguns sais remanescentes da preparação.
NOÇÕES BÁSICAS DE ASSEPSIA E CULTIVO DE MICRORGANISMOS
A bactéria Escherichia coli do tipo selvagem cresce quando provida dos
elementos carbono, nitrogênio, fósforo, enxofre, potássio, sódio e magnésio,
que são convertidos em aminoácidos, proteínas, lipídeos, polissacarídeos.
Estes elementos são básicos para a estrutura e o metabolismo da bactéria e
são, geralmente fornecidos como sais inorgânicos, como NaCl e MgCl2. O
açúcar, comumente a glicose, é utilizado como fonte de carbono numa solução
aquosa com pH corrigido para próximo da neutralidade. O meio deve conter
também vitamina biotina e o nucleosídeo timidina (meio mínimo).
Por outro lado, bactérias podem crescer num meio nutritivo rico (extrato
de carne, extrato de levedura ou hidrolisado de proteínas do leite que
fornecerão muitas das substâncias intermediárias do metabolismo, as quais
poderão ser usadas diretamente, sem necessidade de sintetizá-las a partir dos
elementos básicos.
DIGESTÃO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS
Bactérias resistentes a infecção possuem um sistema de enzimas que
reconhece e destrói seletivamente o DNA de fago quando este penetra na
célula. Este sistema de proteção bacteriano é capaz de modificar o DNA da
bactéria de modo a impedir a sua destruição pelas enzimas de restrição
produzidas pela própria bactéria.
As enzimas modificadoras protegem o DNA da bactéria adicionando
grupos metil em nucleotídeos específicos da sequência reconhecida pela
enzima de restrição. Essa modificação evita que o DNA endógeno seja
reconhecido pela enzima de restrição e digerido (as enzimas de restrição
diferem entre si quanto a sequência de bases do DNA que reconhecem e
digerem)

12. As sequências de reconhecimento em são em geral simétricas (mesma
sequência de 4-8 nucleotídeos quando lida na direção 5’ – 3’esta presente em
ambas as fitas de DNA – sentidos inversos na dupla hélice) e as enzimas de
restrição cortam o DNA sempre entre o mesmo par de nucleotídeos em ambas
as fitas.
O resultado do corte de uma molécula de DNA por uma enzima de
restrição pode gerar fragmentos com extremidades abruptas ou, fragmentos
complementares entre si (extremidades coesivas) – cada extremidade da fita
simples pode emparelhar com qualquer outra extremidade produzida pela
mesma enzima (moléculas de DNA produzidas por união de dois ou mais
fragmentos de origens diversas = DNA recombinante).
LIGAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS E TRANSFORMAÇÃO BACTERIANA
Um dos aspectos da ação de algumas endonucleases, como EcoRI e
Hae III é que o sítio de restrição apresenta a mesma leitura nos dois sentidos
da cadeia. Não importando a origem do DNA, moléculas cortadas com a
mesma enzima têm a mesma chance de se ligar à sua própria molécula como
à outra molécula presente (DNA recombinante). Outra enzima encontrada nas
células, a DNA ligase, completa a ligação de forma estável, restabelecendo a
molécula de fita dupla (DNA ligase necessita de íons Mg2+
).
PLASMÍDEO – ajuda na obtenção de DNA recombinante, trata-se de
uma molécula de DNA circular que contém genes não essenciais para a
bactéria:
- Origem de replicação autônoma (ORI), podendo se replicar várias
vezes sem que ocorra a divisão da bactéria;
- Portadores de genes que conferem resistência a antibióticos;
- Possuem um sítio de clonagem múltipla;
Um plasmídeo contendo um gene humano por meio do corte das duas
moléculas com uma mesma endonuclease de restrição, é inserido numa
bactéria e é capaz de se replicar, replicando junto o gene de interesse numa
escala muito maior do que aquela possível no organismo original (plasmídeos
denominados de vetores).
As moléculas de DNA passam através de canais situados nas chamadas
zonas de adesão (locais onde a membranas internas e externas da célula
bacteriana unem-se formando poros) – presentes apenas durante a fase de
crescimento exponencial. Em condições normais, a captação de DNA torna-se

13. difícil devido a repulsão eletrostática existentes entre as cargas negativas da
camada de fosfolipídios da membrana bacteriana e dos grupamentos fosfatos
da molécula de DNA (altas concentrações de Ca2+
+ choque térmico, possuem
elevada facilidade de captar moléculas de DNA. Outra metodologia
extremamente utilizada é a eletroporação [zonas de adesão existentes
aumentam de tamanho e ficam estabilizadas por milisegundos] – possibilitando
a entrada de DNA exógeno) – TRANSGÊNICO.
CAPÍTULO 8 – REPLICAÇÃO DO DNA
- Diversas DNA polimerases estão envolvidas na replicação do DNA
1) DNA polimerases I e II  Reparo de DNA;
2) DNA polimerases III  Replicação;
- Em Escherichia coli:
1min – 15.000 bases
Xmin – 10.000.000 bases
X = 666,57 min
- As duas fitas são replicadas conjuntamente, uma de forma contínua e a outra
de forma descontínua;
INÍCIO DA REPLICAÇÃO EM DNA CIRCULAR:

14. - A replicação ocorre em uma região denominada ORI (origem de replicação);
- São regiões ricas em AT;
- Em bactérias e vírus e algumas organelas, encontra-se apenas uma ORI;
REPLICAÇÃO DO DNA
- Para iniciar a replicação, há a necessidade do reconhecimento de quatro
sequências de nove pares de bases (5’ TTATCCACA 3’) por uma proteína
dnaA;
- Todavia, deve haver três sequências em tandem ricas T “antes” das quatro
sequências reconhecidas pela DnaA;
- Em procariotos: regiões de repetição em tandem e ricas em AT são muito
conservadas;
- Em eucariotos inferiores: sequências denominadas de ARS;
- Eucariotos superiores: sequências denominadas replicons (regiões
complexas não compreendidas);
INÍCIO DA REPLICAÇÃO
- O início da replicação é marcado por uma proteína denominada de dnaA;
- A ligação de dnaA à OriC é cooperativa;
- DnaA apresenta três funções durante o início da replicação:
1) Liga-se a Ori determinando onde deve-se iniciar a eplicação;

15. 2) Induz a abertura das fitas de DNA;
3)Posiciona a proteína dnaB;
INÍCIO DA REPLICAÇÃO
- Divídido em três estágios:
1. Complexo Inicial – Ligação dos monômeros de DnaA nos quatro sítios
de 9 pares de bases ricos em AT. A ligação é cooperativa, ou seja,
favorece a alteração da estrutura do DNA;
2. Complexo aberto – A ligação das proteínas DnaA estimula a ligação da
proteína HU que estimula a reação por estabilizar a curvatura.
3. Complexo Pré-priming – Ligação da proteína DnaB (com função de
helicase, mantendo as duas fitas de DNA dissociadas) na região das
sequências repetitivas de 13 pares de bases. Esta proteína recruta a
proteína DnaC formando um complexo DnaB-DnaC;
HELICASE (DNA GIRASE)
- Quebra as pontes de H utilizando ATP para que a forquilha de replicação
(estruturas separadas em uma parte e juntas em outra) possa se movimentar;
- Em E. coli a quebra das pontes de H é efetuada pela DnaB, realizando o
movimento ao longo da fita no sentido 5’  3’;
- Após aberta a dupla hélice, ocorre à ação da enzima TOPOISOMERASE,
impedindo que as fitas voltem a se enrolar novamente (evita que o DNA se
torne super enrolado);
- Outra proteína que impede a união das fitas são as SSB, elas ligam-se a
apenas uma das fitas realizando a manutenção do DNA em fita simples
(evitando o fechamento da fita de DNA);

16. REPLICAÇÃO
- Efetuada pela DNA-polimerase associada a um iniciador (pequeno trecho de
DNA ou RNA utilizado para a extensão);
- O iniciador é conhecido como PRIMER e são pequenas sequências
iniciadoras sintetizadas por uma RNA-polimerase ou PRIMASE;
EXTENÇÃO DAS NOVAS FITAS DE DNA
- A fita é sintetizada na direção 5’  3’ e necessita de uma sequência
iniciadora;
PRIMASE
- Sintetiza primers (com 29 nucleotídeos trifosfatados) complementares a fita
molde de DNA;
- Normalmente, ela associa-se à outras proteínas formando um complexo
denominado de Primossomo, que em eucariotos está associado com a
holoenzima DNA-polimerase;
EXTENSÃO DAS NOVAS FITAS DE DNA

17. - A região responsável pela atividade polimerásica (5’  3’) é a C-terminal;
- Adjacente a este dominío, na região conhecida como N-terminal, encontra-se
um domínio com atividade exonucleásica (5’  3’);
DNA POLIMERASE
- DNA-polimerase I: apresenta dois fragmentos – um menor que contém
apenas atividade exonucleásica (3’  5’) e um fragmento maior, denominado
de “fragmento de Klenow” (utilizado para a síntese e remoção de nucleotídeos)
com as duas outras atividades [revisora/extensora];
- Deve-se lembrar que a garantia de fidelidade da replicação deve-se a
geometria no pareamento das bases;
- A atividade exonucleásica é de extrema importância, pois ajuda a eliminar
alguns erros do processo de replicação (Correção de erro) removendo o
último nucleotídeo (nucleotídeo adicionado erroneamente) a cadeia de DNA;

18. - Envolvida com o reparo de regiões de DNA danificadas;
- A DNA-polimerase I também está envolvida na remoção de primers;
- A DNA-polimerase II formada por uma única cadeia polipeptídica, contém
atividades de polimerização e correção de erro (realiza tarefas similares a da
DNA-polimerase I);
- A DNA-polimerase III é uma holoenzima composta por diversos
polipeptídeos e é a principal enzima envolvida na síntese de DNA;
- Deve-se lembrar que todas as DNA-polimerases sintetizam sempre no sentido
5’ 3’;
REPLICAÇÃO DO DNA
- A fita contínua (fita líder ou leading strand) é alongada apenas com um
primer inicial e a descontínua (lagging strand) utiliza vários primers, pois
apresenta vários fragmentos;

19. - Os diversos fragmentos originados na fita descontínua são conhecidos como
fragmentos de Okasaki;
- O início de cada fragmento de Okasaki é constituído (normalmente) de
moléculas de RNA o qual não está “ligado” ao fragmento anterior de DNA;
- A DNA-polimerase I responsável pelo reconhecimento da extremidade 3’OH
livre, através da sua atividade exonuclaásica 3’ 5’ em conjunto com sua
atividade polimerásica 5’  3’ substitui o fragmento de RNA por DNA;
- Na fita recém sintetizada pela DNA-polimerase I, os nucleotídeos não estão
ligados através da ligação fosfodiéster, para que isso ocorra, há a necessidade
da enzima DNA ligase (ATP ou NAD+
)

20. A REPLICAÇÃO EM CONCERTO
- As fitas de DNA são separadas pela ação da helicase e mantidas separadas
pelas SSB. A enzima topoisomerase sempre vai à frente retirando os
superenrolamentos formados com a abertura da dupla hélice;
- A primase sintetiza o primer na fita líder e logo após a DNA-polimerase III
(HOLOENZIMA – 10 subunidades) inicia a síntese da fita líder, posteriormente
a primase sintetiza o primer na fita tardia;
- Em seguida a DNA-polimerase III inicia a síntese da fita tardia, contudo como
é uma fita tardia, há a necessidade da colocação de vários primers
[“ativadores”] para a que DNA-polimerase III consiga estender a cadeia
(formação dos fragmentos de DNA);

21. - Ambas as fitas apresentam trecho de RNA (primer), estes são retirados pela
ação da DNA-polimerase I e as extremidades dos trechos de DNA sintetizados
são unidas pela ligação fosfodiéster através da DNA ligase (gasto de ATP);
REPLICAÇÃO – DNA POLIMERASE III
- Holoenzima: constituída por duas regiões de núcleo catalítico e cada núcleo é
responsável pela síntese de uma das fitas de DNA (associação e dissociação
das subunidades ALFA, permitindo que cada parte sintetize uma fita);
- O núcleo catalítico é dividido em unidades ALFA (atividade polimerásica),
EPSON (atividade exonucleásica) e TETA (montagem e estabilização do
núcleo);
- Apenas um dos grupos associa-se a um grupo de proteínas denominadas de
complexo GAMA associado à síntese da fita descontínua;
- A DNA-polimerase III é também a enzima que apresenta maior
PROCESSIVIDADE (conferida pela subunidade BETA), pois ela envolve o
duplex das fitas duplas;
REPLICAÇÃO DNA

22. - Para que haja replicação, há a necessidade das forquilhas de replicação que
são bidirecionais, isso implica que ambas as fitas são líderes e tardias,
dependendo do sentido em que ocorre a forquilha;
- Em células procarióticas a origem de replicação pode ser ativada mais de
uma vez durante o ciclo celular (não ocorrendo em organismos eucarióticos),
isso se deve ao fato de que as células filhas já herdam o DNA replicado;
- Nas células procarióticas, a síntese bidirecional, as forquilhas bidirecionais e a
replicação das células em crescimento rápido “reiniciam” a replicação antes do
término da primeira réplica, ou seja, as células filhas recebem o DNA
parcialmente replicado;
- Contudo, o “reinicio” só ocorre quando as células replicam-se em condições
ótimas e o controle é realizado em determinados sítios que apresentam curtas
sequências de DNA através da metilação das bases (hemimetilação – uma
fita metilada e a outra não impedindo a replicação)
- O término da replicação em procariotos, deve-se ao fato de que na região
oposta a ORI é encontrada uma série de seqüências que sinalizam o final da
replicação (replicação bidirecional);

23. TÉRMINO DA REPLICAÇÃO EM PROCARIOTOS
- Regiões denominadas Ter distantes 180º da origem de replicação são
reconhecidas pela proteína Tus, esta se posiciona sobre as Ter e inibe a ação
da helicase;
- Com o término da replicação, ocorre o entrelaçamento (concatenamento)
dos cromossomos, realizado pela topoisomerase IV;
- Em eucariotos superiores a replicação do material genético depende de
múltiplos pontos de origem ao longo do cromossomo, estes são denominados
replicons (a replicação inicia simultaneamente em todos os cromossomos,
aumentando a velocidade e o processo);

24. - QUINASES impedem que o DNA comece a se replicar antes do final da
replicação nos replicons;
- Deve-se lembrar que em eucariotos existe um arranjo complexo de
polimerases e três estão diretamente envolvidas na replicação do DNA nuclear
(ALFA, DELTA e EPSON), sendo que a polimerase GAMA esta envolvida no
DNA mitocondrial;
CARACTERÍSTICAS DAS DNA-POLIMERASES
- DNA-polimerase ALFA: envolvida na síntese do “primer” e polimeriza entre
20-30 nucleotídeos (BAIXA PROCESSIVIDADE);
- DNA-polimerase DELTA: altamente processiva e sintetiza a fita líder após
um processo denominado troca de polimerase;
- DNA-polimerase EPSON: altamente processiva sintetizando a fita tardia;
DIFERENÇAS NA SÍNTESE DE DNA EM PROCARIOTOS X EUCARIOTOS
- Procariotos: O primer é sintetizado pela primase, após sua colocação, a fita
líder e a fita tardia são sintetizadas pela DNA-polimerase III;
- Eucariotos: O primer é sintetizado pela DNA-polimerase ALFA e sofre o
adicionamento de alguns desoxiribonucleotídeos, a DNA-polimerase ALFA é
então substituída pela DNA-polimerase DELTA que sintetiza a fita líder. A fita
tardia é sintetizada pela DNA-polimerase EPSON;

25. - A alta processividade das DNA-polimerase DELTA e EPSON é conferida por
grampos deslizantes (não são subunidades fixas das enzimas);
- Os grampos deslizantes são denominados de PCNA (proteína circular que
“anela” no duplex de DNA para marcar o octâmero de histonas);
- Após a DNA-polimerase ALFA sintetizar um pequeno trecho, uma proteína
pouco conservada denominada de carregadora de grampo, reconhece o trecho
de DNA recém sintetizado e insere o grampo (PCNA), este marca o local da
DNA-polimerase EPSON ou DELTA;
TÉRMINO DA REPLICAÇÃO EM EXTREMIDADES LINEARES
- Eucariotos não apresentam sítios de terminação, pois os cromossomos são
lineares (extremidades formadas por inúmeras repetições ticam em TG). Após
a remoção dos primers e da ligação dos fragmentos da fita tardia, um dos
cromossomos filhos tende a ter a extremidade 3’em fita simples (altamente
suscetível a ataques químicos e biológicos);

26. - Atividade polimerásica (5’  3’) e atividade exonucleásica (5’  3’ ou 3’ 
5’);
- Por conta da fita tardia, que gera fragmentos, a cada replicação, o
cromossomo é encurtado, impedindo a transmissão completa do material
genético;
TÉRMINO DA REPLICAÇÃO EM EXTREMIDADES LINEARES
- A maioria das repetições é de fita dupla (replicadas normalmente), entretanto
a do último fragmento de Okasaki faz com que na extremidade de uma das
fitas fique simples (utilizada pela enzima telomerase [ribonucleoproteína 
RNA + proteína] que não necessita de um primer exógeno);
- O complemento RNA possui uma sequência complementar a dos telômeros
servindo como primer molde para a adição das sequências teloméricas na
extremidade 3’ do cromossomo;

27. - A inibição da telomerase para de realizar a extensão quando proteínas
especializadas ligam-se nas regiões simples da fita e atuam como inibidores da
telomerase (inibidores fracos da telomerase);
- Quanto maior/menor o número de repetições, maior/menor será o número de
proteínas inibitórias da telomerase (replicação telomérica interrompida);
- Após a formação de um órgão ou tecido a telomerase é desativada (tecidos
em formação [telomerase ativa], tecidos formados [telomerase inativa]);
- Tecidos com reposição celular a telomerase continua inativa e espécies com
maior tempo médio de vida, apresentam menor redução telomérica a cada
divisão celular;
- Todavia, células como neurônios e células do músculo cardíaco envelhecem
sem que o comprimento dos seus telômeros diminua (tecidos que não
sofrem mitose);
- Embriões, células troncos e células cancerosas apresentam telomerase ativa
e são alvos para diversos estudos.