Conference about Radiobiology at UniRitter University. Porto Alegre (Brazil), June 17, 2017. How human cells repair DNA damages.

1. Radiobiologia
Palestrante: Dr. Grégory Svetlichny
g.svetlichny@hotmail.fr

2. SUMÁRIO
•Histórico das descobertas sobre o DNA
•Origem dos danos ao DNA e resposta celular
•Danos provocados por agentes mutagênicos físicos
•Consequências biológicas das radiações ionisantes
•Mecanismos de reparo do DNA
•Animais e câncer
•Inibidores de reparo do DNA
•Perspectivas futuras de tratamento

3. “A informação genética que controla a forma
como os seres humanos são moldados circula
pelos nossos corpos há centenas de milhares de
anos. Ela está constantemente sujeita a injúrias
causadas pelo ambiente, porém permanece
surpreendentemente intacta.”
Tomas Lindahl, Paul Modrich e Aziz Sancar (prêmio Nobel de
Química em 2015 por terem mapeado e explicado como a célula
repara seu DNA e protege sua informação genética)
INTRODUÇÃO

4. (Ljungman, 2000)
1920 1930 19501940 1970 1980 1990 20001960
Raio X causa
mutações
Celulas se
recuperam
de UV
Primeiro
mecanismo de
recuperação
celular:
fotorreativação
- Estrutura
do DNA
- UV inibe
replicação
- UV gera
dímeros de
pirimidina
- UV inibe
transcrição
- Reparo de
dímeros
- Recombinação
- Mecanismo de
reparo BER
- Resposta SOS
- Erro de
combinação
- Proteína p53
Mecanismos
de reparo
NHEJ, TCR
e NER
- Erro de
combinação e
câncer
- Camundongos
knock-out
- Ligacão entre
envelhecimento
e reparo de DNA
- TLS
- DDR previne
tumorigenese
DESCOBERTAS SOBRE O DNA

5. ORIGEM DOS DANOS AO DNA E
RESPOSTA CELULAR
Metabolismo
celular
Virus Radiações/
Calor
Agentes
químicos
Erros de
replicação
Apoptose
Reparo
do DNA
Senescência
Regulação do
ciclo celular
DANOS AO DNA

6. TIPOS DE RADIAÇÕES IONISANTES E
NÃO-IONISANTES
Radiações ionizantes:
Raios X de alta energia
Raios γ
Nêutrons
Partículas α / β
Radiações não-ionisantes:
UVA e UVB

7. TIPOS DE RADIAÇÕES UV
Raios
cosmicos
Raios
γ
Raios
X
Raios
UV
Luz
visível
Raios
IV
Ondas
rádio
Radiações ionisantes Radiações solares
Comprimento de onda (nm)
Radiações absorvidas
pelo ozônio
Radiações terrestres
(Instituto Curie)

8. FOTOREAÇÕES DAS RADIAÇÕES UV
NO DNA
CromóforosRadiações Reações Fotoprodutos
Visível
DNA
Agentes
fotodinâmicos
Exogeno
(Psoraleno)
Adutos
Pso<>Pir
Dimerização Dímeros de timina
Pontes Pir-Pir
Modificação e
oxidação de
bases, quebra
de fita
simples,
pontes DNA-
proteínas
Tipo I
Tipo II
(Instituto Curie)

9. DANOS DAS RADIAÇÕES UV NO DNA
Reparo das fotolesões induzidas na pele pelas radiações UV
(Instituto Curie)

10. DANOS RADIOINDUZIDOS NO DNA
Proteína
Ponte DNA-proteína
Quebra de
fita dupla
Quebra de
fita simples
Ponte
intrafita
Modificação
de base
(oxidação/
ionização)
Sítio
abásico
(desaminação)
Radiação
ionizante
Efeito direto (30-40 %)
por excitação ou ionização
Efeito indireto (60-70 %)
pelos radicais livres da
radiólise da água
Ponte
interfita

11. DANOS
ENDÓGENOS
(por célula e por dia)
RADIOINDUZIDOS
(por Gray)
Quebras de fita simples 10.000 – 55.000 1000
Perdas de bases 12.600 ?
Danos de bases 3200 2000
Quebras de fita dupla 8 40
Pontes DNA-DNA 8 30
Ponte DNA-Proteína algumas 150
Lesões múltiplas
localizadas
algumas ?
DANOS ENDÓGENOS E
RADIOINDUZIDOS NO DNA

12. QUEBRAS DE FITA DUPLA
RADIOINDUZIDAS
Quebras de fita dupla são radioinduzidas
linearmente com a dose de radiação
(Instituto Curie)

13. CONSEQUÊNCIAS BIOLÓGICAS DAS
RADIAÇÕES IONISANTES NO DNA
Radiação
ionisante
Efeitos diretos
e indiretos
Danos
ao DNA
Danos da
membrana e
do citoplasma Parada do
ciclo celular
Mutações
Genoma
intato
CâncerApoptose
Sobrevida
e reparo
do DNA
Sinalizaçãodosdanos
(Instituto Curie)

14. MECANISMOS DE REPARO DO DNA
Específicos e dependem do tipo de enzimas
envolvidas. O mecanismo de reparo mobilizado
depende:
 Do tipo de dano que está em jogo
 Da célula ter entrado ou não em apoptose
 Da fase do ciclo celular em que a célula está
(fora ou durante o período de replicação)

15. Reparo por reversão direta dos danos que
envolvem poucas enzimas e levam a uma
restauração imediata das ligações químicas.
Caso da quebra de fita simples.
Reparo por excisão de bases.
Reparo por excisão de nucleotídeos.
REPAROS FORA DA REPLICAÇÃO

16. REVERSÃO DE QUEBRA DE FITA SIMPLES
Dano sem perda mas com alteração química de base
Enzima DNA ligase
Reversão do dano com regeneração da base original
Reparo raro: maioria das lesões ao DNA são
irreversíveis.
Reparo unicamente bioquímico: não leva em conta
a informação inicial do DNA.

17. NUCLEOTÍDEO: ESTRUTURA QUÍMICA
Nucleotídeo
Açucares
Bases nitrogenadas
Pirimidinas
Purinas
Bases
nitrogenadas
Açucar
Ribose (RNA) Desoxirribose (DNA)
Citosina Uracila (RNA) Timina (DNA)
Guanina Adenina
Grupamento
fosfato

18. Para nucleotídeos desaminados. Supressão
das bases anormais e reparo do sítio
abásico.
Glicosilase corta a ligação glicosídica entre
a base anormal e o desoxirribose
extração da base só = sítio abásico.
Existe numerosas glicosilases, e cada uma
reconhece um tipo de base modificada.
Endonuclease corte a ligação fosfodiéster
adjacente ao sítio abásico.
Polimerase sintetisa o fragmento de DNA
que falta.
Ligase faz a ligação fosfodiéster faltando.
REPARO POR EXCISÃO DE BASES
(Produção Mariana RUIZ, LadyofHats)

19. REPARO POR EXCISÃO DE NUCLEOTÍDEOS
Para remoção de nucleotídeos em bloco (até 30), caso de danos
volumosos (distorção da hélice / dimerização de timidina (raios UV) /
quebras em fitas simples). No homen, > 30 enzimas implicadas.
Há 2 vias de reparo:
- Acoplada à transcrição para o reparo rápido dos danos na fita
transcrita e afetando genes que estão sendo transcridos.
- Global para o reparo lento do DNA no caso dos genes que não estão
sendo transcridos.
Há 3 níveis de hierarquização:
1o: reparo preferencial e rápido da fita transcrita.
2o: reparo da fita não transcrita.
3o: reparo lento das regiões não ativas.

20. REPARO POR EXCISÃO DE NUCLEOTÍDEOS
Reparo ocorre em 4 etapas
1 - Busca e reconhecimento de danos
por enzimas específicas.
2 - Abertura da dupla hélice pela
helicase no lugar do dano.
3 - Corte de cada lado do dano pelas
endonucleases e eliminação do
fragmento de DNA danificado.
4 - Síntese do novo fragmento pela
polimerase e junção pela ligase.
a
b
c
d
e

21. Reparo de pareamento incorreto de bases (sistema “Mut”)
 Correção de nucleotídeos pareados erradamente por
causa de uma lesão (desaminação por exemplo).
 Sistema acoplado à replicação, reconhece a fita recem
sintetizada do DNA graças às metilações das adeninas
presentes somente na antiga fita.
 Reparo depende dos genes “Mut” que corrigem os erros
de pareamento.
REPARO DOS DANOS REPLICATIVOS

22. Pareamento incorreto
Fita antiga
Fita nova
Enzimas "Mut"
Endonuclease
helicase,
exonuclease
DNA polimerase
e ligase
1a enzima Mut percorre o DNA e
reconhece os pareamentos incorretos.
Reconhecimento da fita metilada pela
2a Mut (endonuclease). Corte da fita
não metilada pela 3a Mut.
Desenrolamento progressivo do
fragmento de DNA recem sintetizado
por uma helicase.
Resíntese por uma DNA polimerase.
Ligação do novo fragmento por uma
DNA ligase.
SISTEMA “Mut”

23. Resposta (in)fiel: polimerases translesionais têm a
capacidade, ao contrário das polimerases replicativas,
de inserir nucleotídeos em frente a um dano. Esse
reparo completa a replicação mesmo na presência de
danos, mas pode incorporar mutações!!!
VIAS DE TOLERÂNCIA DOS DANOS
AO DNA

24. TOLERÂNCIA DOS DANOS POR SÍNTESE
TRANSLESIONAL
Agentes genotóxicos
(UV, RI)
Dano ao DNA
Bloqueio da
replicação
Síntese
translesional
Fiel Errada

25. REPARO POR RECOMBINAÇÃO HOMÓLOGA
Quebra de fita dupla  Dano muito deletério para a célula
Mecanismo predominante nas leveduras e altamente conservado
durante a evolução
Via principal nas fases S e G2 do ciclo celular  Necessidade
da sequência homóloga de DNA
1a etapa: Reconhecimento do dano e resecção
2a etapa: Invasão de uma sequência homóloga e síntese de DNA

26. (Finn et al, 2012; Krogh & Symington, 2004; San Filippo et al, 2008; Symington & Gautier, 2011)
Quebra de
fita dupla
Resecção 5’-3’
Invasão de fita
Elongação
Sinalização
para
recrutamento
de enzimas
DNA homólogo
Polimerase
Complexo MRN
Endonuclease
Recombinase: procura
da sequência de
homologia
Reparo homólogo
REPARO POR RECOMBINAÇÃO HOMÓLOGA

27. REPARO POR RECOMBINAÇÃO NÃO
HOMÓLOGA
Predominante nas células humanas
Processo não fiel mas eficaz para assegurar a
sobrevivência celular após irradiação
Predominante durante a fase G1
Reparo mais rápido e simples do que por
recombinação homóloga

28. REPARO POR RECOMBINAÇÃO NÃO
HOMÓLOGA
(Walker, Corpina et al. 2001)
Quebra de
fita dupla
Radiação ionisante
Recrutamento
do dimero
Ku70/Ku80
Recrutamento
de DNA-PKs
e Artemis
Ligação
Reconhecimento
do dano
Aproximação das
extremidades

29. ANIMAIS E CÂNCER
5% dos elefantes e 25% dos humanos morrem de
câncer. Elefantes e humanos têm um alarme, a
proteína p53, que detecta os danos e leva ao conserto
da célula ou à morte dela. Mas enquanto os humanos
têm 2 cópias do gene p53, elefantes têm 38!!!
Bactéria Deinococus radiodurans: organismo mais
resistente conhecido. Resiste a dosagens de radiação γ
mil vezes > que as letais para seres humanos. Alta
resistência vem das enzimas conseguirem taxas
rápidas e incomuns de reparo. Na fase de multiplição,
cada bactéria contém de 8 a 10 cópias do genoma!!!
(Joshua D. Schiffman et al., 2016)

30. INIBIDORES DE REPARO DO DNA
(Sage, CNRS / Curie, 1997)
• Pareamento incorreto de bases
• Excisão de bases ou de nucleotídeos
• Recombinação homóloga
• Recombinação não homóloga
Inibição possível bloqueando a incorporação dos
nucleotídeos em diferentes níveis:

31. INIBIDORES DE REPARO DO DNA
(Sage, CNRS / Curie, 1997)
• Metil transferase bloqueada pela O6-benzilguanina
• Cinases bloqueadas pela Wortmanina e pela cafeína
• Polimerases (α e β) bloqueadas pela afidicolina e
pela dideoxitimidina
Inibição também possível por inibição das
enzimas implicadas nos diferentes reparos:

32. • Adaptar melhor as doses de radiodiagnóstico e
radioterapia assim como os campos de radiação
• Achar agentes químicos que melhoram a
radioproteção das células sãs
• Definir a radiosensibilidade intrínseca dos tumores
e dos pacientes
• Entender melhor a grande resistência às radiações
ionisantes de alguns tumores
FUTURAS PERSPECTIVAS DE TRATAMENTO
Um melhor conhecimento das consequências biológicas
da radioterapia a curto e longo prazos permite:
(Instituto Curie)

33. OBRIGADO PELA ATENÇÃO!!!