Aminoácidos, peptídeos e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
Funções das proteínas <ul><li>Vagalume </li></ul><ul><ul><li>Enzima luciferase quebra a proteína luciferina na presença de...
Características químicas dos aminoácidos Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
Os aminoácidos <ul><li>Os aminoácidos presentes nas proteínas são  isômeros L </li></ul><ul><ul><li>A biologia é canhota <...
Grupo R apolar e alifáticos <ul><li>Aminoácidos apolares e hidrofóbicos </li></ul><ul><li>Ligações de Van der Waals </li><...
Grupo R aromáticos <ul><li>Aminoácidos  hidrofóbicos </li></ul><ul><li>Tirosina pode formar pontes de hidrogênio com a águ...
Grupos R polares, não carregados <ul><li>Solubilidade intermediária em água </li></ul><ul><li>Serina e treonina </li></ul>...
Grupos R carregados <ul><li>Aminoácidos básicos </li></ul><ul><ul><li>Carga positiva </li></ul></ul><ul><ul><li>Lisina , s...
Aminoácidos incomuns <ul><li>Modificações  pós -traducionais </li></ul><ul><ul><li>4-hidroxiprolina </li></ul></ul><ul><ul...
pH e pKa <ul><li>Constantes de dissociação dependem do pH do meio e são diferentes para diferentes moléculas </li></ul><ul...
Aminoácidos são ionizáveis <ul><li>Substâncias  anfóteras : possuem natureza dual </li></ul><ul><li>Podem funcionar assim ...
Titulação de um aminoácidos <ul><li>pKa : tendência de um grupo fornecer um próton ao meio </li></ul><ul><li>Aminoácidos p...
Curvas de titulação predizem a carga elétrica dos aminoácidos <ul><li>Alguns aminoácidos podem ter átomos ionizáveis també...
Peptídeos e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
Polipeptídeo >Insulina [Homo sapiens] MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEG...
Peptídeos tbm são ionizáveis <ul><li>Ou seja, possuem curva de titulação característica </li></ul><ul><li>Funcionam em fai...
Número de resíduos por proteína
Uso de aminoácidos <ul><li>Varia bastante entre as proteínas </li></ul><ul><li>Não permite predizer com precisão o comport...
Proteínas com outros grupos químicos <ul><li>Adicionados pós-traducionalmente </li></ul>
Trabalhando com proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
Proteínas podem ser separadas e purificadas <ul><li>Sabendo que a célula possui milhares de proteínas, como  purificar  um...
Cromatografia por troca iônica <ul><li>Polímero carregado negativamente </li></ul><ul><ul><li>Proteínas positivas ligam ao...
Cromatografia por exclusão de tamanho <ul><li>Grânulos porosos na matriz seguram as moléculas menores </li></ul><ul><li>Mo...
Cromatografia de afinidade <ul><li>Adiciona-se à matriz da coluna algum tipo de  molécula ligante  da molécula de interess...
Eletroforese -- Histórico <ul><li>1952, Markham and Smith </li></ul><ul><ul><li>Ao estudarem hidrólise de RNA percebem que...
Eletroforese <ul><li>Movimento de partículas dispersas num fluído sob influência de um campo elétrico uniforme </li></ul><...
Eletroforese, etapas <ul><li>Preparação do gel </li></ul><ul><li>Aplicação das amostras </li></ul><ul><li>Eletroforese </l...
Preparação do gel Horizontal X Vertical Agarose X Poliacrilamida
Aplicação das amostras Definição do mapa das amostras por canaleta
Corrida do gel <ul><li>Aplicação do campo elétrico </li></ul><ul><li>Fonte elétrica gera fluxo de íons através da solução ...
Coloração das moléculas <ul><li>Prata </li></ul><ul><ul><li>Gel SDS-PAGE </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>PoliAcrilamide Gel...
 
Eletroforese de um resultado de cromatografia
O marcador de peso molecular <ul><li>Comprado de uma empresa </li></ul><ul><ul><li>Possui proteínas de peso molecular bem ...
Geis bidimensionais <ul><li>Corre-se o gel normalmente em uma dimensão... E depois vira-se-o e corre-se em outra dimensão ...
Proteínas não separadas podem ser quantificadas <ul><li>Deve-se saber qual o substrato que a enzima usa </li></ul><ul><li>...
Estrutura primária das proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
Níveis estruturais das proteínas
As estruturas primárias das proteínas são conhecidas <ul><li>Para todos os  genomas sequenciados , conhece-se a estrutura ...
Sequenciamento de peptídeos <ul><li>Degradação de Edman </li></ul><ul><ul><li>Marca e remove apenas o resíduo N-terminal <...
Produção de peptídeos <ul><li>Purificação a partir de tecidos </li></ul><ul><li>Engenharia genética </li></ul><ul><li>Sínt...
Alinhamento de sequências <ul><li>Os organismos possuem, em grande medida, as mesmas proteínas ( ortólogas ) </li></ul><ul...
Evolução molecular <ul><li>Quanto  mais similares  as sequências das proteínas dos organismos, mais próximos eles são evol...
Árvore molecular da vida
Conclusões <ul><li>Diferentes características químicas das cadeias laterais dos aminoácidos definem características de pep...
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Aula2 lehn03 aminoácidos_peptídeosproteínas

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As proteínas são unidades poliméricas feitas por aminoácidos.

Existem 20 aminoácidos diferentes cujas propriedades químicas de suas cadeias laterais são responsáveis por esta diferença e modificam as interações fisico-químicas das proteínas.

Os aminoácidos podem ser representados por sequências de uma ou três letras.

A estrutura primária de uma proteína é dada pela sequência de aminoácidos que a compõem.

A função bioquímica das proteínas pode ser estudada com detalhe.

O estudo das proteínas passa primeiro pela purificação delas através de técnicas de cromatografia.

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Aula2 lehn03 aminoácidos_peptídeosproteínas

  1. 1. Aminoácidos, peptídeos e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
  2. 2. Funções das proteínas <ul><li>Vagalume </li></ul><ul><ul><li>Enzima luciferase quebra a proteína luciferina na presença de ATP </li></ul></ul>
  3. 3. Características químicas dos aminoácidos Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
  4. 4. Os aminoácidos <ul><li>Os aminoácidos presentes nas proteínas são isômeros L </li></ul><ul><ul><li>A biologia é canhota </li></ul></ul><ul><li>Glicina não tem isomeria óptica </li></ul>Carbono alfa
  5. 5. Grupo R apolar e alifáticos <ul><li>Aminoácidos apolares e hidrofóbicos </li></ul><ul><li>Ligações de Van der Waals </li></ul><ul><li>Ala, Val, Leu, Iso </li></ul><ul><ul><li>Interações hidrofóbicas </li></ul></ul><ul><li>Gly; menor aminoácido </li></ul><ul><li>Met </li></ul><ul><ul><li>Possui átomo de enxofre </li></ul></ul><ul><li>Pro </li></ul><ul><ul><li>Iminoácido, menor flexibilidade estrutural </li></ul></ul>
  6. 6. Grupo R aromáticos <ul><li>Aminoácidos hidrofóbicos </li></ul><ul><li>Tirosina pode formar pontes de hidrogênio com a água </li></ul><ul><li>Modificações pós- traducionais </li></ul><ul><ul><li>Fosforilação do OH da tirosina </li></ul></ul><ul><li>Fenilalanina </li></ul><ul><ul><li>Mais apolar </li></ul></ul>
  7. 7. Grupos R polares, não carregados <ul><li>Solubilidade intermediária em água </li></ul><ul><li>Serina e treonina </li></ul><ul><ul><li>Grupos hidroxil </li></ul></ul><ul><li>Asparagina e glutamina </li></ul><ul><ul><li>Grupo amida </li></ul></ul><ul><li>Cisteína </li></ul><ul><ul><li>Grupo sulfidril </li></ul></ul><ul><ul><li>Ligações dissulfeto </li></ul></ul>
  8. 8. Grupos R carregados <ul><li>Aminoácidos básicos </li></ul><ul><ul><li>Carga positiva </li></ul></ul><ul><ul><li>Lisina , segundo grupo amino </li></ul></ul><ul><ul><li>Arginina , grupo guanidina </li></ul></ul><ul><ul><li>Histidina , grupo aromático imidazol </li></ul></ul><ul><li>Aminoácidos ácidos </li></ul><ul><ul><li>Carga negativa </li></ul></ul><ul><ul><li>Possuem segundo grupo ácido carboxílico </li></ul></ul>
  9. 9. Aminoácidos incomuns <ul><li>Modificações pós -traducionais </li></ul><ul><ul><li>4-hidroxiprolina </li></ul></ul><ul><ul><li>5-hidroxilisina </li></ul></ul><ul><ul><li>6-N-metil-lisina </li></ul></ul><ul><ul><li>Gama-carboxiglutamato </li></ul></ul><ul><ul><li>Fosforilação de resíduos </li></ul></ul><ul><li>Selenocisteína </li></ul><ul><ul><li>Selênio ao invés de enxofre na Cys </li></ul></ul><ul><ul><li>É adicionado durante a tradução por mecanismo específico e regulado </li></ul></ul>
  10. 10. pH e pKa <ul><li>Constantes de dissociação dependem do pH do meio e são diferentes para diferentes moléculas </li></ul><ul><li>Ionização </li></ul><ul><li>< pH; > [H] + estado não-ionizado </li></ul>
  11. 11. Aminoácidos são ionizáveis <ul><li>Substâncias anfóteras : possuem natureza dual </li></ul><ul><li>Podem funcionar assim como ácidos ou bases </li></ul><ul><ul><li>Doam ou recebem prótons </li></ul></ul>
  12. 12. Titulação de um aminoácidos <ul><li>pKa : tendência de um grupo fornecer um próton ao meio </li></ul><ul><li>Aminoácidos podem perder até 2 prótons para o meio </li></ul><ul><li>Conclusão : a função das proteínas depende do pH ao qual estão submetidas </li></ul>
  13. 13. Curvas de titulação predizem a carga elétrica dos aminoácidos <ul><li>Alguns aminoácidos podem ter átomos ionizáveis também em sua cadeia lateral </li></ul>
  14. 14. Peptídeos e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
  15. 15. Polipeptídeo >Insulina [Homo sapiens] MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN
  16. 16. Peptídeos tbm são ionizáveis <ul><li>Ou seja, possuem curva de titulação característica </li></ul><ul><li>Funcionam em faixas de pH ótimas </li></ul>
  17. 17. Número de resíduos por proteína
  18. 18. Uso de aminoácidos <ul><li>Varia bastante entre as proteínas </li></ul><ul><li>Não permite predizer com precisão o comportamento molecular da molécula </li></ul>
  19. 19. Proteínas com outros grupos químicos <ul><li>Adicionados pós-traducionalmente </li></ul>
  20. 20. Trabalhando com proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
  21. 21. Proteínas podem ser separadas e purificadas <ul><li>Sabendo que a célula possui milhares de proteínas, como purificar uma única delas? </li></ul><ul><ul><li>Basta selecionar por propriedade </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>Tamanho, carga e propriedades de ligação </li></ul></ul></ul><ul><li>Obter o extrato bruto </li></ul><ul><ul><li>“ correr” em cromatografia de coluna </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>Fase estável (matriz) </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Fase móvel (solução com tampão) </li></ul></ul></ul><ul><ul><li>Coluna maior permite maior resolução na separação </li></ul></ul>
  22. 22. Cromatografia por troca iônica <ul><li>Polímero carregado negativamente </li></ul><ul><ul><li>Proteínas positivas ligam ao polímero e demoram mais a ser eluídas da coluna </li></ul></ul><ul><li>Afinidade da proteína é definido também pelo pH </li></ul>
  23. 23. Cromatografia por exclusão de tamanho <ul><li>Grânulos porosos na matriz seguram as moléculas menores </li></ul><ul><li>Moléculas grandes não entram nos poros e são eluídas primeiro </li></ul>
  24. 24. Cromatografia de afinidade <ul><li>Adiciona-se à matriz da coluna algum tipo de molécula ligante da molécula de interesse </li></ul><ul><li>Molécula ligadora de ATP; adiciona-se ATP à matriz </li></ul><ul><li>Elui-se com solução de ATP </li></ul>
  25. 25. Eletroforese -- Histórico <ul><li>1952, Markham and Smith </li></ul><ul><ul><li>Ao estudarem hidrólise de RNA percebem que moléculas de diferentes estruturas têm sua mobilidade diferenciada quando aplicadas num papel e submetidas a um campo elétrico </li></ul></ul><ul><li>1955, Smithies </li></ul><ul><ul><li>Géis de amido funcionam bem para separar proteínas do soro humano </li></ul></ul><ul><li>1967, Loening </li></ul><ul><ul><li>Géis de acrilamida com maior resolução e permitem separar ainda moléculas grandes de DNA </li></ul></ul><ul><li>1980, Schwartz and Cantor </li></ul><ul><ul><li>Eletroforese em campo pulsado separa fragmentos enormes </li></ul></ul><ul><li>É hoje impossível imaginar um laboratório de biomol sem eletroforese acontecendo a todo instante... </li></ul>Vou ali correr um gelzinho e já volto Tenho que ir senão vou perder meu gel
  26. 26. Eletroforese <ul><li>Movimento de partículas dispersas num fluído sob influência de um campo elétrico uniforme </li></ul><ul><li>DNA, carga negativa </li></ul><ul><ul><li>Tem tendência a se dirigir ao polo positivo quando sujeito a um campo elétrico </li></ul></ul><ul><li>Serve para separar moléculas por tamanho /carga elétrica </li></ul><ul><ul><li>Proteína deve ser desnaturada com detergente (SDS) </li></ul></ul><ul><li>Técnica utilizada à exaustão em trabalhos de biologia molecular </li></ul>
  27. 27. Eletroforese, etapas <ul><li>Preparação do gel </li></ul><ul><li>Aplicação das amostras </li></ul><ul><li>Eletroforese </li></ul><ul><li>Coloração </li></ul><ul><li>Análise dos resultados </li></ul>
  28. 28. Preparação do gel Horizontal X Vertical Agarose X Poliacrilamida
  29. 29. Aplicação das amostras Definição do mapa das amostras por canaleta
  30. 30. Corrida do gel <ul><li>Aplicação do campo elétrico </li></ul><ul><li>Fonte elétrica gera fluxo de íons através da solução tampão </li></ul><ul><li>Terminais positivo e negativo </li></ul><ul><li>Tempo adequado, senão o DNA sai do gel </li></ul>
  31. 31. Coloração das moléculas <ul><li>Prata </li></ul><ul><ul><li>Gel SDS-PAGE </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>PoliAcrilamide Gel Electrophoresis </li></ul></ul></ul><ul><ul><li>Melhor resolução </li></ul></ul><ul><li>Coomassie blue, etc </li></ul><ul><li>Brometo de etídio </li></ul><ul><ul><li>Agente intercalante do DNA </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>Cancerígeno! </li></ul></ul></ul><ul><ul><li>Composto fluorescente à luz UV </li></ul></ul><ul><ul><li>Gel de agarose </li></ul></ul>
  32. 33. Eletroforese de um resultado de cromatografia
  33. 34. O marcador de peso molecular <ul><li>Comprado de uma empresa </li></ul><ul><ul><li>Possui proteínas de peso molecular bem conhecido </li></ul></ul><ul><li>Permite saber o peso molecular da(s) proteína(s) presente(s) numa amostra </li></ul>
  34. 35. Geis bidimensionais <ul><li>Corre-se o gel normalmente em uma dimensão... E depois vira-se-o e corre-se em outra dimensão </li></ul><ul><li>Cada ponto representa aproximadamente uma proteína original presente na amostra </li></ul><ul><ul><li>Maiores géis dão maiores resolução </li></ul></ul>
  35. 36. Proteínas não separadas podem ser quantificadas <ul><li>Deve-se saber qual o substrato que a enzima usa </li></ul><ul><li>Deve-se poder medir o produto da ação enzimática </li></ul><ul><li>Uma unidade de enzima digere 1 μ mol de substrato por minuto a 25ºC </li></ul>
  36. 37. Estrutura primária das proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
  37. 38. Níveis estruturais das proteínas
  38. 39. As estruturas primárias das proteínas são conhecidas <ul><li>Para todos os genomas sequenciados , conhece-se a estrutura primária de todas as proteínas para este organismo </li></ul><ul><li>As pontes dissulfeto podem se formar entre diferentes cadeias protéicas </li></ul><ul><ul><li>E principalmente dentro da mesma </li></ul></ul>
  39. 40. Sequenciamento de peptídeos <ul><li>Degradação de Edman </li></ul><ul><ul><li>Marca e remove apenas o resíduo N-terminal </li></ul></ul><ul><li>Método ineficiente , permite sequenciamento de pequenas porções das moléculas </li></ul><ul><li>Sequenciamento do RNAm é muito mais simples e preciso; permite sequenciar proteínas enormes – como a titina </li></ul>
  40. 41. Produção de peptídeos <ul><li>Purificação a partir de tecidos </li></ul><ul><li>Engenharia genética </li></ul><ul><li>Síntese química direta </li></ul>
  41. 42. Alinhamento de sequências <ul><li>Os organismos possuem, em grande medida, as mesmas proteínas ( ortólogas ) </li></ul><ul><ul><li>Derivam do ancestral comum entre os organismos </li></ul></ul><ul><li>O alinhamento permite que identifiquemos as porções mais importantes ( conservadas ) da proteína </li></ul>
  42. 43. Evolução molecular <ul><li>Quanto mais similares as sequências das proteínas dos organismos, mais próximos eles são evolutivamente </li></ul>
  43. 44. Árvore molecular da vida
  44. 45. Conclusões <ul><li>Diferentes características químicas das cadeias laterais dos aminoácidos definem características de peptídeos e proteínas </li></ul><ul><li>Os resíduos de aminoácidos são ligados às centenas ou milhares para formar peptídeos e proteínas </li></ul><ul><li>As proteínas podem ser modificadas pós-traducionalmente </li></ul><ul><li>As proteínas podem ser separadas por carga, tamanho e afinidade e assim estudadas isoladamente – cromatografia e eletroforese </li></ul><ul><li>As proteínas podem ser sequenciadas e sua estrutura primária (seq. de aminoácidos é conhecida) </li></ul><ul><li>As sequências das proteínas são excelentes marcadores da evolução da vida na terra </li></ul>

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