Transferência de oxigênio em cultivos em frascos agitados

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ
SETOR DE TECNOLOGIA
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA
FRASCOS AGITADOS E PREPARO DE INÓCULO
Trabalho acadêmico apresentado à
disciplina Processos Fermentativos
Industriais da Universidade Federal
do Paraná.
CURITIBA
2008

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SUMÁRIO
1. CULTIVO EM FRASCOS AGITADOS.................................................................2
1.1. SOLUBILIDADE DO OXIGÊNIO GASOSO ...................................................4
1.2. DEMANDA DE OXIGÊNIO PELOS MICRORGANISMOS.............................8
1.3. EQUIPAMENTOS NECESSÁRIOS.............................................................11
1.3.1. Frascos................................................................................................11
1.3.2. Tampas................................................................................................14
1.3.3. Agitadores............................................................................................16
2. PREPARO DE INÓCULO ..................................................................................18
2.1. CONDIÇÕES DO INÓCULO .......................................................................22
2.2. INÓCULO DE LEVEDURAS........................................................................23
2.3. INÓCULO DE BACTÉRIAS.........................................................................24
2.4. INÓCULO DE FUNGOS FILAMENTOSOS .................................................26
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................29
4. ANEXOS ............................................................................................................31

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1. CULTIVO EM FRASCOS AGITADOS
Os frascos agitados são freqüentemente usados na biotecnologia. Apesar de
sua grande importância prática, muito pouco tem se estudado sobre as propriedades
e características de uma cultura agitada. Eles podem variar em volume de 25 mL até
6 L (em alguns casos podendo chegar até 60 L). Pode-se também designar como
frascos agitados tubos de ensaio de cerca de 10-25 mL e as microplacas de 120μL a
3 mL. Esses frascos podem ou não ser equipados com chicanas (também chamados
de septos ou baffles), as quais são feitas de vidro ou de plástico.
A cultura em frascos imóveis é útil para a produção de pequenas quantidades
de cultivos de fungos para serem inoculados em substratos sólidos. A vantagem
desse método frente ao cultivo sólido é a fácil detecção de contaminação por outros
microrganismos e a facilidade de determinação da biomassa. O problema desse tipo
de cultura estática é a transferência de oxigênio, pois há uma dependência na
superfície de transferência entre a fase líquida e gasosa, e por isso frascos de
Erlenmeyer de 500mL podem conter somente 100mL de meio de cultura.
Uma nova era na fermentação iniciou-se com a introdução em 1933 da
técnica de agitação de frascos por Kluyver e Perquin. Essa técnica de agitação
(chamada pelos autores de Schüttelkultur) foi desenvolvida inicialmente para cultivo
em escala laboratorial, mas logo passou também a ser utilizada em algumas
fábricas, como na fabricação de antibióticos. Na indústria, o cultivo em frascos
possibilita realizar inúmeras fermentações de uma só vez, enquanto o cultivo em
vários biorreatores ao mesmo tempo é economicamente inviável devido aos custos
do equipamento. Kennedy et al.(1994), citado por BÜCHS (2001), argumentou que
"não existe nenhuma outra forma de se fazer a otimização do meio senão em
frascos agitados simplesmente porque o número de experimentos a serem
conduzidos é muito grande. O efeito das diferentes componentes do meio é relativo,
e por isso o melhor meio obtido em frasco agitado também será o melhor meio
tanque.". Esta última afirmação tem de ser considerada com cautela, pois não se
pode pressupor que os microrganismos irão agir de uma maneira equivalentes nos
dois tipos de cultivo.
Frascos agitados são freqüentemente utilizados para a cultura de bactérias,
fungos, leveduras, e algumas células animais e vegetais. Dependendo do
microrganismo estudado, os parâmetros operacionais de um cultivo agitado podem

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influenciar significativamente os resultados. Estes tipos de interações são muitas
vezes esquecidos ou ignorados pelos pesquisadores. É preciso ter conhecimento e
controle dos fenômenos hidrodinâmicos, da transferência de gases e dos
parâmetros físicos que influenciam as culturas durante o processo de agitação. Isso
irá garantir uma reprodutibilidade e confiabilidade nos resultados obtidos na
fermentação.
Várias etapas de um processo biotecnológico podem empregar frascos
agitados, como a seleção de um tipo selvagem com uma característica específica,
melhoramento genético e mutação, desenvolvimento de cepas recombinantes,
elucidação de vias metabólicas, optimização de meios de cultivo, estabelecimento
de protocolos analíticos, e investigação das condições básicas do processo como a
estabilidade, a taxa inoculação, o pH e a temperatura ideal, o tempo de cultivo e a
avaliação dos dados cinéticos. Os frascos agitados utilizados na etapa de screening
e melhoramento do processo geralmente contêm meios líquidos complexos
baseados em fontes de carboidratos e nitrogênio (como bagaço, milhocina, melaço
de soja, entre outros). Esses substratos são consumidos em diferentes velocidades,
e esse tempo de consumo irá influenciar a manutenção das condições ótimas para o
crescimento. Materiais sólidos como cal podem ser adicionados para manter o
controle do pH e a formação de agregados celulares (como pellets). Quando
utilizados meios quimicamente definidos deve-se monitorar com mais cuidado as
variações de pH e falta de substrato.
Segundo BÜCHS (2001), pode-se supor que provavelmente mais de 90% de
todas as experiências em biotecnologia envolvem um cultivo em frascos agitados.
No entanto, o estudo da cultura nesses frascos é geralmente subestimado pelos
profissionais da área por se tratar de um experimento com equipamentos muito
simples e ser utilizado principalmente na primeira etapa de um bioprocesso.
Algumas variáveis importantes no processo de agitação são: o tipo de frasco,
a sua geometria e dimensão (volume nominal), o tamanho e o número de chicanas
(se houver), as propriedades da superfície da parede interior do frasco, o diâmetro
da órbita de agitação, volume preenchido pelo meio de cultura e a freqüência de
agitação. Os experimentos em frascos agitados muitas vezes são realizados de
forma imprecisa e sem a determinação desses parâmetros, inviabilizando a
reprodutibilidade em outros laboratórios. A determinação incorreta e o
desconhecimento dos parâmetros ideais para uma cultura em frascos agitados

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podem gerar perdas de produtividade, inóculos mal desenvolvidos, seleção de
microrganismos não-desejados, meios de cultivo inadequados, e gastos econômicos
desnecessários.
Apesar dos frascos agitados apresentarem problemas como o pequeno
controle nas transferências gasosas, na eficiência da mistura e no monitoramento
contínuo das condições, eles são valiosos para o desenvolvimento de processos.
1.1. SOLUBILIDADE DO OXIGÊNIO GASOSO
A taxa de transferência de oxigênio é de extrema importância no
desenvolvimento de um processo fermentativo industrial. Vários microrganismos
necessitam da presença de oxigênio para poder sintetizar seus produtos, e por isso
é cada vez mais necessário conhecer a respiração celular e a demanda de oxigênio
de cada espécie. As enzimas respiratórias estão todas presentes na fase aquosa,
portanto, os microrganismos podem utilizar apenas o oxigênio dissolvido, mesmo
quando eles crescem na interface ar-água. Além disso, o oxigênio é tão insolúvel
que existem somente pequenas quantidades disponíveis para as células.
Como mostra a Figura 1, o transporte da molécula de O2 precisa passar por
uma série de barreiras, formando gargalos (ou estrangulamentos) que diminuem a
transferência de oxigênio para a célula. Aquele que for o mais difícil de se transpor
será o fator que controla esse transporte. Se, por exemplo, houver uma etapa
limitante na transferência de oxigênio na interface gás-líquido, como mostra a
exclamação na figura, então o melhoramento genético do microrganismo não teria
muito efeito na produção, a não ser que o melhoramento seja com relação à via
respiratória.
O papel do oxigênio dissolvido no meio de cultivo é bastante importante no
metabolismo celular e na síntese de compostos, e isso já é bem conhecido desde a
época de Pasteur. No entanto, publicações recentes às vezes dão pouca atenção
para a questão do abastecimento de oxigênio, talvez devido à incerteza quanto à
sua classificação como um fator físico ou químico que afeta o crescimento.

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Figura 1- Barreiras no transporte de substâncias.
Fonte: BÜCHS, 2001.
O oxigênio é um gás pouco solúvel em água a 20º C e 1 atm. Nestas
condições, somente 9 ppm de oxigênio se dissolvem em água. À medida que a
temperatura é levantada, oxigênio, como qualquer outro gás, torna-se insolúvel. Por
exemplo, à 37º C, menos de 7 ppm de oxigênio são solúveis em água. A solubilidade
de oxigênio é substancialmente independente da pressão total e da presença de
outros gases. Ela é, no entanto, diretamente proporcional à pressão parcial de
oxigênio na fase gasosa. Este fato é conhecido como a lei de Henry, a qual pode ser
escrita como:
(1)
onde H' é uma constante da lei de Henry baseada na concentração molar e a
pressão parcial é expressa em atmosferas. O asterisco em C denota concentração
no líquido em equilíbrio. A solubilidade deve ser expressa como uma fração molar,
mas para gases pouco solúveis, o erro é pequeno ao se utilizar a molaridade como
proporcional à fração molar. A Lei de Henry prevê que, em uma atmosfera de
oxigênio puro, água irá dissolver cerca de cinco vezes mais que o oxigênio no ar,
onde a pressão parcial é apenas 0,21 atm.
Umbreit, Burnis, e Stauffer, citado por FINN (1954), apresentaram dados
sobre o efeito de sais dissolvidos na solubilidade de oxigênio. Estes e outros dados

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na literatura são muitas vezes expressos em termos de um coeficiente de Bunsen,
denominado de α. O coeficiente de Bunsen deve ser multiplicado
por 1.000 / 22,4 para se obter H', que é mais conveniente na análise dos estudos.
Em caldos nutrientes saturados com ar a 25º C, o valor de C* é aproximadamente
0,20 mM por litro, e o valor de H' é próximo à unidade.
A quantidade de compostos dissolvidos no meio de cultivo pode influenciar a
solubilidade de oxigênio e o coeficiente de difusão KL. Geralmente em grandes
quantidades de compostos dissolvidos há uma menor solubilidade do oxigênio. Isso
afetará o crescimento celular e a formação de produtos metabólicos.
A taxa de transporte de oxigênio pelo meio líquido é proporcional à área de
interface, e pode ser também expressa de acordo com a seguinte fórmula:
(2)
onde a é a área de interface, C* é a concentração na interface líquido-gás obtido
pela lei de Henry, C é a concentração real do oxigênio no líquido e KL é o coeficiente
global de transferência de massa. O recíproco 1/KL é igual à soma das resistências
presentes (no filme de gás, na interface, e no filme do líquido). Quando estas
resistências são grandes, KL é pequeno e vice-versa. O artigo em ANEXO 1 mostra
em alguns detalhes a transferência de oxigênio nas culturas em frascos agitados, a
análise de alguns parâmetros físicos e a construção de alguns modelos
matemáticos.
Um fato cotidiano em uma pesquisa é a interrupção da agitação para o
recolhimento de amostras. Isso é um fator que pode afetar a taxa de transferência
de oxigênio. Como mostra a Figura 2, durante o cultivo de Bauveria densa, em
frascos de 250mL com volume de meio de 40mL agitados à 200 rpm, quando se faz
uma pausa na agitação (indicada pela seta), há uma queda do oxigênio disponível e
conseqüentemente na atividade respiratória. O fato de durante a amostragem há
uma interrupção do fornecimento de oxigênio é muitas vezes esquecido pelos
pesquisadores.
A questão da disponibilidade de oxigênio é muitas vezes ignorada por
microbiologistas, sendo considerada como um problema insolúvel. No entanto, uma
forma de tentar resolvê-lo é através da utilização de frascos com chicanas (ou
baffles). Quando elevadas quantidades de oxigênio são necessárias, a utilização de
chicanas irá proporcionar uma maior transferência de oxigênio em freqüências de

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agitação não tão altas. As chicanas também proporcionam um maior estresse
hidromecânico, o qual pode ser vantajoso dependendo do caso, com, por exemplo,
no impedimento da formação de pellets muito grandes.
Figura 2- Transferência de oxigênio ao se parar o agitador.
O volume de meio presente no frasco também influencia bastante a
transferência de oxigênio. Quanto menor o volume de meio no frasco, melhor será a
taxa de transferência de oxigênio (OTR). A melhor transferência de oxigênio ocorre,
por exemplo, quando o volume de meio em um Erlenmeyer de 250mL é de 50 mL.
Isso é um problema, pois volumes muito pequenos de meio fermentado podem gerar
pouca produtividade. Volumes pequenos também só podem ser utilizados em
fermentações de pouca duração, pois, caso contrário, irá acontecer evaporação do
meio de cultivo e os nutrientes ficarão muito concentrados.
Fungos são microrganismos que necessitam de grandes quantidades de
oxigênio para se desenvolverem. Portanto, é ideal utilizar pequenos volumes de
meio, chegando no máximo até 15% do volume total do frasco. Já bactérias são
microrganismos que necessitam de menores quantidades de O2 para se
desenvolverem, logo, é possível utilizar frascos contendo um volume de meio de
cultivo maior.
No trabalho de JÄNICKE et al. (2007), observou-se que o aumento no volume
de meio do frasco e o aumento do diâmetro do frasco tiveram efeito negativo na taxa

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de transferência de oxigênio, enquanto o aumento da freqüência de agitação e no
diâmetro da órbita aumentou essa taxa (Figura 3).
Figura 3- Variação da OTR com relação ao diâmetro do frasco e volume do meio
Fonte: JÄNICKE et al., 2007.
1.2. DEMANDA DE OXIGÊNIO PELOS MICRORGANISMOS
A demanda de oxigênio pelos cultivos microbianos é elevada, e a taxa de
abastecimento deve ser no mínimo igual essa taxa de demanda em cada porção do
meio líquido. Caso contrário, aparecerão locais em que há uma depleção temporária
ou contínua no fornecimento de oxigênio para as células executarem a respiração.
Tais danos foram demonstrados por Hromatka, Ebner e Csoklich, citado por
FINN (1954), que observaram que a interrupção do fluxo de ar no cultivo de
Acetobacter por 15 segundo e causou morte celular e perturbou o metabolismo.
Uma cultura líquida deve ser mantida com o ar saturado em todos os momentos.
Essa condição é dificilmente mantida em culturas aeróbias, mas, felizmente para
microbiologistas, não há necessidade de manter culturas saturadas com ar. A

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respiração celular acontece a uma taxa que é independente da concentração de
oxigênio dissolvido desde que este último se mantenha acima de um valor crítico.
Para os organismos unicelulares esse valor crítico é extremamente baixo, como
mostra a Tabela 1.
Tabela 1- Valores típicos de C crítico na presença de substrato.
Fonte: FINN, 1954.
Abaixo do nível crítico de oxigênio, a taxa de respiração cai de maneira
hiperbólica. Em uma série de experimentos com células de levedura, Winsler, citado
por FINN (1954), demonstrou que, em baixa tensão de oxigênio, a respiração é
limitada pela insaturação das enzimas e não devido à difusão lenta de oxigênio pelo
citoplasma. Ele utilizou o fato de que o monóxido de carbono funciona como um
inibidor competitivo, deslocando o oxigênio da citocromo oxidase da levedura. Com
misturas de CO - O2, uma queda da taxa de respiração foi observada em condições
em que a tensão de oxigênio era tão elevada que a difusão de O2 não poderia ser
considerada como um fator limitante.
Longmuir (1954) realizou estudos de C crítico para bactérias. Ele observou
que essencialmente o C crítico é variado com relação à forma e o tamanho do
organismo: quanto maior as bactérias, maior nível crítico de oxigênio. A difusão de
oxigênio é mais difícil para organismos multicelulares ou aglomerados de células
unicelulares.

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A indisponibilidade de oxigênio no meio de cultivo é um dos problemas mais
freqüentes associados com a aplicação de frascos agitados, e pode causar uma
série de efeitos no microrganismo, como:
 Todo o metabolismo dos microorganismos é desacelerado estabelece com
nenhuma outra conseqüência bioquímica. Neste caso, experiências em que o
mesmo nível de oxigênio é o fator limitante, pequenas diferenças na
geometria do frasco e nas condições de agitação darão resultados
semelhantes e não poderão ser observadas diferenças de atividade
microbiana.
 Mudança para um metabolismo parcialmente anaeróbico, excretado
subprodutos como ácidos e álcool. Isso irá alterar o valor do pH e inibir o
crescimento das células. O produto de formação tem significativas
implicações sobre a atividade metabólica e a cinética de crescimento.
 Reação ao oxigênio fornecido com relação a formação do produto metabólico
desejado. Futatsugi et al., citado por BÜCHS (2001), publicaram que a
produção de glucoamilase extracelular por Saccharomycopsis fibuligera em
diferentes tipos de biorreatores (incluindo frascos agitados) está
correlacionada a taxa de transferência de oxigênio. O crescimento desse
microrganismo não era afetado pela limitação de oxigênio, mas a produção da
enzima sim.
 Mudança completa do metabolismo. Produtos secundários que são
sintetizados somente em condições específicas podem desaparecer do meio
de cultivo na limitação de oxigênio. Por exemplo, Heinemann et al., citado por
BÜCHS (2001), compararam dois experimentos com cultura de Serratia
marcescens, sendo que a única diferença entre os dois conjuntos
experimentais foi que um apresentava frascos com chicanas e outro sem
chicanas. Em frascos com chicanas, houve a produção de um composto de
ação antibiótica e quase nenhuma formação da enzima asparaginase. Já em
frascos sem chicanas, ocorreu uma mudança da via metabólica e encontrou-
se grandes quantidades da enzima e nenhuma quantidade do composto
antibiótico. Isso ocorreu devido ao nível de oxigênio dissolvido no meio.
 Em alguns processos de fermentação, há a presença ou formação de
compostos químicos tóxicos para os microrganismos. Nesses sistemas, os

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compostos tóxicos podem ser continuamente difundidos para o interior da
célula. O organismo pode reagir produzir energia suficiente para excretar a
substância tóxica ou contrabalançar o efeito nocivo de um composto tóxico
convertendo-o em um composto menos tóxico. Se nesses casos, o
fornecimento de oxigênio esteja comprometido, os microorganismos serão
incapazes de obter energia suficiente para metabolizar esses compostos e
morrerão rapidamente.
1.3. EQUIPAMENTOS NECESSÁRIOS
1.3.1. Frascos
Os frascos utilizados no cultivo de organismos variam em forma, tamanho e
tipo de material (Figura 4) de acordo com a finalidade do processo. Como já foi dito
anteriormente, eles podem variar em tamanho indo de microplacas até Erlenmeyers.
Atualmente, as bandejas dos equipamentos de agitação já possuem estruturas de
adaptação para os variados tamanho, fixando-o na base através de garras, fitas
adesivas, ou estantes de tubos, como mostra a Figura 5.
Figura 4- Alguns tipos de frascos.
Fonte: TABORSKY, 1992.
Figura 5- Formas de fixação dos frascos no shaker.

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Fonte: < http://www.nbsc.com >
Frascos normais sem chicanas apresentam um movimento de rotação bem
definido e uniforme e uma área de transferência gás-líquido bem definida. Isso
proporciona uma modelagem matemática do modelo e cálculo da área de
transferência. O cálculo de fatores em um frasco agitado é muito mais simples do
que em um cultivo em biorreatores devido à menor quantidade de variáveis, como
mostra a Figura 6. Em biorreatores, os fenômenos físicos como a formação de
bolhas, a dispersão dessas bolhas, a separação gás líquido no topo, a geração de
espuma, entre outros fatores devem ser levados em consideração. Já em frascos
agitados, muitos desses fatores não estão presentes, facilitando a determinação da
transferência de gases. Isso é de extrema importância no processo de seleção de
microrganismos, e por isso são utilizados geralmente frascos nessa etapa do
trabalho.
Figura 6- Comparação de fatores no cultivo em frascos e em fermentador.

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Alguns frascos podem conter estruturas chamadas de chicanas (ou baffles),
que são geralmente invaginações na parede do vidro. Elas promovem um fluxo do
líquido em regime totalmente caótico, com condições de escoamento bastante
diversificadas.
A maior agitação do meio líquido devido à presença desses septos pode gerar
a formação de espirros de meio líquido na tampa do frasco. No caso de tampas de
algodão, que são as mais utilizadas, se ela estiver molhada devido a esses
respingos, haverá uma redução na permeabilidade de gás pelo tampão e poderá
ocorrer uma contaminação do meio. Se a velocidade de rotação em frascos com
chicanas gerar um valor de KLa antes da tampa fique molhada menor que o
encontrado frascos sem chicanas, mas com velocidades mais altas, então é
recomendável trabalhar com o frasco normal.
A aplicação de chicanas não é sempre recomendável. Elas são geralmente
feitas à mão em uma vidraria e, portanto, não são reprodutíveis com relação à
geometria e ao tamanho, gerando diferenças significativas em termos de
transferência de oxigênio entre os frascos. Dados provenientes de culturas em
frascos com chicanas apresentam um desvio padrão muito grande, pois pequenas
diferenças na profundidade das projeções do vidro ou no posicionamento delas
causam diferenças significativas. Quando se deseja obter resultados uniformes em
um grande número de frascos, é necessário utilizar frascos padronizados. Septos
muito grandes também podem perturbar completamente a circulação do meio no
interior do frasco deixando o sistema “fora de fase” e propiciando o crescimento nas
laterais do frasco.
As chicanas também têm influenciam a morfologia de fungos, como mostra o
trabalho de GERLACH et al. (1998), pois aumentam a tensão de cisalhamento.
Comparou-se frascos com dois e quatro septos com frascos normais sem septos,
sendo todos cultivados com Aspergillus awamori em mesmas condições. Sem os
septos e com dois septos observou-se um aumento da fração do volume celular com
o tempo e depois foi atingido um valor constante de volume. No entanto, com quatro
septos, após um certo tempo, o valor da fração cai drasticamente. Com relação à
formação de pellets, observou-se que nos frascos com chicana não houve formação
significativa de pellets, ao contrário do frasco normal. Isso fica evidenciado na Figura
7 presente abaixo.

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Figura 7- Influência de chicanas na morfologia do fungo.
Fonte: GERLACH et al., 1998.
1.3.2. Tampas
Diferentes tipos de tampas (ou tampões) podem ser utilizados para fechar a
entrada do frasco. No entanto, não se deseja lacrar completamente o frasco, pois
assim não haveria entrada do oxigênio necessário em fermentação aeróbicas.
Portanto, um bom tampão é aquele que permite a entrada e saída de gases, mas
evita a entrada de microrganismos contaminantes, mantendo a cultura axênica. Ele
também serve para evitar partículas de aerossol proveniente da cultura escapem
para fora do frasco e não ocorra grande evaporação do meio durante a
autoclavagem e o cultivo. Para manter essas condições, o tampão não deve estar
molhado, pois isso dificulta a passagem de gases e propicia a contaminação. A
transferência de gases pelo tampão não depende somente do material do qual ele é
feito, mas também do diâmetro da abertura do frasco, do tamanho da profundidade
do tampão, e da diferença de concentração do gás dentro e fora do frasco.
A transferência de gás através do tampão estéril é descrita através do modelo
de Henzler e Schedel, citado por MROTZEK et al. (2001), no qual a troca de gases
não é apenas descrita pela lei de Fick da difusão. Devem ser considerados novos
aspectos como: a transferência de gás por ação combinada de difusão e de
convecção devido à troca de massa (formando um fluxo descrito por Stefan); os
coeficientes de difusão não são considerados como constantes, mas sim calculados
em função da concentração de gás no local; e a consideração de um fluxo de vapor
de água, o qual é um gás como oxigênio, nitrogênio ou dióxido de carbono e,
por isso, o coeficiente de difusão de vapor de água em nitrogênio é proporcional ao
coeficiente de difusão oxigênio em nitrogênio (DH2O-N2 DO2-N2).

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O tipo de tampão utilizado é uma das resistências à transferência de massa
para a troca de gases em frascos agitados. A maior parte da literatura se preocupa
com a resistência à transferência de gás através da interface gás-líquido, sendo uma
minoria aquelas que analisam a resistência do tipo de fechamento do frasco. A
resistência à transferência de gases do tampão pode ser quantificada com relação à
resistência de trocas de oxigênio (KO2):
Vários materiais (Figura 8) podem ser utilizados na fabricação de tampões,
como algodão, gaze, espuma de poliuretano, material fibroso sintético, filtros, entre
outros. Os tampões de algodão são os mais utilizados, mas apresentam grande
limitação na transferência de gases. Essa transferência será facilitada à medida que
o tamanho da abertura do frasco aumenta e a grossura do tampão diminui.
Figura 8- Alguns tipos de tampão (algodão, papel, espuma, fibra de vidro, alumínio e
silicone).
Fonte: MROTZEK et al., 2001.

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Segundo MROTZEK et al. (2001), a densidade do algodão e tamanho do
tampão pouco influenciou a transferência de gases. Algodão com uma densidade
entre 0,06 e 0,25 g/cm3
reduz a troca de gases em relação a atmosfera entre 25 e
38%. Tampões de papel com uma densidade de 0,19 g/cm3
reduz a troca de dióxido
de carbono em cerca de 37%. A fibra de vidro com densidade de 0,19 g/cm3
reduz a
troca gasosa de dióxido de carbono em cerca de 25%, sendo essa resistência menor
do que no caso do algodão da mesma densidade. No entanto, fibra tem um maior
peso específico do que algodão. Por conseguinte, a resistência é provavelmente
comparável a uma porosidade semelhante. Já a espuma de uretano reduz
consideravelmente as trocas gasosas, pois os poros são provavelmente achatados e
resultam em uma troca de gases mais baixa. Com relação às tampas de alumínio,
seu resultado não foi reprodutível devido à não aderência da tampa ao frasco e seu
deslocamento durante a agitação. As tampas de silicone reduzem
consideravelmente a transferência de gases.
O artigo em ANEXO 2 mostra também o efeito de alguns tipos de tampões.
Os pesquisadores tentaram ainda determinar se havia um aumento na transferência
de oxigênio ao aumentar a rotação da cultura durante a utilização do tampão que
limita a transferência.
1.3.3. Agitadores
Os agitadores, ou shakers (Figura 9), servem para auxiliar na transferência do
oxigênio e na mistura da solução. Esses equipamentos têm funcionamento continuo,
e uma das razões para se ter um fornecimento de energia emergencial em um
laboratório é para que os shakers estejam sempre funcionando. A bandeja onde são
fixados os frascos é livre de agitação externa e é movimentada através de um motor
que exerce movimentos contínuos de forma a agitar os frascos.
Os equipamentos mais modernos possuem uma cabine e um sistema de
controle de temperatura, proporcionando uma incubação do caldo a ser fermentado
em condições ótimas mais controladas. Alguns shakers possuem também controle
de iluminação (importante no cultivo de algas), de nível de umidade e disponibilidade
de gases.

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Figura 9- Exemplos de shakers.
Fonte: < http://www.nbsc.com >
Os frascos podem ser agitados em dois tipos de equipamentos, sendo que a
diferenciação está no padrão do caminho de agitação, como mostra a Figura 10. Um
deles é chamado de rotativo, orbital ou girotrônico, o qual realiza órbitas circulares
de 50mm em média, movimentando a cultura suavemente e uniformemente dentro
do frasco. A velocidade de agitação varia entre 100 e 500 rpm geralmente, mas em
laboratórios é usual não passar de 250 rpm.
O outro tipo de agitador é o de movimento recíproco ou de movimento
alternativo. Ele realiza o deslocamento do líquido em um padrão diferenciado, com
uma órbita alternativa. Esse tipo de agitação foi comumente utilizado no passado,
mas tem perdido importância nos últimos anos. Ele é utilizado geralmente para
culturas de células animais e meios de cultivo viscosos.
Figura 10- Caminho do fluido em shaker rotativo (esquerda) e recíproco (dieita).
Fonte: Adaptado de < http://www.biosan.lv/eng/index.php?page=multi-bio-3d >.
O aumento da rotação do shaker pode aumentar a taxa de transferência de
oxigênio. Também pode ocorrer um aumento de danificação das células devido a

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essa agitação, sendo que é necessário encontrar a velocidade de agitação mais
adequada para o processo.
Freedman, citado por BÜCHS (2001), concluiu ao comparar os dois tipos de
shakers que o padrão de turbulência criado no agitador rotativo não é tão afetado
pelo meio, pela viscosidade, pelo início da agitação, ou pelo volume do frasco. Este
é, segundo o pesquisador, o motivo pelo qual o agitador rotativo é usado com maior
freqüência no cultivo de microrganismos.
Um fator importante na boa utilização do equipamento para aumentar a sua
vida útil é a distribuição adequada dos frascos. Isso é importante para não
desnivelar a bandeja devido ao peso excessivo em um dos lados e causar desgaste
do motor. A manutenção ou a compra de equipamentos novos não é muitas vezes
economicamente viável.
2. PREPARO DE INÓCULO
A realização de uma fermentação em larga escala necessita do preparo de
um inóculo em menor escala. Inóculo é toda suspensão de células em
concentrações adequadas capazes de conduzir economicamente um processo
fermentativo de um dado volume de meio. A importância desse inóculo para o
processo inteiro pode ser observada numa citação de Hockenhull: “Uma vez que a
fermentação é iniciada, ela pode se tornar pior, mas nunca melhor.”. Portanto,
utilizar uma cultura de inóculo de boa qualidade é essencial. Um bom inóculo
deverá: conter células saudáveis e ativas, minimizando, assim, o período de
adaptação das células ao meio de cultivo na fermentação seguinte; estar em volume
suficiente para fornecer células na devida quantidade; estar em uma forma
morfológica adequada; estar livre de contaminações; e manter as características de
produção do produto desejado.
Um dos fatores críticos na obtenção de um inóculo adequado é
a escolha do meio de cultura. Tal como no meio utilizado para a produção, o meio de
inóculo deve conter não apenas as necessidades de nutrição
do microrganismo, mas também os requisitos para a formação do produto. No
entanto, como o inóculo não tem como objeto produzir o produto, mas sim biomassa,
a sua formulação pode ser diferente do meio de produção, possibilitando assim uma
forma de reduzir alguns gastos.

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Geralmente utilizam-se meios para inóculo suficientemente semelhantes ao
da produção para diminuir a fase lag de crescimento, ou seja, o período de
adaptação das células ao novo meio. A Tabela 2 mostra uma comparação entre
alguns meios de inóculo utilizados e os meios de produção. Pode-se notar que os
meios para inóculo são geralmente menos nutritivos do que os meios de produção e
que contém níveis mais baixos de carbono.
Tabela 2- Meios de inóculo e de produção utilizados para alguns processos.
Fonte: STANBURY, 1995.
Hockenhull, citado por STANBURY (1995), alerta para os perigos da
utilização de um meio muito diferente do usado em etapas posteriores. Grandes
diferenças de pH, pressão osmótica composição de ânions pode resultar em
mudanças bruscas nas taxas de consumo do substrato, que, por sua vez, vai afetar
a viabilidade celular. Ele também enfatiza que nas culturas de produção de
antibióticos, o meio utilizado no inóculo deve fornecer uma quantidade suficiente de

20
carbono e nitrogênio para propiciar um grande crescimento até e transferência, de
modo que o metabolismo secundário fique reprimido durante o crescimento do
inóculo.
Se não ocorrer a repressão do metabolismo secundário, irão se desenvolver
no inóculo as variantes que produzem menos e crescem mais rápido, superando em
número a quantidade de células que produzem mais metabólitos e por isso crescem
de maneira mais lenta. Hockenhull mostrou um exemplo como o trabalho de
Righelato (1976) no qual foi trabalhada uma cultura quimioestática de Penicillium
chrysogenum sob condições limitadas de carboidratos, o que levou à perda da
capacidade de síntese da penicilina. No entanto, isso não ocorreu em condições em
que a fonte limitada era de nitrogênio, sulfato ou fosfato. Hockenhull tirou dessa
informação que os inóculos desse fungo produzidos sob condições não-limitantes
são livres de variantes, enquanto que as variantes podem surgir freqüentemente
durante situações de limite de carbono.
O volume de inóculo normalmente utilizado é entre 3 e 10% do volume médio
da próxima fermentação. Os microrganismos de uma cultura provêm inicialmente de
um estoque, o qual deve passar por uma série de cultivos até se chegar ao volume
adequado para ser inoculado no fermentador de produção. Isso pode envolver
algumas etapas de fermentação em frascos agitados e biorreatores de bancada, até
se chegar a quantidade ideal, como mostra a Tabela 3. Em cada um desses
processos há um risco grande de contaminação da cultura e degeneração do
microrganismo devido a mutações naturais, sendo que quanto maior o número de
transferências maior o risco.
O desenvolvimento de um inóculo geralmente passa pelas etapas descritas a
seguir. A cultura principal é conservada em meio sólido, e aproximadamente 10
colônias que apresentam características de alta produtividade e morfologia
adequada são inoculadas em meio inclinado para fazer um sub-cultivo. Esses sub-
cultivos podem ser transferidos para frascos agitados de forma a testar a sua
viabilidade e produtividade. São inoculados geralmente frascos de 250 a 500 mL
contendo de 50 a 100 mL de meio de cultivo líquido. Após o crescimento nesse
frasco e verificação da produtividade, ele pode ser inoculado em um frasco maior,
em um fermentador de escala laboratorial. Este, por sua vez, pode então servir de
inóculo para um biorreator de escala industrial. Às vezes, os testes de análise

21
podem não estar prontos antes da inoculação, mas, pelo menos, se houver algum
problema, poderá ser detectado depois em qual etapa ele estava.
Um fator a ser considerado no número de etapas e tamanho do inóculo é a
economia do processo. Por exemplo, um inóculo de 10% do tamanho de um
biorreator de fermentação em escala industrial representa um grande investimento
financeiro, o qual só é justificado se houverem vantagem com relação à
produtividade.
Tabela 3- Níveis de cultivo de um microrganismo.
Fonte: RUTTLOFF, PROLL & LEUCHTENBERGER, 1996.
O momento da transferência do inóculo é de extrema importância, pois a
fermentação não pode ser contaminada durante esse processo. Nas indústrias, o
processo de passagem do inóculo de biorreatores de escala laboratorial para um de

22
escala industrial envolve um sistema de válvulas e canais de forma que todo o
cultivo prossiga sem contaminações indesejadas.
2.1. CONDIÇÕES DO INÓCULO
A condição fisiológica do inóculo no momento da transferência da cultura é de
extrema importância no desenvolvimento da próxima fase do processo e se ter um
grande efeito sobre o desempenho da fermentação. O melhor momento para a
transferência da cultura deve ser determinado experimentalmente e, em seguida,
deve-se estabelecer procedimentos de modo a que inoculação ideal poça ser
alcançada rotineiramente. Para garantir-se isso são realizadas padronizações das
condições de cultura e acompanhamentos do estado do inóculo, de modo que a
transferência ocorra no tempo ótimo e estado fisiológico correto. O critério mais
utilizado para a transferência das estruturas vegetativas dos inóculos é
determinação da biomassa, a qual pode ser determinada através de parâmetros
como peso seco, peso úmido, turbidez, respiração, concentração residual de
nutrientes, morfologia, entre outros. Ettler (1992), citado por STANBURY (1995),
demonstrou que a análise reológica do meio de cultivo de Streptomyces noursei
poderia ser usada como critério na determinação do crescimento celular. A reologia
do meio líquido mudava de newtoniana para não-newtoniana, e o momento em que
ocorria essa mudança correspondia ao tempo ideal de crescimento do inóculo.
Métodos de monitoramento on-line (como a quantidade do oxigênio, do
dióxido de carbono, de algum gás efluente ou verificação do pH) são mais
convenientes para usar como indicadores da qualidade do inóculo. Parton e Willis
(1990) defenderam a utilização da taxa de produção de dióxido de carbono (CPR)
como um critério de análise de efluentes gasosos para a transferência de inóculo.
Esta abordagem é indicada apenas quando a transferência está sendo feita a partir
de um fermentador, pois é mais difícil controlar a atmosfera gasosa de um frasco
agitado.
Nos últimos anos, foram desenvolvidas novas sondas para análise on-line da
biomassa, as quais são inestimáveis para determinar o tempo de transferência ideal.
Boulton et al. (1989) relataram a utilização de um sensor de biomassa para controlar
a adição de levedura (taxa de inóculo) na produção da cerveja. A sonda mede a

23
permissividade dielétrica de células viáveis e não é afetada pela presença de células
mortas, bolhas ou detritos, tornando-a ideal para este caso.
O artigo em ANEXO 3 mostra a influência das condições do inóculo no
crescimento do fungo Penicillium chrysogenum. Foram analisados fatores como a
solução de diluição do inóculo, a idade da cultura esporulante, a cepa utilizada e o
tamanho do inóculo. Cada microrganismo necessita de um preparo do inóculo
diferente, e isso é levado em conta separadamente. A seguir serão discutidos os
preparos de inóculos de leveduras, bactérias, e fungos.
2.2. INÓCULO DE LEVEDURAS
A maioria das fermentações industriais que utilizam leveduras visa a produção
de cerveja ou de biomassa. No entanto alguns processos recentes de produção de
produtos recombinantes também necessitam do cultivo de leveduras.
Na fabricação da cerveja, muitas vezes é utilizada uma parcela da
fermentação anterior como inóculo para a próxima fermentação. No entanto, a
realização desse tipo de prática pode resultar na introdução de contaminantes e na
degeneração da cepa com relação à eficiência de produção e capacidade de
floculação.
Muitas vezes para evitar esse dois problemas são utilizadas “leveduras do
meio” (middle skimmings). Durante a fermentação, as células de levedura floculam e
flutuam até superfície. As primeiras células que fazem isso são mais floculantes e,
quando a fermentação é realizada em tambor aberto, são mais susceptíveis à
contaminação. Células que ficam mais em baixo são aquelas com pouca capacidade
de floculação. Portanto, ao pegar as leveduras que estão na camada do meio, estar-
se-ia pegando leveduras com boa capacidade de floculação e livres de
contaminantes.
Essas leveduras recolhidas podem também receber um tratamento antes de
serem inoculadas na próxima fermentação para remover leveduras mortas e
bactérias contaminantes através da redução do pH para 2,5-3, lavagem com água,
lavagem com persulfato de amônio e tratamento com antibióticos como polimixina,
penicilina e neomicina.
A indústria cervejeira também utiliza fermentadores do tipo cilindro-cônico.
Nestes sistemas a coleta de leveduras floculantes é feita no cone no fundo do

24
fermentador, o qual está sujeito a falta de nutrientes, altas concentrações de etanol,
baixa atividade da água, elevada concentração de dióxido de carbono
e de alta pressão. Portanto, a viabilidade das células coletadas nesse local não seria
o ideal para um inóculo.
Uma das principais características fisiológicas de um bom inóculo de levedura
é o nível de esterol nas células. Esteróis estão presentes na membrana celular e são
necessários para a sua síntese, mas eles são apenas produzidos na presença de
oxigênio. Como a produção de etanol é realizada em condições anaeróbicas, ao se
injetar oxigênio no inóculo antes da inoculação, tem-se um aumento da quantidade
de esterol para promover o crescimento celular inicial.
A produção de leveduras para fermento de pão envolve o desenvolvimento de
um inóculo através de um grande número de estágios aeróbicos. Devido ao fato de
que as fases da produção não poderem ser realizadas em condições totalmente
assépticas, o uso de uma cultura pura como inóculo é de extrema importância para
manter o nível de contaminação no início o mais baixo possível. Reed e
Nagodawithana (1991), citado por STANBURY (1995), discutiram o desenvolvimento
do inóculo para a produção de fermento de panificação, a partir de um processo
envolvendo oito fases, sendo as três primeiras asséptica enquanto que as restantes
eram realizadas em tanque aberto. O fungo poderia ser bombeado diretamente de
um frasco para o outro ou o inóculo poderia ser centrifugado e lavado antes de
transferência, reduzindo assim o nível de contaminação.
O artigo em ANEXO 4 mostra a importância da determinação adequada da
concentração celular da suspensão de leveduras. Na determinação do efeito de
substâncias antifúngicas, é necessária uma padronização da quantidade de inóculo
utilizada. Esse artigo visava comparar quatro métodos de determinação adequada
da concentração celular do inóculo.
2.3. INÓCULO DE BACTÉRIAS
O principal objetivo do inóculo para o desenvolvimento fermentações
bacterianas é produzir células ativas, as quais terão uma fase lag curta e será
possível dar continuidade à cultura. Fases lag longas não são vantajosas porque
não só é tempo perdido, mas também o meio de cultivo é consumido durante a
manutenção da viabilidade da cultura antes do crescimento.

25
A duração da fase lag é afetada pelo tamanho do inóculo e a sua condição
fisiológica. Como já foi dito, o tamanho do inóculo normalmente varia entre 3 e 10%
o volume da cultura de produção. Lincoln (1960), citado por STANBURY (1995),
salientou que inóculos bacterianos devem ser transferidos na fase logarítmica de
crescimento, enquanto as células estão ainda metabolicamente ativas. A idade do
inóculo é importante no crescimento das bactérias esporulantes, pois a esporulação
é feita no final da fase logarítmica e a utilização de um inóculo contendo uma
elevada quantidade de esporos resultaria numa fase lag longa, atrasando a próxima
fermentação.
Underkofler (1976), citado por STANBURY (1995), enfatizou que, na
produção bacteriana de enzimas, o a fase lag poderia ser quase totalmente
eliminada através da utilização de um meio no inóculo praticamente idêntico ao meio
de produção. A necessidade de utilizar um inóculo em um estado fisiológico ativo é
realmente seguida na produção de vinagre. As bactérias acéticas utilizadas na
produção do vinagre são extremamente sensíveis à falta de oxigênio. Por isso, para
evitar a perturbação do sistema, as células no final de uma fermentação são
utilizados como inóculo para o próximo lote através da remoção de cerca de 60% da
cultura e restaurando os níveis iniciais com meio fresco.
No entanto, um inóculo de alta atividade aumenta da probabilidade de
degeneração da cepa. Por exemplo, Sabatie (1991), citado por STANBURY (1995),
demonstrou que a estabilidade do plasmídeo e produtividade em E. coli para a
produção de biotina são melhores quando o inóculo utilizado está na fase lag, e não
na exponencial. Ele afirmou que a cópia dos plasmídeos é maior em estacionário do
que em exponencial do que em outros, resultando em uma menor perda dos
plasmídeos durante a fermentação.
Na fermentação do ácido lático deve-se preparar um inóculo livre dessa
substância, pois as bactérias podem ter seu crescimento inibido por ela. Assim, a
produção ácido láctico no inóculo pode resultar em inóculos de má qualidade.
Yamamoto et al. (1993) gerou grande qualidade de inóculo de bactérias lácticas
utilizando eletrodiálise, removendo assim o lactato do meio de inóculo e reduzindo a
duração da fase lag durante a produção.

26
2.4. INÓCULO DE FUNGOS FILAMENTOSOS
A preparação de inóculos para fermentações que promovem o crescimento
micelial de fungos filamentosos é empregada para a maioria dos fungos importantes
industrialmente, onde se utiliza uma suspensão de esporos durante o
desenvolvimento do inóculo. A grande vantagem de se utilizar inóculos contendo
esporos é que se contêm muito mais estruturas propagativas do que em uma cultura
de células vegetativa. Três técnicas básicas têm sido desenvolvidas para produzir
uma alta concentração de esporos para utilização como inóculo.
A primeira é a esporulação em meio solidificado. A maioria dos fungos e
estreptomicetos esporulam em meio com ágar adequado, mas uma grande área de
superfície desse ágar deve ser utilizada para se produzir uma quantidade de
esporos suficiente.
Outros organismos filamentosos irão esporular naturalmente na superfície de
cereais e grão, a partir dos quais os esporos podem ser recolhidos. Substratos como
a cevada, o farelo de trigo, o milho e o arroz são superfícies adequadas para a
esporulação de uma vasta gama de fungos. A esporulação de um determinado
fungo é particularmente afetada pela quantidade de água adicionada ao cereal antes
da esterilização e a umidade relativa da atmosfera, a qual deve estar a mais alta
possível durante esporulação.
O último método seria a esporulação em cultura submersa. Alguns fungos
sofrem esporulação em meio líquido desde que um suporte adequado seja
empregado. Esta técnica é mais conveniente do que o uso de meios sólidos, porque
é mais fácil de trabalhar assepticamente e de ser aplicado em grande escala. A
técnica foi aprovada pela primeira Foster et al. (1945) que induziu esporulação de
Penicillium notatum em cultivo submerso através da adição de 2,5% de cloreto de
cálcio em um meio definido. A maior parte dos actinomicetos não esporulam em
condições submersas, e, portanto, as outras técnicas descritas anteriormente devem
ser utilizadas. Rhodes et al. (1957), citado por STAMBURY (1995), descreveram as
condições necessárias para a esporulação em meio líquido de Penicillium patulum.
Observou-se que para ocorrer a esporulação o nível de nitrogênio tinha de ser
limitados a entre 0,05 e 0,1% p/v e que uma boa aeração deveria ser mantida. Eles
também observaram que quanto menor for a aeração, menor a concentração de
nitrogênio necessária para induzir a esporulação.

27
Alguns fungos não são capazes de produzir esporos assexuados, e, portanto,
é necessário preparam inóculos à partir das estruturas vegetativas. O grande
problema em usar o micélio vegetativo como inóculo é a padronização da
quantidade de inóculo e dificuldade da obtenção de um inóculo uniforme. Pode-se
evitar isso tentado fragmentar o micélio em peneiras ou num liquidificador de Waring
antes de utilizá-lo como inóculo. Este método proporciona um grande número de
partículas miceliais e, portanto, um grande número de partículas de propagação.
Quando fungos filamentosos são cultivados em fermentação submersa, o
crescimento varia entre a forma de "pellet", a qual é uma massa de hifas compactas,
e uma forma filamentosa forma por hifas uma forma homogênea. O tipo de
filamentoso dará origem a um caldo viscoso que poderá ser de difícil areação, ao
passo que o crescimento em pellets dará origem a um meio menos viscoso, mas
também menos homogêneo. Na estrutura do pellet ocorre o problema do micélio que
se encontra no centro não receber grandes quantidades de nutrientes devido às
dificuldades de difusão.
A forma morfológica do fungo pode influenciar a produtividade da cultura, pois
algumas fermentações são eficientes com o fungo na forma filamentosa e outras na
forma de pellets. Por exemplo, o crescimento filamentoso tem sido reivindicado
como uma condição ótima para a produção penicilina por P. chrysogenum, enquanto
que o crescimento em pellets foi reivindicado como sendo ótimo para a produção e
de ácido cítrico por Aspergillus niger e de lovastatina por Aspergillus telreus.
A morfologia do micélio é influenciada pela concentração de esporos no
inóculo e os o meio de cultivo no qual esse inóculo foi desenvolvido. Normalmente,
inóculos com grande quantidade de esporos produzem um micélio disperso na forma
de filamentos, enquanto que um inóculo com baixa concentração de esporos irá
favorecer a formação de pellets. A partir da Tabela 4 é possível observar a influência
da concentração de esporos na forma de crescimento de Penicillium chrysogenum.

28
Tabela 4- Efeito da concentração de esporos na morfologia e produtividade de
penicilina por Penicillium chrysogenum.
Fonte: STANBURY, 1995.

29
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BÜCHS, J. Introduction to advantages and problems of shaken cultures.
Biochemical Engineering Journal, v.7, p.91-98, 2001.
DEMAIN, A.L.; DAVIES, J. E. Manual of Industrial Microbiology and
Biotechnology. Second Edition, ASM Press, Washington, D.C.,1999, 830p.
FINN, R. K. Agitation-Aeration in the Laboratory and in Industry (1954).
Disponível em: < www.mmbr.asm.org >. Acesso em: 17 de maio de 2008.
GERLACH, S. R.; SIEDENBERG, D.; GERLACH, D.; SCHÜGERL, K.; GIUSEPPIN,
M. L. F.; HUNIK, J. Influence of reactor systems on the morphology of
Aspergillus awamori. Application of neural network and cluster analysis for
characterization of fungal morphology. Process Biochemistry, vol. 33, nº 6, p.
601-615, 1998.
JÄNICKE, G.; SAUTER, C.; BUX, R.; HAAS, J. Characterisation of shake flasks
for cultivation of animal cell cultures. R. Smith (ed.), Cell Technology for Cell
Products, Springer, p. 727-731, 2007.
MAIER, U.; BÜCHS, J. Characterisation of the gas-liquid mass transfer in
shaking bioreactors. Biochemical Engineering Journal, 7, p. 99-106, 2001.
McDANIEL, L. E.; BAILEY, E. G. Effect of Shaking Speed and Type of Closure on
Shake Flask Cultures. Applied microbiology, vol. 17, nº2, p. 286-290, 1969.
MOO-YOUNG, M. Comprehensive Biotechnology: The Principles, Applications
and Regulations of Biotechnology in Industry, Agriculture and Medicine.
Volume 1 – The Principles of Biotechnology: Scientific Fundamentals, Pergamon
Press, Oxford, 1985.
New Brunswick Scientific. Disponível em: < http://www.nbsc.com >. Acesso em 17
de maio de 2008.
PFALLER, M. A.; BURMEISTER, L.; BARTLETT, M. S.; RINALDI, M. G. Multicenter
Evaluation of Four Methods of Yeast Inoculum Preparation. Journal of Clinical
Microbiology, vol. 26, nº8, p. 1437-1441, 1988.
RUTTLOFF, H.; PROLL, J.; LEUCHTENBERGER, A. Lebensmittel-Biotechnologie
und Ernährung: Probleme und Lösungsansätze. Springer,1996, 326 p.
SAUTOUR, M.; DANTIGNY, P.; GUILHEM, M.-C.; BENSOUSSAN, M. Influence of
inoculum preparation on the growth of Penicillium chrysogenum. Journal of
Applied Microbiology, 95, p. 1034-1038, 2003.
STANBURY, P. F.; WHITAKER, A.; HALL, S. J. Principles of Fermentation
Technology. Second Edition. Butterworth Heinemann, Elsevier Science, 1995, 357
p.

30
TABORSKY, V. Small-scale processing of microbial pesticides. Food and
Agriculture Organization of the United Nations, FAO Agricultural Services Bulletin Nº
96, Rome, 1992. Disponível em: < http://www.fao.org/docrep/t0533e/
t0533e08.htm#6.5.2 >. Acesso em: 17 de maio de 2008.
WHIPPS, J. M.; LUMSDEN, R. D. Biotechnology of Fungi for Improving Plant
Growth. British Mycological Society Symposium, Cambridge University Press, 1989,
303 p.

31
4. ANEXOS
ANEXO 1
CHARACTERISATION OF THE GAS-LIQUID MASS TRANSFER IN SHAKING
BIOREACTORS
ULRIKE MAIER & JOCHEN BÜCHS

32
ANEXO 2
EFFECT OF SHAKING SPEED AND TYPE OF CLOSURE ON SHAKE FLASK
CULTURES
L. E. McDANIEL & E. G. BAILEY

33
ANEXO 3
INFLUENCE OF INOCULUM PREPARATION ON THE GROWTH OF Penicillium
chrysogenum
M. SAUTOUR, P. DANTIGNY, M.-C. GUILHEM & M. BENSOUSSAN

34
ANEXO 4
MULTICENTER EVALUATION OF FOUR METHODS OF YEAST INOCULUM
PREPARATION
M. A. PFALLER, L. BURMEISTER, M. S. BARTLETT & M. G. RINALDI

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