Isolamento de bactéria probiótica do surubim híbrido para melhoria de parâmetros hematológicos

1
Prof. Thiago Andrade, CRMV-CE 0176 ZP
Zootecnista, Professor de Aquicultura
CENTEC/SEDUC, EEEP J. I. Nocrato - Guaiúba-CE

2
Isolamento de bactéria probiótica do surubim
híbrido Pseudoplatystoma reticulatum x
Pseudoplatystoma corruscans (Siluriformes:
Pimelodidae): uma abordagem hematológica

Pintado e cachara
Cachara
Pintado
Pseudoplatystoma fasciatum
Pseudoplatystoma corruscans

Podem atingir 152 cm de comprimento

Gênero Pseudoplatystoma
 Pertencem à famíia Pimelodidae
 Produção de bagres na América do Sul em 2007,
em águas continentais
✔ 670 ton
✔ $ 1.467.000,00 USD

Produção e Surgimento de Doenças
 Intensificação produção
✔ Elevada densidade alta→
incidência de doenças
✔ Doenças bacterianas causam as
maiores perdas econômicas
 Frequentemente manifestada
em mudanças subclínicas nos
peixes infectados (Martins et
al., 2004)
 Exemplo: gênero Aeromonas
✔ Causaram septicemia, primária
e secundária, em híbridos de
Pseudoplatystoma com
imunidade comprometida,
(observação feita em
diferentes surtos no Mato
Grosso)

Uso de antibióticos
 Prevenção e controle de doenças nos cultivos em sistemas
intensivos
✔ Tem sido observados em diferentes pesquisas um aumento na
resistência dos patógenos

Alternativa: probióticos
 Alternativa profilática viável
✔ Definição: organismos vivos que
beneficiam a saúde do hospedeiro
quando administrado em
concentrações adequadas
 Benefícios:
1) Exclusão competitiva de bactérias
patogênicas
2) Produção de bacteriocinas¹ e ácidos
orgânicos
3) Imunomodulação²

Peptídeos antimicrobianos sintetizados
nos ribossomos. Apresentam grande
diversidade. Diferem entre si quanto à
composição de AA’s, biossíntese,
transporte e modo de ação
Substâncias que
aumentam a resposta orgânica
contra determinados
microorganismos mediante à produção
de interferon e seus indutores.
1. Bacteriocinas 2. Imunomoduladores

 Outros benefícios observados no uso de probióticos:
✔ Melhorou os parâmetros hemato-imunológicos em peixes¹
✔ Exemplo: uso de bactérias ácido-láticas isoladas do intestino de tilápias
do Nilo (Oreochromis niloticus) melhorou o sistema imunológico apís
infecção experimental com Enterococcus durans²
 1 - Barbosa et al., 2011; Mouriño et al., 2012; Ridha and Azad 2012).
 2 - Jatobá et al. (2008)

Objetivo do estudo
 Avaliar cepas de bactérias isoladas do intestino
de híbridos de cachara com pintado
(♀P. reticulatum machos x ♂P. corruscans) para determinar:
1. Potencial probiótico
2. Habilidade para aderir ao epitélio intestinal
3. Habilidade para modificar a microbiota do hospedeiro
4. Capacidade de melhorar os parâmetros hematológicos

14
Seleção de cepas probióticas
 Selecionados 20 surubins híbridos
✔ Peso: 1,5 ± 0,3 kg (obtidos da Mar & Terra Ltda, Dourados-MS)
✔ Cultivados em tanques que não foram tratados previamente com
químicos ou antibióticos

16
1. Animais foram anesteziados com benzocaína 0,01%
2. Intestinos foram excisados
3. Amostras: lavadas com solução salina 0,65% estéril remoção de→
bactérias não-aderentes
4. Tecido removido foi homogeneizado com a mesma solução a 1:1

17
5. Material sobrenadante foi removido e espalhado sobre o meio de cultivo
(Man, Rogosa and Sharpe – MRS, Agar (HIMEDIA ®)
6. Amostras foram incubadas a 35 C por 48 h◦
7. As colônias foram espalhadas em MRS mais uma vez por mais 48h
Objetivo: garantir pureza e confirmar as características morfológias dos Lactobacilus
através da coloração Gram

18
1. Aeromonas hydrophila subsp. hydrophila
(CPQBA 228–08 DRM)
2. Aeromonas sobria (isolated from
symptomatic fish)
3. Vibrio harveyi (ATCC 14126)
4. Vibrio alginolyticus (CPQBA 378–12 DRM)
5. Vibrio anguillarum (donated by Dr.
Marguerita Barraco − UFSC)
6. Enterococcus durans (ATCC 19492)
7. Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853)
8. Escherichia coli (D363)
9. Micrococcus luteus (A270)
10. Staphylococcus aureus (ATCC 29213),
11. Vibrio alginolyticus (isolated by Martins et
al., 2010)
Bactérias utilizadas para o ensaio de
anatagonistas in vitro:

19
Aeromonas:
A. hydrophila, A. sobria
Víbrios:
V. harveyi, V. alginolyticus,
V. anguillarum
Cocos:
Enterococcus, Micrococcus,
Staphylococcus
Pseudomonas:
Pseudomonas aeruginosa
Escherichia coli
Bactérias alistadas foram reativadas, cultivadas, mantidas em TSA
a 30 C por 24 h◦

20
 Seleção in vitro dos antagonistas
✔ Patógenos espécie-especificos do Pseudoplatystoma e outros patógenos
de importância econômica para aquicultura
✔ As cepas isoladas foram inicialmente avaliadas para inibição de A.
hydrophila (CPQBA 228–08 DRM) de acordo com o “teste de disco
úmido” (wet disc assay-WDA) descrito por Ramiréz et al

21
 Cepas isoladas foram inculadas em MRS a 108
UFC/ml, medido por
espectrofotometria e incubados a 35º C por 24h.
 Após a incubação, um disco de 1 cm foi removido do meio de cultivo, e A.
hydrophila foi inoculada em TSA agar.
 Os discos vindos do MRS foram colocados sobre o ágar inoculado com o
patógeno e incubados a 30 C por 24 h.◦
 A atividade antagonística foi medida pelo diâmetro (mm) das zonas de
inibição ao redor dos discos colocados (3x discos do probióticos)

23
 Cepas com maior capacidade antagonista contra A. hydrophila
✔ Dez foram identificadas
✔ Bactérias consumidoras de ácido lático: identificadas pela
fermentação de 49 carboidratos
✔ Identificação das cepas e intrepretação dos resultados através do kit
API 50CH*
✔ Acompanhamento da evolução 5 melhores cepas foram mantidas→
* API, bioMérieux, Hazelwood, MO, USA

24
 Para interpretação dos resultados inibitórios, os patógenos foram
divididos em diferentes níveis de importância:
✔ Patógenos específicos para aquicultura (nível 3)
✔ Patógenos não-específicos para aquicultura continental (nível 2)
✔ Patógenos não-específicos para aquicultura marinha (nível 1)

25
 Para avaliação da inibição dos patógenos marinhos (Vibrio spp.)
através do WDA, TSA agar houve enriquecimento do meio com 2%
NaCl.
 Todas as bactérias cultivadas foram checadas rotineiramente para
pureza através do teste de coloração Gram e depleção nos meios
de cultivo

26
 Teste de viabilidade comercial:
✔ 5 cepas selecionadas
✔ Foram inoculadas em ração comercial para carnívoros (45% PB)
 Habilidade para produzir ácidos orgânicos observada pela variação do pH
✔ Avaliação para UFC/mL (tubos contendo MRS, pH 6, 35º C, 48 h)
✔ Após a incubação, a variação de pH foi medida para cada cepa
✔ Assume-se que a produção de ácidos orgânicos ou peroxido de oxigênio causou a
variação nos valores*
 * Vazquez et al., 2005

27
 Etapa seguinte: W. cibaria foi adicionada em ração comercial contendo:
Cálcio (max) 25,00 g kg−1
Extrato etéreo (min) 100,00 g kg−1
Fósforo (min) 10,00 g kg−1
Fibra (max) 100,00 g kg−1
Proteína bruta (min) 400,00 g kg −1
Umidade (max) 120,00 g kg −1

28
 Uma soluçao com bactérias foi então aplicada na dieta na forma de spray (200
mL kg−1
)
✔ Em seguida, a dieta foi incubada com circulação de ar em temperatura 45º C por 18º C
✔ Três amostras da dieta suplementada foi macerada em solução salina (1,5%) e diluída
serialmente (1/10) nove vezes
✔ Diluições de 10-5
e 10-9
foram espalhadas em MRS e incubadas a 35º C por 48 h para
estimar a concentração desejável (106
UFC g-1
)
 Dieta controle foi espalhada com a mesma concentração de MRS esterilizado,
mas sem bactérias

29
Colonização intestinal
 72 híbridos saudáveis (± 21 cm de comprimento, 65 g)* foram
usados para avaliaçao de colonização do trato intestinal por
W. cibaria selecionadas anteriormente jejum de→ 24 h
* Mar & Terra Ltda

30
1. Extração do intestino com pinças e bisturi
✔ Foram lavados 2 vezes com água esterilizada e homogeneizados em um
gral com solução salina e serialmente diluído (1:10)

31
2. Cutura de bactérias coletadas:
 Obs: as colônias que cresceram em MRS
foram coradas (Gram) para subsequente
caracterização bioquímica (API test;
bioMérieux) para confirmar a colonização e
composição das bactérias do hospedeiro
TSA
Bactérias heterotróficas
MRS
Bactérias ácido láticas
Ágar cetrimide
Pseudomonas
Ágar TCBS
Vibrionaceae
48h24h
TEMPERATURA:30ºC

32
Delineamento experimental
12 tanques circulares de 100 L
 Aeração e temperatura constante (26º C)
Qualidade da água
 Filtro biológico (cascalho) com manutenção
independentemente
 Remoção diária de sedimentos e 70% de água
pH 6,8 ± 0,2 AT 1,2 ± 0,4 mg/LOD 8,5 mg/L
PARÂMETROS DA
QUALID. DA ÁGUA

33
Delineamento experimental
 Seis peixes foram colocados em cada tanque
✔ 5 dias para aclimatação
✔ Em seguida eles foram alimentados com a dieta experimental 2x/dia
ou com dieta controle (sem suplementação)
✔ Os peixes foram divididos aleatoriamente (6 repetições em cada
tratamento, inclusive o controle)

34
Coleta de sangue para análise
 Animais foram anestesiados com eugenol (75 mg/L)
 2 amostras de sangue foram coletadas da veia caudal
✔ Uma amostra com anticoagulante EDTA: análise hematológica
✔ Uma amostra sem anticoagulante foi incubada por 2 h a 25º C e
centrifugada por 10 min para separação do soro e estocado a -20º C
para análise de glucose

35
Análise hematológica
 Esfregaços de sangue foram coradas por Giemsa/May Grunwald
✔ Contagem diferencial de leucócitos e total de trombócitos e leucócitos (WBC)¹
 Uma alíquota foi usada para determinação do hematócrito
 Restante de sangue foi conservada em gelo para contagem de eritrócitos (RBC)
totais usando uma câmara de Neubauer²
 Uma alíquota de soro sanguíneo foi usada para determinação da concentração de
glucose por espectrofotômetro a 505 nm
 1 - Ishikawa et al., 2008
 2 - Ranzani-Paiva et al., 2013
 3 - Biotecnica Glucose Kit (Biotecnica, Minas Gerais, Brazil).

36
Análise Estatística
 Dados foram avaliados de acordo com a homogeneidade de
variância pelo teste de Bartlett.
✔ Nos casos onde foram observados heterogeneidade os dados foram
transformados para log (x + 1) para contagem microbiológica e
hemograma e analizados pelo t-test (p<0,05)

37
Identificação molecular
 Após o experimento, as bactérias foram identificadas através de
análises de DNA na UNICAMP
✔ Usando DNA extraído das amostras a ampliação do gene rRNA 16S foi
realizada por PCR.
✔ Os primers usados para a PCR foram as extremidades homólogas dos
genes p27f e p1401r RNA ribossômico das bactérias

38
 Os produtos amplificados foram purificados e sequenciados
usando sequenciador automatizado (MegaBACE 1000, GE
Healthcare)
✔ Primers usados: p10f, 765f, 782r and p1100r.
✔ Sequencias parciais de 16S RNA ribossômico obtidas de diferentes
primers foram reunidos e comparados com sequências de organismos
encontrados no banco de dados Genbank e RDP

39
 Sequências de DNA foram alinhadas usando o programa CLUSTAL X¹
 Análises filogenéticas foram conduzidas usando o programa MEGA 4.0²
 Distância evolucionária foi calculada à base do modelo de Kimura (1980).
 A árvore filogenética foi construída a partir das distâncias evolucionárias
através do método Neighbor-Joining com valores bootstrap calculados de
1.000 recontagens usando o software MEGA 4.0
1 - Thompson et al., 1997
2 - Tamura et al., 2007
3 - Saitou and Nei, 1987

41
Seleção das Cepas Probióticas
 Total de cepas isoladas: 41
✔ Todas bactérias Gram-positivas ácido láticas
✔ Apenas 10 demonstraram zonas de inibição > 10 mm (WDA)
 Lactobacillus confusus (2 cepas)
 Lactobacillus brevis (3 cepas)
 Lactococcus lactis lactis (2 cepas)
 Weissella cibaria (1 cepas)
 Duas não foram identificadas pelo kit API 50CH
Teste com
Aeromonas hydrophila
subsp. hydrophila

44
Seleção das Cepas Probióticas
 Cepas que apresentaram zonas
de inibição médias de > 9 mm
contra outros patógenos foram:
✔ L. brevis (P6)
✔ L. brevis (P13)
✔ L. lactis lactis (P29)
✔ L. brevis (P33)
✔ W. cibaria (P36)
Atingiu 106
CFU.mL-1
e foi capaz de
reduzir o pH do MRS para 3,85
Atingiram concentração
mínima de
103
UFC.mL-1
na dieta

45
Tabela 2 – Atividade antagonista (outros patógenos)

46
Tabela 2 – Atividade antagonista (outros patógenos)

47
Tabela 3 – variação de pH
Incorporation of different lactic acid bacteria in the commercial diet and evaluation
of hydrogen ion dissociation (pH) in MRS media at 35º C for 48 h.

48
Colonização do trato intestinal
 Suplementação com W. cibaria
✔ População de bactérias ácido láticas (em MRS):
 Peixes suplementados: 3.72 × 104
CFU g−1
 Peixes não suplementados: 10¹ CFU g−1
✔ Pode permanecer viável no intestino de peixes suplementados
✔ Reduziu a carga de Streptococcus cultivada seletivamente em ágar KF
✔ Peixes suplementados apresentaram concentração de 10² UFC g-1
;
tratamento controle apresentou 104
UFC g-1

49
Tabela 4 – Diferentes gêneros de bactérias:
suplementação de probióticos na dieta
Treatments
Total
heterotrophic
Lactic acid
bacteria
Pseudomonas
spp.
Enterococcus
spp.
Unsupplemented fish 6.58 ± 1.13 a
0.60 ± 1.04 a
5.63 ± 1.95 a
3.38 ± 0.45 a
Supplemented fish 5.71 ± 0.14 a
3.72 ± 0.98 b
4.76 ± 0.72 a
2.27 ± 0.07 b
Different genera of bacteria expressed in bacterial concentration on the log scale of CFU
per gram of hybrid surubim (Pseudoplatystoma reticulatum female × P. corruscans male)
intestine supplemented and unsupplemented with Weissella cibaria (P36) in the diet. The
values of bacterial concentration are expressed in CFUs per gram of intestine
(log (x + 1) CFU g −1
).

50
Análise hematológica
 A contagem de células vermelhas foi aumentada significativamente
em peixes suplementados com W. cibaria (p < 0.05)
✔ Os outros parâmetros hematológicos não diferiram significativamente

51
 A cepa de W. cibaria foi
confirmada em análise
molecular e mantida na coleção
Multidisciplinar do Centro para
Pesquisa da UNICAMP

53
Discussão dos resultados
 Estudo avaliou bactérias com potencial probiótico
✔ 41 cepas foram isoladas do intestino dos peixes investigados
 7 cepas demontraram zonas de inibiçção > 8 mm contra
patógenos

54
 Outras pesquisas isolaram bactérias com potencial probiótico:
✔ Huys et al. (2001) and Fjellheim et al. (2010): 120 e 500 cepas do
bacalhau do Atlantico (Gadus morhua) e linguado (Scophthalmus
maximus), repectivamente.
✔ Caipang et al. (2010) avaliaram antagonismo in vitro de bactérias
probióticas contra patógenos comuns no bacalhau do atlântico
 Descobriram diferenças na capacidade de inibição entre essas cepas

55
 Outras pesquisas isolaram bactérias com potencial probiótico:
✔ Pan et al. (2008):
 Antagonismo in vitro de Clostridium butyricum CB2c,
 Habilidade para aderir às celulas intestinais e inibir o crescimento de A.
hydrophila and V. anguillarum.
✔ Jatobá et al. (2008) isolaram L. plantarum de tilápia
✔ Vazquez et al. (2005) isolaram Lactobacillus sp. Da truta arco-íris
(Oncorhynchus mykiss).

56
 Ação da Weissella cibaria
✔ Foi capaz de reduzir o pH do MRS para 3,85.
✔ O modo como reduziu o pH intestinal in vivo e in vitro
permanece desconhecido
 Esse resultado confirma a possibilidade de produzir ácidos
orgânicos e peróxido de hidrogênio para inibição de bactéiras
Gram-positivas

57
 Além da capacidade inibitória: Colonização do trato
intestinal¹
✔ Devem tolerar ácidos da bile e aderir ao epitélio intestinal²
✔ Nesta pesquisa, W. cibaria atingiu valores de 3,7 × 104
CFU g−1
no
intestino e diminuiu pouco quando analisado na dieta
1 - Verschuere et al., 2000
2 - Joborn et al., 1997; Nikoskelainen et al., 2001

58
 Comparação do grau de colonização com outros estudos:
✔ Vendrell et al. (2008) contaram 106
CFU g−1
de probióticos na dieta
✔ Jatobá et al. (2008): L. plantarum trabalhando com tilápias
 Trato digestivo da Tilápia do Nilo: 106
CFU mL−1
 Na dieta: 108
CFU mL −1
 Em contraste ao reportado por Jatobá et al. (2008), W. cibaria não
provocou redução na concentração de Pseudomonas, mas um
decréscimo na concentração de Enterococcus spp.

59
Elevada concentração de probióticos no trato intestinal
Aumento na contagem de glóbulos vermelhos
 Também foi observado em outros trabalhos
Contagem de glóbulos vermelhos:
 Melhora suprimento de oxigênio aos tecidos¹ o que poderia
explicar a oferta circulatória mais eficiente em peixes
suplementados
1 - De Pedro et al., 2005

60
Probióticos devem ser seguros
 Lactobacilus são usados como probióticos com segurança em
produtos alimentares¹
 Nikoskelainen et al., 2003 reportaram melhoras na imunidade
graças ao L. rhamnosus JCM 1136.
✔ Esse resultado indica que suplementação probiótica pode ase uma
bioterapia efetica ou método profilático em aquicultura
1 - Nikoskelainen et al., 2001

61
Outros efeitos dos probióticos
 Lactobacilos são bons
probióticos, pois:
✔ Controlam o aparecimento de
furúnculos¹
✔ Inibem o crescimento de
bactéiras patogênicas
 1 - Perez-Sanchez et al. (2011)
 Entretanto, mais estudos podem
ser necessários para investigar o
uso de aditivos que alterem a
microbiota intestinal do
hospedeiro aumentando a
concentração de bactérias
probióticas na dieta
 (Yousefian and Amiri, 2009).

63
5. Conclusões
Esse estudo definiu a eficiência de
bactérias probióticas isoladas do
intestino de surubins híbridos e mostrou
W. cibaria como uma bactéira promissora
para uso em cultivo de pintado, cachara
e seus híbridos

Isolamento de bactéria probiótica do surubim híbrido para melhoria de parâmetros hematológicos

Recomendados

Recomendados

Mais conteúdo relacionado

Mais procurados

Mais procurados (20)

Semelhante a Isolamento de bactéria probiótica do surubim híbrido para melhoria de parâmetros hematológicos

Semelhante a Isolamento de bactéria probiótica do surubim híbrido para melhoria de parâmetros hematológicos (20)

Isolamento de bactéria probiótica do surubim híbrido para melhoria de parâmetros hematológicos